Name: MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in Medicago truncatula Wortelknolletjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer MALDI-massa spectrometrische imaging voor metabolietonderzoek in Medicago truncatula wortelknolletjes. Deze methode detecteert endogene metabolieten en biedt inzicht in plantaardige biologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Jean-Michel Ane erkennen in de afdeling Agronomy op UW-Madison voor het verstrekken van Medicago truncatula monsters. Dit werk werd mede ondersteund door de financiering van de National Science Foundation (NSF) subsidie ​​CHE-0957784, de Universiteit van Wisconsin Graduate School en de Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) en Romnes Faculteit Research Fellowship-programma (LL). EG erkent een NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).

1. Instrumentatie <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Gebruik een massaspectrometer uitgerust met een MALDI bron voor de analyse van kleine moleculen (zie tabel van Materialen / Equipment). Voer acquisities in positieve of negatieve ionen-modus, afhankelijk van de te bepalen analyten. Geef een massabereik plaats en laat 500 laserschoten / vlek bij 50 um intervallen in zowel de x en y dimensies op het oppervlak van het monster ionen beelden te genereren. De raster breedte en het aantal laserschoten kan worden aangepast aan hogere ruimtelijke resolutie en maximale signaalintensiteit respectievelijk te verkrijgen. Gebruik DHB matrix pieken of interne standaarden toegepast voor de dia of direct naar het weefsel om de massaspectra kalibreren. </li><li> Hoge resolutie LC-MS. (Zie tabel van Materialen / Equipment) Ren monsterextracten met LC-MS met behulp van omgekeerde fase (RP) LC met een C-18 kolom, of normale fase (NP) met een kolom HILIC afhankelijk van de te bepalen analyten. Gebruik mobiele fasen engradiënten in voorkomend geval voor het specifieke type monster. Voer acquisities in positieve of negatieve ion modus afhankelijk van het type monster. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding <ol><li> Snijd de wortel knobbel van de plant, waardoor er 3-4 mm van de wortel die aan de knobbel. </li><li> Onmiddellijk na sectie tang om het weefsel te plaatsen in een cryostaat kop en bedek met gelatine (100 mg / ml in gedeïoniseerd water). Het is essentieel om het weefsel vast te zitten aan de bodem van de beker zonder luchtbellen. </li><li> Flash bevriezen het weefsel door het plaatsen van de beker in een droogijs / ethanol bad totdat de gelatine verhardt en ondoorzichtig. WINKEL monsters bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Haal monsters uit de -80 ° C vriezer, snijd het plastic cryostaat beker en trim overtollige gelatine. Monteer de ingebed weefsel aan de cryostaat boorkop met een dubbeltje kleine hoeveelheid van optimale snijtemperatuur (oktober) media, terwijl niet latende oktober raken het weefsel. Plaats in cryostaatvak totdat het oktober stolt. </li><li> Laat de boorkop en gelatine in evenwicht in de cryostaat doos (ingesteld op -20 of -25 ° C) gedurende ongeveer 15 minuten. </li><li> Gebruik de cryostaat (zie Tabel Materiaal / Apparatuur) naar weefselsectie ongeveer de dikte van een cel (8-20 micrometer afhankelijk van het weefseltype) en dooi zet elk segment op de ITO bekleed glas door verwarming de achterkant (niet-ITO -gecoate zijde) van een ITO-gecoate glasplaatje op de rug van je hand. Plaats de ITO-gecoate zijde van de verwarmde glijbaan nabij het bevroren weefsel slice en laat het schijfje te plakken op de dia. Het plaatsen van de onderdelen dicht bij elkaar op de dia zal een betere afstemming te bieden tijdens MSI. </li></ol> 3. Matrix Application <ol><li> Airbrush Toepassing van MALDI Matrix <ol><li> Alle airbrush procedures moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. </li><li> De airbrush oplossing container en het mondstuk (zie tabel van materialen / apparatuur) met methanol grondig te reinigen envul de container met DHB matrix oplossing (150 mg / ml in 50% TFA methanol/0.1% v / v). </li><li> Houd de airbrush ongeveer 35 cm van het monster en 10-15 lagen matrix passen op het oppervlak van de schuif met een duur van 10 seconden spray en 30 seconden droogtijd tussen elke laag. </li><li> Nogmaals grondig reinigen van de airbrush met methanol als u klaar bent om te voorkomen dat verstopping van de matrix oplossing. </li></ol></li><li> Automatische Sproeier Toepassing van MALDI Matrix <ol><li> Volg de start-up instructies van de fabrikant van de automatische sproeisysteem. </li><li> Voor MSI metabolieten in wortelknolletjes met 40 mg / ml (in 50% TFA methanol/0.1% v / v) DHB als matrix, de temperatuur tot ~ 80 ° C, snelheid tot 1250 mm / min, stroomsnelheid 50 pl / min en aantal passages tot 24. Voor de beste dekking, is het raadzaam om het mondstuk 90 ° en / of compensatie van de nozzle 1,5 mm tussen elke pas draaien. Start spuit methode. Als side opmerking, de specifieke sproeisysteem hier gebruikt verwarmt de nozzle voor snellere verdamping van het oplosmiddel. Als het oplosmiddel verdampt, de concentratie van de matrix snel toe. De op het monster met de airbrush en de automatische spuit matrix hebben vergelijkbare concentraties. </li><li> Volg de shut-down instructies van de fabrikant van de automatische sproeisysteem. </li></ol></li><li> Sublimatie Toepassing van MALDI Matrix <ol><li> Weeg 300 mg DHB in de bodem van de sublimatie kamer (zie tabel van Materialen / Equipment). </li><li> Plak het glaasje aan de koude vinger (bovenste gedeelte van de sublimatie kamer) met het weefsel secties naar beneden met dubbelzijdig, geleidende tape. Bedek de hele achterkant van de dia met de dubbelzijdige tape, zelfs voor geleidbaarheid, produceren zelfs matrix depositie. </li><li> Klem de bovenste en onderste helften van de sublimatie kamer samen met de C-klem. Sluit de vacuüm en add ijs en koud water naar boven reservoir. </li><li> Plaats sublimatie kamer in een verwarmings-mantel die op kamertemperatuur is. </li><li> Schakel de vacuümpomp. Wacht 15 minuten en zet de verwarming mantel. De verwarming mantel moet bereiken 120 ° C in de loop van 10 minuten. </li><li> Na 10 minuten, zet het vuur uit, sluit het ventiel bij vacuüm (zodat de binnenkant van de kamer blijft onder vacuüm) en schakel de vacuümpomp. </li><li> Laat de kamer op kamertemperatuur te komen, open de kraan het loslaten van de onderdruk en verwijder het monster. De grootte van de sublimatie kamer wordt de hoeveelheid matrix gesublimeerde het glasplaatje bepalen. De grotere sublimatie kamers (de grootte van een bekerglas van 400 ml) wordt ongeveer 300 mg DHB gebruiken terwijl de kleinere kamers (de grootte van een bekerglas van 150 ml) gebruikt ongeveer 100 mg DHB en vereist snijden het glaasje zodat past in de kamer. </li></ol></li></ol> 4. Image Acquisition <ol> &lt;li&gt; Mark een + patroon op elke hoek van het monster met een WiteOut correctievloeistof pen om te worden gebruikt als &quot;les points&quot;. Plaats het glaasje in de MALDI dia adapterplaat en neem een ​​optisch beeld van het monster met behulp van een scanner. </li><li> Maak een beeldacquisitie bestand met de software van het instrument bedrijf met een raster stapgrootte van 50 urn en een laser diameter gelijk aan of kleiner dan de raster stapgrootte. Op dit instrument, de minimale laserinstelling geeft een laser diameter van ongeveer 10 urn en kleine laser instelling heeft een 40-50 urn diameter. </li><li> Plaats het optische beeld in de software en zet de plaat met het optische beeld. </li><li> Kalibreer het instrument voor het begin van de overname het gebruik van gemeenschappelijke matrix cluster ionen, interne standaarden, of een kalibratie-mix. </li><li> Geef de weefselgebieden worden geanalyseerd MSI, waaronder een plek van pure matrix op de dia te gebruiken als &quot;blanco&quot;. </li><li> Begin acinquisitie. </li></ol> 5. Afbeelding Generation <ol><li> Open de beeldbestanden in de handel verkrijgbare software die door de verkoper en haal de ionen beelden. Andere open-source software is beschikbaar voor MSI gegevensverwerking 19. </li></ol> 6. Metaboliet Identificatie <ol><li> Selecteer een bepaald m / z van belangstelling van de massa-spectrum met behulp van de vendor specifieke software (zie tabel van Materialen / Equipment). Een analyt kan worden onderscheiden van een matrix ion wanneer een analyt piek is gekozen uit het massaspectrum en ionen beelden gegenereerd specifiek gelokaliseerd in de weefselsectie. </li><li> Genereer een lijst van analyten en MS / MS experimenten uit te voeren. Zie tabel 1 en tabel 2 in Representatieve resultaten voor het monster lijsten van analyten. </li><li> Voer gerichte LC-MS analyse op een hoge resolutie massaspectrometer (of hoge resolutie MALDI-MS indien beschikbaar) om nauwkeurige verkrijgenmassa metingen van de analyten en ook LC-MS/MS van de doelwitanalyten voeren om karakteristieke fragmentatiepatronen verkrijgen. </li><li> Voer databank zoeken naar mogelijke identificaties voor de doelgerichte analyten te bepalen. Voorbeelden van metaboliet databases zijn: Metlin, Farmacotherapeutisch Kompas, PubChem, KEGG, en HMDB. </li><li> Om het vermoedelijke identificatie van nauwkeurige massa zoeken in gegevensbanken bevestigen overeen met de MS / MS van het beoogde analyten MS / MS spectra van normen literatuur en / of fragmentatie predictie software. </li></ol>

<ol><li>Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Intact+Tissue+Sections%3A+Moving+beyond+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope.</a> J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).</li>
<li>van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+review+of+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A concise review of mass spectrometry imaging.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).</li>
<li>Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+drugs+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75, 130-145 (2013).</li>
<li>Ye, H., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+better+health%3A+mass+spectrometry+imaging+for+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics.</a> Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).</li>
<li>Wei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+Its+Practical+Value+in+Pharmaceutical+Industry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry.</a> Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Serum+Metabolomics-Based+Diagnostic+Approach+to+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidem.+Biomar%22%5BJournal%5D)">A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).</li>
<li>West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+human+developmental+toxicity+of+pharmaceuticals+using+human+embryonic+stem+cells+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).</li>
<li>Spegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+metabolomics+analysis+of+beta-cells+implicates+the+pentose+phosphate+pathway+in+the+control+of+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release.</a> Biochem. J. 450, 595-605 (2013).</li>
<li>Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+neuroAIDS%3A+The+widening+scope+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics.</a> J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).</li>
<li>Prell, J., Poole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+of+rhizobia+in+legume+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes of rhizobia in legume nodules.</a> Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).</li>
<li>Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+analysis+of+neuropeptides+by+MALDI+FTMS+in-cell+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation.</a> Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li>
<li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+%28APSGFLGMRamide%2C+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide%29+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li>
<li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+signaling+peptides+in+single+mammalian+cells+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).</li>
<li>Neupert, S., Predel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+single+identified+neurons+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li>
<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li>
<li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li>
<li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption%2Fionization-imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li>
<li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids%3A+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1%2C5-diaminonapthalene+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3%2C4%2C5-Tetrakis%283%27%2C4%27-dihydroxylphenyl%29thiophene%3A+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li>
<li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li>
<li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+sponge%3A+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li>
<li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+%28m%2Fz+616%29+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom.+Soc.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li>
<li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li>
<li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omniSpect%3A+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Zoals hierboven besproken, monstervoorbereiding is de meest kritische stap in de MSI workflow. Verankering van weefsel ongelijk veroorzaken snijden moeilijk of onmogelijk in sommige gevallen. Het gedeelte grootte en voldoende equilibratietijd zijn cruciaal voor het behoud van het weefsel integriteit en het vermijden van vouwen en scheuren. Selectie van matrix en applicatietechniek een rol bij het bepalen van de typen analyten te detecteren, de ruimtelijke resolutie en reproduceerbaarheid van de resultaten spelen. Met ee...

De groeiende gebied van metabolomics heeft veel belangrijke biologische toepassingen, waaronder de ontdekking van biomarkers, het ontcijferen van metabole routes in planten en andere biologische systemen, en toxicologie profilering 4,6-10. Een belangrijke technische uitdaging bij het ​​bestuderen van biologische systemen is om metabolomic trajecten studeren zonder verstoring van hen 11. MALDI-MSI zorgt voor een directe analyse van intacte weefsels die gevoelige detectie van analyten in staat stelt in enkele organen 12,13 en zelfs enkele cellen 14,15. Monstervoorbereiding is een cruciale stap in het produceren van reproduceerbare en betrouwbare massaspectrale beelden. De kwaliteit van de beelden is sterk afhankelijk van factoren zoals weefsel inbeddingsmedium, plakdikte, MALDI matrix en matrix applicatietechniek. Voor grafische toepassingen, ideaal snijdikte is de breedte van een cel (8-20 micrometer afhankelijk van het monster). MALDI vereist depositie van een organische, crystallinee matrix bevatten, typisch een zwak zuur, de monster analyt verdamping en ionisatie helpen. 16 verschillende matrices verschillende signaalintensiteiten, storende ionen en ionisatie-efficiëntie van verschillende klassen van verbindingen. De matrix applicatietechniek speelt ook een rol in de kwaliteit van massaspectrum afbeeldingen en verschillende technieken geschikt zijn voor verschillende soorten analyten. Drie matrix applicatie methoden worden in dit protocol: airbrush, automatische sproeier, en sublimatie. Airbrush matrix toepassing is op grote schaal gebruikt in de MALDI beeldvorming. Het voordeel van airbrush matrix toepassing is dat het relatief gemakkelijk. De kwaliteit van de matrix airbrush toepassing sterk afhankelijk van de vaardigheid van de gebruiker en de neiging minder reproduceerbaar en verspreiding van analyten, in het bijzonder kleine moleculen 17 veroorzaken. Automatische spuit systemen hebben vergelijkbare mechanica aan matrix toepassing airbrush, maar have ontwikkeld om de variabiliteit gezien met handmatige airbrush toepassing verwijderen, waardoor de nevel beter reproduceerbaar. Deze methode kan soms meer tijd in beslag dan de traditionele airbrush matrix toepassing zijn. Zowel handmatige airbrush en automatische spuit systemen zijn solvent-gebaseerde matrix applicatie methoden. Sublimatie is een droge matrix applicatie techniek die meer en meer populair wordt steeds voor de massa spectrale beeldvorming van metabolieten en kleine moleculen, want het vermindert analyt diffusie, maar het het oplosmiddel nodig ontbeert te halen en te observeren grotere massa verbindingen 18. Zelfverzekerd identificatie van metabolieten vereist meestal accurate massa metingen om vermeende identificaties gevolgd door tandem massa (MS / MS)-experimenten voor validatie, met MS / MS-spectra worden vergeleken met de normen, literatuur, of theoretische spectra te verkrijgen. In dit protocol hoge resolutie (massa oplossend vermogen van 60.000 bij m / z 400), vloeistofchromatografie (LC)-MS wordt gekoppeld aan MALDI-MSI zowel ruimtelijke informatie en zelfverzekerd identificaties van endogene metabolieten te krijgen, met behulp van Medicago truncatula wortels en wortelknollen als het biologische systeem. MS / MS experimenten kunnen direct worden uitgevoerd op het weefsel met MALDI-MSI of weefselextracten met LC-MS en gebruikt voor de validatie van metaboliet identificaties. Dit protocol biedt een eenvoudige methode om endogene metabolieten in M. kaart truncatula, die aangepast en toegepast op MSI van kleine moleculen in verschillende soorten weefsel en biologische systemen.

<table><tbody><tr><td>Gelatin</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>verwarmen om op te lossen</td></tr><tr><td>Cryostat- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&nbsp;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (breedte x lengte x dikte)</td></tr><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>Airbrush</td><td>Paasche Airbrush Company</td><td>TG-100D</td><td>gekoppeld met 75 ml stalen container</td></tr><tr><td>Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX.TMSP.H021-U</td><td>Specifieke opstart- en afsluitinstructies worden gegeven wanneer het instrument is geïnstalleerd</td></tr><tr><td>Sublimation apparatus&nbsp;</td><td>Chemglass Life Science</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>Uiteindelijke druk = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>Een voorbeeld van "venderspecifieke software"</td></tr><tr><td>MALDI LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>Hoge resolutie MALDI-instrument voor nauwkeurige massametingen</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Hoge resolutie LC-MS-instrument voor nauwkeurige massametingen</td></tr></tbody></table>

maldi-massaspectrometrische imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em&gt; medicago truncatula</em&gt; wortelknolletjes

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

De meeste technieken die worden gebruikt om kleine moleculen te bestuderen, zoals farmaceutische middelen of endogene metabolieten, weefselextracten gebruiken die de homogenisering van het weefsel van belang dat mogelijke veranderingen in de metabole routes onderzochte 1 veroorzaken vereisen. Massaspectrometrie imaging (MSI) is een krachtige analytische tool die ruimtelijke informatie van analyten kan bieden binnen intact plakjes biologisch weefsel monsters 1-5. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om verschillende soorten verbindingen zoals eiwitten, peptiden, lipiden en kleine moleculen zoals endogene metabolieten bestuderen. Met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI)-MSI, kan ruimtelijke verdelingen van verschillende metabolieten gelijktijdig worden gedetecteerd. Hierin wordt een werkwijze speciaal ontwikkeld voor het uitvoeren irrelevante metabolomics MSI experimenten peulvrucht wortels en wortelknollen voorgelegd die inzicht in de biologische processen die kunnen onthullen. Dehier gepresenteerde methode toont een typische MSI workflow, van monstervoorbereiding tot beeldopname, en richt zich op de matrix toepassing stap demonstreren verschillende matrix applicatie technieken die nuttig zijn voor het opsporen van kleine moleculen zijn. Zodra de MS afbeeldingen worden gegenereerd, wordt de analyse en identificatie van metabolieten plaats besproken en aangetoond. De standaardwerkstroom hier gepresenteerde kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende weefseltypen, moleculaire species en instrumentatie.

Een experimentele overzicht van MSI is weergegeven in figuur 1. Helemaal aan het begin van het experiment, monstervoorbereiding is een cruciale stap. Knobbeltjes worden bijgesneden uit de plant met wortel en ingebed in gelatine. Het weefsel moet plat tegen de cryostaat kop worden ingedrukt, zonder bubbels, terwijl het wordt ingevroren, dit zal zorgen voor eenvoudiger en juiste uitlijning van het weefsel terwijl het wordt doorgesneden. Wanneer het weefsel wordt gesneden, is het belangrijk dat het weefsel...

Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.

MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wortelknolletjes

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van betrouwbare, multi-massaspectrometrische imaging van kleine moleculen in plantenwortelweefsel. Dit wordt bereikt door eerst de weefselmonsters op de juiste grootte voor te bereiden. De tweede stap is het optimaliseren en aanbrengen van de MALDI-matrix op het weefselmonster.Vervolgens wordt het monster onderworpen aan Maldi, MSI en worden spectra verzameld over het weefsel. De laatste stap is de gegevensverwerking waarin biologisch belangrijke analyten kunnen worden geïdentificeerd. Uiteindelijk wordt MALDI MSI gebruikt om endogene metabolieten in wortelknolletjes van vlinderbloemigen te detecteren.Deze methode kan inzicht bieden in de metabolieten die aanwezig zijn in wortelweefsel van planten, maar kan ook worden toegepast bij de studie van kleine moleculen en weefsels uit andere modelsystemen, waaronder zoogdieren, kreeftachtigen, insecten en meer. Haal eerst de eerder bereide plantweefselmonsters uit de vriezer van -80 °C. Snijd vervolgens de plastic cryostaatcup weg en trim het overtollige gelatine; monteer het ingebedde weefsel op een cryostaathouder met een kleine hoeveelheid (ter grootte van een muntstuk) optimal cutting temperature of OCT-medium, waarbij u erop let dat het OCT het weefsel niet raakt.Plaats de cryostaat-houder in een cryostaatbox die is ingesteld op -20 °C totdat het OCT is gestold. Nadat de houder en de gelatine ongeveer 15 minuten hebben kunnen equilibreren in de cryostaatbox, wordt de cryostaat gebruikt om het weefsel in coupes te snijden met een dikte van ongeveer één cel. Monteer vervolgens elke coupes met de duim op de vooraf gekoelde glazen objectglas door de onbehandelde zijde van het objectglas op de handrug te verwarmen.Plaats vervolgens de met ITO gecoate zijde van het warme objectglas nabij de bevroren weefselsnede en laat de snede aan het objectglas hechten voor het aanbrengen van de MALDI-matrix met een airbrush. Reinig de vloeistofcontainer en de spuitmond van de airbrush grondig met methanol en vul de vloeistofcontainer met DHB-matrixoplossing. Houd de airbrush op ongeveer 35 centimeter afstand van het monster en breng 10 tot 15 lagen matrix aan op het oppervlak van het objectglas, met een spuitduur van 10 seconden en een droogtijd van 30 seconden tussen elke laag.Reinig de airbrush na gebruik grondig met methanol om verstoppingen te voorkomen. Vanwege de matrixoplossing is het belangrijk op te merken dat, hoewel airbrushes gemakkelijker verkrijgbaar zijn, automatische matrixspuitsystemen vaak een gelijkmatigere en reproduceerbare matrixdekking opleveren voor de sublimatie-applicatie van de MALDI-matrix. Weeg 300 mg DHB af in de bodem van de sublimatiekamer. Bevestig de glazen objectglas aan de cold finger met dubbelzijdige geleidende tape, waarbij de weefselcoupes naar beneden zijn gericht. Snijd het objectglas bij indien dit te groot is.Klem de boven- en onderhelft van de sublimatiekamer aan elkaar met de C-klem. Plaats de sublimatiekamer vervolgens in een verwarmingsmantel die op kamertemperatuur is. Sluit het vacuüm aan en voeg ijs in koud water toe aan het bovenste reservoir.Zodra de vacuümpomp is ingeschakeld, dient u 15 minuten te wachten en vervolgens de verwarmingsmantel aan te zetten. Schakel na 10 minuten de verwarming uit, sluit het vacuümkraantje en schakel de vacuümpomp uit. Zodra de kamer is afgekoeld tot kamertemperatuur, opent u het kraantje om de vacuümdruk te ontlasten en verwijdert u het monster.Mark vervolgens op elke hoek van het monster een plusteken met de correctievloeistofpen om te gebruiken als referentiepunten. Plaats het objectglas in de Maldi-adapterplaat voor objectglazen en maak een optische afbeelding van het monster met een scanner. Controleer de afbeelding op de computer en roteer de foto zodat deze correct op het scherm verschijnt.Het monster wordt in dezelfde oriëntatie in het instrument geplaatst. Stel een bestand voor beeldacquisitie in met de software van de instrumentfabrikant, met een rasterstapgrootte van 50 micrometers en een laserdiameter die gelijk aan of kleiner is dan de rasterstapgrootte. Laad op dit punt het optische beeld in de software en lijn de plaat uit met het optische beeld.Nadat het instrument is gekalibreerd, specificeert u de weefselgebieden die met MSI geanalyseerd moeten worden, inclusief een spot met pure matrix op de slide om als blanco te dienen. Begin daarna met de acquisitie. Open na de gegevensacquisitie het imaging-bestand in de door de leverancier verstrekte software en extraheer de ionenbeelden door een specifieke massa-ladingsverhouding van belang te selecteren uit het massespectrum. Maak met behulp van de software een lijst van specifieke analyten van belang voor verdere identificatie.Voer een databasezoekopdracht op basis van nauwkeurige massa uit om vermoedelijke identificaties voor de doelanalyten vast te stellen. Om te bevestigen dat de vermoedelijke identificaties uit de databasezoekopdracht op basis van nauwkeurige massa overeenkomen met de ms MS van de doelanalyten met msms-spectra van standaarden, literatuur en/of fragmentatievoorspellingssoftware, wordt hier een optische afbeelding getoond van een doorsnede van een wortelknolletje van een mego Tula.Hier is een voorbeeld van een optische afbeelding van de matrixdekking en kristalgrootte bij gebruik van een airbrush-automatische spuit en sublimatie. De airbrush-applicatiemethode genereert zowel grote als kleine kristallen. Terwijl de automatische spuitmethode kleine kristallen van gelijke grootte produceert, zorgt sublimatie voor één gelijkmatige matrixlaag.Conventionele matrices zoals DHB produceren veel ionen in het lagere massabereik onder de 500 Dalton. Deze matrixionen kunnen de detectie van metabolieten in dit bereik verstoren. Hier worden de MS-spectra van alleen DHB-matrix getoond in vergelijking met wortelknolweefsel bedekt met DHB-matrix.Matrixpieken kunnen met behulp van de MS-beelden worden onderscheiden van echte metabolieten. Wanneer er op een piek wordt geklikt, wordt het ionenbeeld geëxtraheerd en weergegeven als overlay op het optische beeld. Pieken die beelden genereren met een duidelijke lokalisatie in het weefsel en niet aanwezig zijn in het gebied waar alleen de matrix is afgebeeld, worden beschouwd als metabolieten. Hier worden verschillende representatieve ionenbeelden getoond van metabolieten die in wortelknolweefsel zijn aangetroffen.Hoewel voorbeelden van MS-beelden die overeenkomen met matrix-gerelateerde pieken hier zijn afgebeeld, laat dit beeld een duidelijke lokalisatie in het weefsel van de wortelknolletjes zien en een gebrek aan signaal in het gebied waar alleen de matrix werd afgebeeld. Dit signaal vertoont weinig lokalisatie en is aanwezig over het gehele weefsel. Het signaal is ook zichtbaar in het gebied waar alleen de matrix werd afgebeeld.Het uiteindelijke doel van niet-gerichte metabolomics-experimenten is het detecteren en bepalen van biologisch belangrijke analyten en het identificeren van de verbindingen van belang. Een voorbeeld van een van de metabolieten die met MSI en LCMS zijn gedetecteerd, wordt hier getoond. Deze metaboliet werd geïdentificeerd als heem op basis van de nauwkeurige massa die is verzameld met hoge resolutie LCMS en het MSM MSS-spectrum.Deze MS/MS-gegevens werden vergeleken met de MS/MS-spectra die eerder zijn gepubliceerd door Shima en Sato; de twee MS/MS-spectra komen met elkaar overeen. Daarom is de identiteit van de massa-ladingsverhouding van 616,2 met zekerheid toegewezen aan heem, op basis van het doorzoeken van een nauwkeurige massadatabase en het vergelijken van de MS/MS-gegevens met MS/MS-gegevens uit de literatuur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe MALDI-massaspectrometrische imaging wordt gebruikt om de ruimtelijke distributie van biologisch relevante metabolieten te detecteren en in kaart te brengen met een methode die kan worden toegepast op de studie van kleine moleculen in diverse weefseltypen en modelsystemen.

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Een massaspectrometrie-beeldvormingsbron (MSI) die op atmosferische druk werkte, werd ontwikkeld door mid-infrarood laserdesorbentie te koppelen met post-ionisatie door middel van elektrospray. Exogeen ijsmatrix werd gebruikt als de energieabsorberende matrix om resonante desorbentie van weefselgerelateerd materiaal te vergemakkelijken. Dit manuscript biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI van een neonatale muis in zijn geheel.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Spectrometrie van de massa van de spray blad is een directe analyse van de chemische techniek die minimaliseert de bereiding van de monsters en elimineert chromatografie, rekening houdend met de snelle detectie van kleine moleculen uit plantaardige weefsels.

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Deze methode maakt gebruik van massaspectrometrie beeldvorming (MSI) om metabolische processen in S. alba bladeren te begrijpen wanneer blootgesteld aan xenobiotica. De methode maakt de ruimtelijke lokalisatie mogelijk van belangrijke verbindingen en hun voorspelde metabolieten in specifieke, intacte weefsels.

Onderzoek naar xenobiotica metabolisme in Salix alba bladeren via massaspectrometrie imaging

Een protocol om biologisch weefsel te bestuderen bij een hoge ruimtelijke resolutie met behulp van ultra-hoog veld magnetische resonantie microscopie (MRM) met behulp van microcoils wordt gepresenteerd. Stapsgewijze instructies zijn voorzien voor het karakteriseren van de microcoils. Ten slotte wordt optimalisatie van beeldvorming aangetoond op plantenwortels.

MRM Microcoil Performance Kalibratie en gebruik gedemonstreerd op Medicago truncatula Roots op 22 T

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

In deze studie wordt een reeks methoden gepresenteerd om DESI-MSI-monsters van fabrieken voor te bereiden, en een procedure voor DESI-assemblage-installatie, MSI-gegevensverzameling en -verwerking wordt in detail beschreven. Dit protocol kan in verschillende omstandigheden worden toegepast voor het verkrijgen van ruimtelijke metaboloominformatie in planten.

Visualisatie van metabolieten geïdentificeerd in het ruimtelijke metaboloom van de traditionele Chinese geneeskunde met behulp van DESI-MSI

Dit protocol was bedoeld om gedetailleerde richtlijnen te beschrijven voor de voorbereiding van secties van harde zaadmonsters met een laag watergehalte voor MALDI-IMS-analyse, waarbij de oorspronkelijke verdeling en overvloed van analyten behouden blijft en signaal- en ruimtelijke resolutie van hoge kwaliteit wordt geboden.

Bereiding van harde palmzaden voor matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie-beeldvorming massaspectrometrie-analyse

Er is een geavanceerde methode ontwikkeld voor massaspectrometriebeeldvorming (MSI) van hersenorganoïden die het mogelijk maakt om metabolietverdelingen binnen deze modellen in kaart te brengen. Deze technologie biedt inzicht in metabole routes van de hersenen en metabolietsignaturen tijdens de vroege ontwikkeling en bij ziekte, en belooft een beter begrip van de menselijke hersenfunctie.

Moleculaire beeldvorming van organoïden van het menselijk brein met behulp van massaspectrometrie 

Laten we zien hoe harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren...

Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays

Leer MALDI-massa spectrometrische imaging voor metabolietonderzoek in Medicago truncatula wortelknolletjes. Deze methode detecteert endogene metabolieten en biedt inzicht in plantaardige biologische processen.

MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in

Meer video's verkennen