Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging
26 mei 2014
Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de interactie tussen twee eiwitten en levende gekweekte cellen te observeren. Dit wordt bereikt door de cDNA's voor de twee eiwitten van belang sub te klonen in plasmiden die de coatingsequentie voor luciferase of geel fluorescent eiwit bevatten, afgekort YFP, om vectoren te maken voor de expressie van eiwit in zoogdiercellen. Als tweede stap worden de plasmiden getransfecteerd in gekweekte cellen, wat leidt tot de expressie van YFP en luciferase fusie-eiwitten.
Vervolgens wordt luciferase substraat toegevoegd aan de cellen om lichtemissie van de luciferase te initiëren. Resultaten worden verkregen die interactie tussen de twee fusie-eiwitten laten zien op basis van energieoverdracht van LUCIFERASE naar YFP. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals coun precipitatie, is dat het de observatie van eiwit-eiwit interacties in levende cellen mogelijk maakt.
Deze Methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van functionele genoomkunde te beantwoorden door te bepalen of een mutatie die bij een patiënt is gevonden, de eiwit-eiwit interacties beïnvloedt. Het demonstreren van de eerste stap van de procedure zal zijn RAB tric, een promovendus uit mijn laboratorium Om te beginnen de plasmiden creëren zoals beschreven in het tekstprotocol. Schat de concentratie van deze op basis van absorptie bij 260 nanometer.
Bepaal de moleculaire massa van elk plasmide door het aantal basenparen te vermenigvuldigen met 650.Daltons. Gebruik de concentratie en moleculaire massa om de molaire concentratie van elke plasmidevoorbereiding te berekenen. Verdun de plasmide DNA voorbereidingen tot een concentratie van 36 nanomolair.
Dit zullen de werkvoorraden zijn die worden gebruikt om de DNA-mixen voor te bereiden. Voor transfectie. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het opzetten van de DNA-mixen Om succes te garanderen, maken we spreadsheets om de juiste hoeveelheid van elk component vooraf te berekenen, en we besteden veel aandacht.
Bij het opzetten van de DN mixen. Bereid de eerste controle DNA mix voor die 1800 nanogram vulplasmide bevat in een uiteindelijk volume van 20 microliters water. Bereid vervolgens een tweede gecontroleerde DNA mix voor door vijf microliters van de P look control construct voor te bereiden.
Voeg vulplasmide toe om de totale DNA massa naar 1800 nanogram te brengen. Voeg water toe om het uiteindelijke volume naar 20 microliters te brengen. Bereid een derde controle DNA mix voor die vijf microliters van de P look control construct en vijf microliters van de PYFP control construct bevat.
Voeg vulplasmide en water toe zoals eerder. Stel tenslotte een vierde controle DNA mix op die vijf microliters van de positieve controle construct bevat. Voeg opnieuw vulplasmide, vulplasmide en water op dezelfde manier toe.
Bereid vervolgens 3D NA mixen voor om de homodimerisatie van een eiwit van belang x te testen. Voor elke DNA mix, combineer vijf microliters van de relevante P look construct en vijf microliters van de PYFP construct, vulplasmide en water toevoegen. Bereid vervolgens DNA mixen voor om een interactie tussen een paar eiwitten van belang X en Y te testen.Voor elke DNA mix, combineer vijf microliters van de relevante P look construct en vijf microliters van de PYFP construct samen met vulplasmide en water. Verzamel subconfluente hec 2 9 3 cellen uit een 75 vierkante centimeter fles, verdun 10% van de totale cellen in 13 milliliters kweekmedium.
Vervolgens 130 microliters celsuspensie in elke put van een witte heldere bodem 96 well weefselkweekplaat voor het kweken van de cellen gedurende 24 uur. Bereken vervolgens het aantal putten dat getransfecteerd moet worden door het aantal DNA mixen met drie te vermenigvuldigen. Bereid een mastermix voor die 6,3 microliters kamertemperatuur, serumvrij medium en 0,18 microliters transfectie reagens per put bevat, gemengd door te vortexen voordat het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd.
Vervolgens 20 microliters serumvrij medium transfectie reagens mastermix in de vereiste aantal buisjes. Voeg twee microliters van de overeenkomstige DNA mix toe aan elke buis, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Tenslotte, transfecteer drie putten met elk transfectiemix.
Verspreid 6,5 microliters transfectiemix per put voordat de cellen gedurende verdere 36 tot 48 uur worden gekweekt. Om het BRET signaal te meten. Los eerst levend cel luciferase substraat op bij 34 milligram per milliliter in DMSO door te vortexen.
Verdun gereconstitueerd levend cel luciferase substraat bij een tot 1000 in substraatverdunningsmedium, voorverwarm 37 graden Celsius. Laat 50 microliters substraatverdunningsmedium per put vortexen om te mengen. Er kan een neerslag ontstaan, maar dit zal de test niet storen.
Zuig het kweekmedium van de 96 well plaat af. Verspreid 50 microliters verdund levend cel luciferase substraat in elke put na het kweken van de cellen gedurende minimaal twee uur. Verwijder de deksel van de 96 well plaat en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de luminometer. Meet emissie van LUCIFERASE en YFP één put per keer volgens de details in het tekstprotocol, integreer emissiesignalen gedurende 10 seconden.
Leden van de Fox P familie van transcriptionele repressors spelen een rol in de ontwikkeling van de hersenen. Mutaties zijn geïmpliceerd in spraak- en autismespectrumstoornissen. FOX P twee is bekend om homodimeri te vormen om de Brett test te valideren voor de detectie van Fox.
P twee Homodimeri cellen werden getransfecteerd met constructen voor expressie van luciferase als donor of YFP als acceptor gefuseerd met ofwel Fox P twee of een nucleair lokalisatie signaal. De nucleair gerichte LUCIFERASE en YFP eiwitten dienen als negatieve controles als een positieve controle voor detectie van een Brett. Signaal cellen werden ook getransfecteerd met een construct voor expressie van een luciferase YFP fusie-eiwit.
De toename van het BRET signaal laat zien dat de Bret test effectief is in het detecteren van Fox P twee homodimeri. Fluorescerende microscoopbeelden van cellen getransfecteerd met YFP gefuseerd met een nucleair lokalisatie signaal, of met YFP gefuseerd met FOX P twee worden hier getoond.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het observeren van de interactie tussen twee eiwitten in levende gecultiveerde cellen met behulp van Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET). Deze techniek maakt real-time monitoring van eiwitinteracties en beoordeling van de effecten van pathogene mutaties mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Proteïne-interacties
- Live-cell imaging
Achtergrond
- Eiwitinteracties zijn cruciaal voor cellulaire processen.
- Traditionele methoden voor het bestuderen van deze interacties kennen beperkingen.
- BRET biedt een nieuwe benadering om interacties in realtime te observeren.
- Deze techniek kan ook helpen bij het beoordelen van de impact van mutaties op de eiwitfunctie.
Doel van de studie
- Om de interactie tussen twee specifieke eiwitten waar te nemen.
- Om BRET te gebruiken voor real-time monitoring in levende cellen.
- Om de effecten van potentieel pathogene mutaties op deze interacties te evalueren.
Gebruikte methoden
- Subklonering van cDNA's voor de eiwitten in plasmiden.
- Transfectie van plasmiden in gecultiveerde zoogdiercellen.
- Expressie van YFP- en luciferase-fusie-eiwitten.
- Toevoeging van luciferase-substraat om lichtemissie te initiëren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van YFP- en luciferase-fusie-eiwitten in levende cellen.
- Observatie van energietransfer die wijst op eiwit-eiwitinteracties.
- Demonstratie van de voordelen van BRET ten opzichte van traditionele methoden.
- Inzichten in de effecten van mutaties op eiwitinteracties.
Conclusies
- BRET is een effectieve methode voor het bestuderen van eiwitinteracties in levende cellen.
- Deze techniek kan waardevolle inzichten bieden in de dynamiek van eiwitinteracties.
- Het heeft potentiële toepassingen bij het begrijpen van de impact van mutaties op cellulaire processen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) maakt real-time, kwantitatieve monitoring van proteïne-proteïne-interacties in levende cellen mogelijk, wat een gevoelige en fysiologisch relevante readout biedt voor targetvalidatie. Deze benadering ondersteunt vroege ontdekking door zwakke, transiënte of omgevingsafhankelijke interacties te bevestigen die door endpoint-assays over het hoofd kunnen worden gezien, waardoor het voorspellend vertrouwen in therapeutische hypothesen wordt verbeterd. Door interactiestoornissen veroorzaakt door pathogene mutaties te detecteren, helpt BRET bij mechanistische risicoreductie en informeert het go/no-go-beslissingen bij de preklinische selectie van targets.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt veronderstelde eiwit-eiwitinteracties die zijn geïdentificeerd via gist twee-hybride-systemen of massaspectrometrie in een levende celcontext.
- Wetenschappelijke waarde: Detecteert zwakke of kortstondige interacties die gevoelig zijn voor de natuurlijke biochemische omgeving, waardoor de betrouwbaarheid van het doelwit toeneemt.
- Operationele waarde: Vereist minimale actieve tijd en weinig reagentia, wat high-throughput onderzoek van interactienetwerken mogelijk maakt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve BRET-ratio's die de interactiesterkte en nabijheid weerspiegelen, wat bijdraagt aan de standaardisatie van de assay.
- Operationele waarde: Compatibel met 96-well plaatformaten en luminometer-uitlezingen, wat de schaalbaarheid voor het screenen van verbindingen of mutanten vergemakkelijkt.
- Operationele waarde: Maakt kinetische beoordeling van interactiedynamiek over tijd mogelijk, waardoor tijdopgeloste screeningformaten kunnen worden toegepast.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke Waarde: Evalueert de impact van patiëntafgeleide mutaties op eiwitinteracties, waarbij genetische bevindingen worden gekoppeld aan functionele consequenties.
- Wetenschappelijke Waarde: Brengt interactiedomeinen in kaart en beoordeelt de effecten van posttranslationele modificaties, ter ondersteuning van structuur-functieanalyse.
- Operationele Waarde: Maakt gebruik van hetzelfde levende-cel-systeem in zowel de ontdekkingsfase als de preklinische fasen, waardoor translationele continuïteit wordt gewaarborgd.
Pipeline- & workflowintegratie
BRET past binnen het continuüm van ontdekking, van de beoordeling van target engagement tot lead-optimalisatie, waarbij interactiegegevens de prioritering en mechanistische follow-up informeren.
- Ontdekkingsbiologie: Test therapeutische hypothesen door te valideren of eiwitten van belang interageren in levende cellen, waardoor fout-positieven uit kunstmatige systemen worden verminderd.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten op die vergelijking mogelijk maken van wildtype- en gemuteerde eiwitten of de effecten van verbindingen op de interactiesterkte.
- Analytiek: Produceert onderscheidende donor- en acceptorsignalen die ratio-metrisch kunnen worden bepaald om te normaliseren voor expressievariabiliteit, wat de betrouwbaarheid van de gegevens verbetert.
- Translationeel onderzoek: Beoordeelt of ziekte-geassocieerde mutaties belangrijke interacties verstoren, wat functionele validatie biedt voor genetische targets.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Creëert een herbruikbaar platform voor interactiescreening over meerdere targets, waardoor de inspanning voor de herontwikkeling van assays wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door interacties te detecteren in een fysiologisch relevante live-cell omgeving.
- Operationele waarde: Standardiseert de interactiemeting door consistente toevoeging van het substraat en integratie van de luminometer, waardoor de variabiliteit tussen wells wordt verminderd.
- Strategische waarde: Ondersteunt vroege go/no-go beslissingen door interactiehypotheses te bevestigen of te weerleggen vóór significante investeringen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de robuustheid van de interactie en mutatiesensitiviteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering om luciferase- en YFP-fusieconstructen te genereren.
- Afhankelijk van toegang tot een luminometer voor sequentiële meting van donor- en acceptoremissie.
- Maakt optimalisatie van expressieverhoudingen noodzakelijk om verzadiging van de donor of acceptor te voorkomen, wat BRET-signalen kan vervormen.
- Vereist controles voor aspecifieke energietransfer, inclusief niet-interagerende fusieparen en mutanten met een gewijzigde subcellulaire lokalisatie.
- Beperkt door de noodzaak van een geringe afstand (<10 nm) tussen donor en acceptor, waardoor mogelijk niet alle biologisch relevante interacties worden geregistreerd.
