Name: Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer een snelle methode voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van Nile Red fluorescentiekleuring. Deze techniek biedt een efficiënt alternatief voor traditionele kwantificeringsmethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada bedanken voor het verlenen van financiële steun voor dit project.

1. Isolatie van droge biomassa van de algen worden gebruikt als standaarden voor fluorescentie Readings <ol><li> Verwijder een monster volume van de groeiende algencultuur dat ten minste 200 mg van droge biomassa zal bieden, 400-600 mg de voorkeur. </li><li> Centrifugeer monster bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g. Verwijder het supernatant en was de pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer volgens dezelfde pH als groeimedium. </li><li> Herhaal stap 1.2 voor een totaal van 3 stappen wassen. </li><li> Resuspendeer de pellet in gedeïoniseerd water en breng over naar een vooraf gewogen weeg schaal. Laten drogen bij 50 ° C gedurende 48 uur. OPMERKING: Drogen onder vacuüm zal droogtijd afnemen en drogen van de cultuur bij temperaturen boven 50 ° C kan resuspensie bemoeilijken. </li><li> WINKEL algenculturen gedroogd bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Gravimetrische Kwantificering van neutrale lipiden door hexaanextractie (Aangepast van Bligh en Dyer 4) <ol><li> Meet ongeveer 50 mg van droge biomassa van de algen in een weeg schaal. OPMERKING: Missen variërend 40-80 mg kan zonder verlies van reproduceerbaarheid worden gebruikt. </li><li> Breng de biomassa naar een mortier pre-gewassen met hexaan. Indien nodig, was het wegen schaal met een kleine hoeveelheid (1 ml) hexaan Met een Pasteur-pipet om de biomassa volledig overdragen aan de mortel. OPMERKING: Hexaan is een zeer vluchtige en giftige stof. Het moet in de zuurkast met de juiste beschermende kleding worden behandeld. </li><li> Maal de biomassa van de algen gedurende 5 minuten met behulp van een stamper. Begin met zachte slijpen en langzaam de intensiteit verhoogt. Maal de biomassa in een fijne en gladde pasta in de periode van 5 minuten. Als overmaat hexaan wordt gebruikt bij het overbrengen van de biomassa naar de mortel, het het beste om te wachten op de hexaan verdampen voordat slijpen. </li><li> Voeg enkele ml hexaan om de mortel en meng de verkregen suspensie met de stamper totdat het wordt gehomogeniseerd. Zorg ervoor dat alle celbrokstukken gehandeld op de muren van de morteer zijn gratis klopte en opgehangen in de vloeistof. </li><li> Breng de hexaan-celmassa mengsel in een centrifugebuis. OPMERKING: De centrifugebuis moet ofwel glas of een geschikt polymeer verenigbaar met hexaan zoals Teflon zijn. </li><li> Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 totdat alle biomassa is overgedragen aan de centrifugebuis (3-5x). </li><li> Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 20 min bij 10.000 x g. </li><li> Pipet de bovenstaande vloeistof voorzichtig in een vooraf gewogen metalen wegen schotel. Bewaren in de zuurkast. </li><li> Voer een 2e hexaan extractie door toevoeging van 3 ml hexaan om de pellet en vortexen krachtig gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal de stappen 2.7 en 2.8. Voer indien nodig de monsters gedurende 30 minuten in de centrifuge tijdens de tweede extractie, zodat alle celdebrie volledig afwikkelt. Bepaal de massa van olie gravimetrisch gewonnen na hexaan volledig is verdampt. </li></ol> 3. Fluorometrische Kwantificering van neutrale lipiden gebruik Nile Red (zo VERSLAted door de la Hoz Siegler et al.. 11) OPMERKING: alleen 10 gl van een algen suspensie bij 5 g / L is nodig voor de fluorescentie lezen. Algemeen isolatie van droge biomassa algen van 1.5 ml kweekbouillon is meer dan voldoende. Ook kan de lichtsterkte van de lamp in de spectrofotometer na verloop van tijd. Aanbevolen normen omvatten in elk experiment zodat variaties in het instrument geen onnodige fout aan de metingen. <ol><li> Bereid een Nile Red oplossing met een concentratie van 10 ug / ml opgelost in alcohol reagenskwaliteit ethanol. Bewaar deze oplossing in het donker bij 4 ° C. </li><li> Bereid een 30% (v / v) ethanol oplossing in gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid alle algen monsters op hetzelfde biomassaconcentratie (5 g / L wordt aanbevolen) en op dezelfde wijze als de normen die in de meting. Doe dit door een opschorting vooraf gedroogde monsters in de juiste hoeveelheidfosfaatbuffer (0,6 g / L kaliumfosfaat dibasisch, 1,4 g / l monobasisch kaliumfosfaat), en aanpassingen van de concentratie van een groeiende algen kweek tot 5 g / L met fosfaatbuffer na het meten van de troebelheid. OPMERKING: metingen uitgevoerd op levende algenculturen zullen vaak groter foutenbronnen bij deze afhankelijk van de precisie van de troebelheid kalibratiecurve. Resuspenderen gedroogde monsters kan het gebruik van een homogenisator volledig dispergeren van de biomassa nodig. </li><li> Voor elk monster, meng 80 pl van 30% ethanol-oplossing, 10 ul van de Nijl Rode oplossing en 10 gl algen suspensie in een enkel putje van een 96-wells plaat. Om goed rekening te houden met de variabiliteit van de fluorescentie meting uitvoeren 5 herhalingen van elk monster. </li><li> Voer een twee punts kalibratie curve met normen eerder bereid om rekening te houden voor de dag-tot-dag variaties in het instrument en voorbereiding. Bereid de normen voor fluorescentie meting met behulp van de same procedure als de monsters. OPMERKING: algemeen twee punten voldoende herkalibratie van het instrument kunnen drie punten worden uitgevoerd om lineariteit verifiëren. </li><li> Voer de fluorescentiemetingen in een multi-put plaatlezer spectrofotometer. De volgende condities werden gevonden om de meest consistente resultaten 11 opleveren: <ol><li> Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec. </li><li> Incubeer bij 40 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec. </li><li> Record fluorescentie, excitatie bij 530 nm, emissie bij 604 nm. </li></ol></li><li> Zet de fluorescentiemetingen olie-inhoud met de resultaten van de interne standaarden. </li></ol> 4. Fluorescentiemicroscopie Techniek OPMERKING: De kleuringsprotocol beschreven in hoofdstuk 3 is ontworpen voor kwantitatieve analyse, maar het kan ook nuttig zijn om visuele representaties van vlek-gebaseerde technieken voor educatieve en illustratieve pu zijnrposes. Om beelden van het monster fluorescentie een produceren vereist een optische microscoop met traditionele transmissie en extra epifluorescentie verlichting bronnen. Excitatie en emissie licht filters in de 530 nm (groen) en 604 nm (rood) bereik, respectievelijk, die nodig zijn voor de Nijl Rode vlek evenals een microscoop gemonteerde camera met bijbehorende software. De in deze studie aangetoond (figuur 1) beelden werden verkregen met behulp van een helder veld microscoop uitgerust met een camera en Monochrome naar RGB converter unit. De procedure voor het produceren van Nile Red fluorescentiebeelden gebruik van deze tools wordt hieronder beschreven: <ol><li> Bereid een cultuur monster met de Nijl Rode vlek volgens paragraaf 3 van het protocol. OPMERKING: een monster in de 5 g / L concentratiegebied produceert slides van adequate celdichtheid zonder overbevolking. </li><li> Na het voltooien van stap 3.6 van de kleuringsprotocol Bereid een microscoopglaasje van het verwerkte monster volgens standaard laboratoriumprocedures. </li><li> Te beginnen met de microscoop in de transmissie mode, laadt de bereide dia in de microscoop, en zoek de cellen op de gewenste vergroting (de afbeeldingen in dit artikel zijn overgenomen met de 100X doelstelling). </li><li> Zodra gericht, schakelt de microscoop van transmissie naar epifluorescentie verlichting mode. De lichtbron moet nu rechtstreeks uit de objectieflens (dit kan visueel worden bevestigd door het observeren van de ruimte tussen de slede en de objectieflens). </li><li> Steek een groene excitatiefilter in de lichtbron en een rode emissie filter in de observatie lichtpad; de fluorescentie van de gekleurde cellen moet nu direct zichtbaar door het oculair. </li><li> Schakel de microscoop observatie-modus van het oculair van de camera gemonteerd en gebruik viewing software om een ​​beeld van de fluorescerende cellen vast te leggen. Afhankelijk van de gevoeligheid van de camera, kan het monster niet in eerste instantie weergegeven in het voorbeeldvenster (dwz het scherm zalzwart zijn); om dit te verhelpen, past u de belichtingstijd en de winst van de camera tot een niveau waarop de cellen zichtbaar zijn. Specifieke instellingen zal variëren met instrumenten, apparatuur en celtypes. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive%2C+non-linear+model+based+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Hara, A., Radin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+of+tissues+with+a+low-toxicity+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent.</a> Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+methods+used+for+microalgal+lipid-content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Procedia%22%5BJournal%5D)">Review of methods used for microalgal lipid-content analysis.</a> Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li>
<li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Res%22%5BJournal%5D)">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li>
<li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate%2C+Crypthecodinium+cohnii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li>
<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De algen in de standaardcurve moet dezelfde soort gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden als die gemeten. Significante veranderingen in de samenstelling van het materiaal, teelttechniek en kleuringsprotocol kan invloed hebben op de intensiteit van de fluorescentie lezen. Hexaanextractie (in de punten 1 en 2 beschreven) werd gebruikt om de neutrale vetgehalte van de monsters die in de standaard curve te bepalen. Voor nauwkeurige fluorescentie-intensiteit metingen moeten alle monsters worden geanalyseerd op ...

Vanwege hun vermogen om lipiden organen opslaan onder bepaalde stresscondities algen hebben veel aandacht in de afgelopen jaren als potentiële duurzame brandstofbron 1,2. Neutrale lipiden kan goed zijn voor meer dan 60% van de cel drooggewicht onder geschikte groeiomstandigheden 3. Toch is de industrie niet over een eenvoudige, schone, snelle en betrouwbare gestandaardiseerd protocol om vetgehalte van algen cellen te kwantificeren om goed te monitoren bioproces prestaties, culturen te analyseren, en het scherm voor nieuwe stammen. De Bligh-Dyer gravimetrische methode ontwikkelde zo&#39;n 50 jaar geleden blijft een van de meest voorkomende technieken die vandaag de dag 4,5 gebruikt. Hoewel deze procedure is eenvoudig, betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren, is tijdrovend, vereist grote monstervolumes, en maakt gebruik van toxische oplosmiddelen. Het is niet praktisch voor het analyseren van vele samples van een fermentatie run of screening voor nieuwe olie-rijke stammen. Andere methoden bEEN-ontwikkeld, maar meestal vereisen geavanceerde apparatuur en zijn niet gestandaardiseerd 6. Een alternatief dat heeft vergaard een grote belangstelling is de Nijl Rode vlek. Nile Red, een kleurstof die fluoresceert bij voorkeur in niet-polaire omgevingen is gebruikt om lipide organen in verschillende organismen, waaronder nematoden 7, gist 8, 9 bacteriën en algen 10-19 identificeren of kwantificeren. Initial technieken met Nile Red waren meestal kwalitatieve of semi-kwantitatieve, het combineren van de vlek met single-cuvette spectrofotometrie of flowcytometrie. Bovendien zijn sommige soorten algen zoals groene algen dikke celputjes die meestal ondoorlaatbaar kleurstof, die het bereik van de techniek 10 beperkt. Recente verbeteringen aan de Nijl Rode kleuringsmethode gemeld dat de aanvankelijke tekortkomingen van het protocol 10,11 omzeilen. Kleuring van de cellen in de aanwezigheid van een carrier oplosmiddel zoals DMSO 10 of ethanol 10,11 linearizes de relatie tussen oliegehalte en absorptie, waardoor betrouwbare kwantitatieve metingen. Het oplosmiddel helpt permeabilize het celmembraan, zodat de Nijl Rode moleculen kan passeren. Daarnaast is het opnemen van een spectrofotometer met micro-plaat leesmogelijkheid zorgt voor een hoge doorvoersnelheid protocollen geschikt voor kwantitatieve analyse. In dit artikel gedetailleerd een eenvoudige werkwijze voor het meten oliegehalte van algen cellen door kleuring culturen Nijl Rood in aanwezigheid van ethanol, een mild oplosmiddel. Om zo goed mogelijk rekening te houden achtergrondruis in de metingen wordt een standaardcurve correleren fluorescentie intensiteit oliegehalte ontwikkeld met algen bekende oliesamenstelling. De methode is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen 10,11. Door een 96-putjes spectrofotometer, men in staat om dezelfde hoeveelheid te analyseren in een uur that zou dagen duren om te controleren door gravimetrische methoden. Bovendien, door het kalibreren met behulp van representatieve monsters van de gewenste algensoorten deze methode levert relatief nauwkeurige metingen die direct interpreteerbaar. Er bestaan ​​vele protocollen, waarin de methoden van kleuring algen met Nile Red geoptimaliseerd voor verschillende stammen en toepassingen; het protocol hier gepresenteerde werd oorspronkelijk ontwikkeld door de la Hoz Siegler et al.. 11 voor Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus en Scenedesmus obliquus, hoewel het waarschijnlijk is geschikt voor veel meer soorten en klassen. Het is ontworpen met de specifieke toepassing van het toezicht bioprocess prestaties en het werkt even goed voor eerder gedroogde monsters en natte monsters van een groeiende cultuur.

<table><tbody><tr><td>Drooggewicht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml wegwerppipetten</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipetbulb</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Nalgene Teflon centrifugebuizen</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Teflon nodig voor hexaan</td></tr><tr><td>Weegschalen (polypropyleen)</td><td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuizen</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Droogoven (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Opslagbuisjes</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Gravimetrische kwantificering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porseleinen vijzel (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Porseleinen stamper (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Centrifugatiebuizen (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Kan ook glazen buizen gebruiken</td></tr><tr><td>Pasteur glazen pipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium weegschalen</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexaans</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometrische kwantificering van oliegehalte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie multi-well plate reader</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie leessoftware</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR 96 welp plate met ronde bodem</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (alcohol reagent grade)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvorming van fluorescerende cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA2 (of gelijkwaardig) microscoop</td><td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopdekglasjes</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvorming software</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algen worden beschouwd als uitstekende kandidaten voor hernieuwbare energiebronnen, door de natuurlijke lipiden opslag mogelijkheden. Krachtige systemen van algen fermentatieprocessen en screening op nieuwe olierijke stammen vereist een snelle en betrouwbare protocol voor de bepaling van intracellulaire lipidegehalte. Huidige praktijken grotendeels aangewezen op gravimetrische methoden om het oliegehalte te bepalen, technieken ontwikkeld decennia geleden die tijdrovend zijn en grote steekproef volumes vereisen. In dit document, Nile Red, een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de aanwezigheid van lipide organen in tal van soorten organismen identificeren, wordt opgenomen in een eenvoudige, snelle en betrouwbare protocol voor de neutrale lipiden van Auxenochlorella protothecoides, een groene alg. De methode maakt gebruik van ethanol, een relatief mild oplosmiddel, aan de celmembraan voor kleuring en 96 goed micro-plaat monstercapaciteit in fluorescentie-intensiteit metingen toenemen doorlaatbaar. Het ontwerp ised met de specifieke toepassing van het toezicht bioproces prestaties. Eerder gedroogde monsters en levende monsters van een groeiende kweek kan worden gebruikt in de test.

Representatieve algen cellen gekleurd met Nile Red kleurstof in figuur 1. Delen A en B van figuur 1 tonen afbeeldingen van A. protothecoides gegroeid dan stikstof, wat leidt tot zeer lage intracellulaire lipide accumulatie. In de delen C en D, de monsters van A. protothecoides onder stikstof beperking gekweekt getoond. Onder transmissieverlichting, kan de lipide organen van de cel worden gevisualiseerd...

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gehalte aan neutrale lipiden in algencellen te meten met behulp van de fluorescerende kleurstof Nile red. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te suspenderen in een ethanoloplossing om de celwand en het celmembraan permeabel te maken. In een tweede stap wordt de fluorescerende kleurstof Nile red toegevoegd, die de cellen binnendringt en zich ophoopt in de apolaire regio's van de cel, waaronder de neutrale lipidendruppels.Vervolgens worden de monsters blootgesteld aan een excitatielichtbron van 530 nanometer, waardoor het Nile Red dat is geabsorbeerd in de neutrale lipidenlichaampjes fluoresceert bij 604 nanometer. Resultaten worden op grote schaal verkregen door de individuele tests uit te voeren in een micro-wellplaat en een spectrofotometer te gebruiken voor snelle fluorescentiemetingen. De metingen tonen een lineair verband tussen het neutrale lipidegehalte van de algencellen en de intensiteit van de fluorescentiemeting.De omzetting van fluorescentiemetingen naar oliegehalte kan worden gerealiseerd met een kalibratielijn opgesteld met cellen van een bekende oliesamenstelling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, zoals de gravimetrische Blydiresmethode, is dat het een snelle bepaling van het neutrale lipidengehalte mogelijk maakt met materialen die in de meeste laboratoria beschikbaar zijn. Deze methode biedt directe feedback over de prestaties van het bioproces tijdens de algenkweek.Bovendien is de hoge doorvoercapaciteit van de 96-wells plaatlezer ideaal voor screeningsstudies en factoriële experimenten. Hoewel deze techniek is geoptimaliseerd voor chlorella en s Desus, kan deze eenvoudig worden aangepast voor de analyse van andere algensoorten. Om te beginnen neemt u een monstervolume uit de groeiende algenkweek dat ten minste 200 mg droge biomassa oplevert.400 tot 600 milligram is bij voorkeur. Centrifugeer het monster bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 10 000 ×g, verwijder het supernatant en was het pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer die is geformuleerd op dezelfde pH als het groeimedium.Herhaal dit proces voor in totaal drie wasstappen. Resuspendeer het pellet in gedeïoniseerd water en breng dit over naar een vooraf gewogen weegschaaltje. Laat het monster 48 uur drogen bij 50 °C.De gedroogde algenculturen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard voor toekomstig gebruik. Weeg ongeveer 50 milligram gedroogde algensbiomassa af in een weegschaaltje. Breng de biomassa over naar een vijzel die indien nodig vooraf met hexaan is gewassen; spoel het weegschaaltje met een kleine hoeveelheid hexaan met behulp van een pipette om de biomassa volledig naar de vijzel over te brengen.Maal vervolgens de algale biomassa vijf minuten lang met een stamper. Begin met voorzichtig malen en voer de intensiteit geleidelijk op. Maal de biomassa tot een fijne en gladde pasta.Voeg gedurende de periode van vijf minuten enkele milliliters hexaan toe aan de vijzel en meng het resulterende mengsel met de stamper tot het homogeen is. Zorg ervoor dat alle celresten die aan de wanden van de vijzel kleven worden losgeslagen en in de vloeistof worden gesuspendeerd. Breng vervolgens het mengsel van hexaan en celmassa over in een compatibele centrifugebuis.Herhaal dit drie tot vijf keer totdat alle biomassa naar de centrifugebuis is overgebracht. Centrifugeer het monster bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten bij 10 000 ×g. Pipetteer na centrifugatie voorzichtig het supernatant in een vooraf gewogen metalen weegschaaltje, dat in de zuurkast kan worden bewaard.Voer een tweede hexaanextractie uit door drie milliliter hexaan aan het pellet toe te voegen en krachtig te vortexen. Herhaal de centrifugatie en de overdracht van het supernatant gedurende één minuut. Bepaal de massa van de geëxtraheerde olie gravimetrisch nadat het hexaan volledig is verdampt.Bereid voor fluorometrische kwantificatie alle algmonsters voor bij dezelfde biomassaconcentratie en op dezelfde wijze als de standaarden die bij de meting worden gebruikt. Doe dit door vooraf gedroogde monsters te suspenderen in de juiste hoeveelheid fosfaatbuffer. Gebruik indien nodig een homogenisator om de resuspensie van gedroogde algencellen te vergemakkelijken.Meng voor elk monster 80 µL van een bereide 30% ethanoloplossing, 10 µL van een bereide Nile red-oplossing en 10 µL algensuspensie in een enkele put van een 96-wells plaat. Voer om correct rekening te houden met de variabiliteit van de fluorescentiemeting vijf herhalingen van elk monster uit. Voer vervolgens een tweepuntskalibratiecurve uit met eerder bereide standaarden.Om rekening te houden met dagelijkse variaties in het instrument en de voorbereiding voor het uitvoeren van de fluorescentiemetingen in een multi-well plate reader spectrophotometer, stelt u de parameters in op schudden bij 1 200 RPM en een orbitale beweging van drie millimeter gedurende 30 seconden, gevolgd door incubatie bij 40 °C gedurende 10 minuten. Schud vervolgens opnieuw bij 1 200 RPM met een orbitale beweging van drie millimeter gedurende 30 seconden, en registreer de fluorescentie met excitatie bij 530 nm en emissie bij 604 nm. Start als laatste stap de run.Zet de fluorescentiemetingen om in oliegehalte met behulp van de resultaten van de interne standaarden om fluorescentiemicroscopie uit te voeren. Gebruik het monster dat is voorbereid met de Nile-rood kleuring om een microscooppreparaat van het procesmonster te maken volgens de standaard laboratoriumprocedures. Plaats het voorbereide preparaat in de microscoop, beginnend in transmissiemodus, en lokaliseer de cellen bij de gewenste vergroting.Zodra de focus is ingesteld, schakelt u de microscoop over van transmissie- naar epifluorescentie-verlichtingsmodus. De lichtbron komt nu rechtstreeks uit de objectieflens, wat visueel bevestigd kan worden door de ruimte tussen het preparaat en de objectieflens te observeren. Plaats een groen excitatiefilter in de lichtbron en een rood emissiefilter in het observatielichtpad.De fluorescentie van de gekleurde cellen zou nu rechtstreeks door het oculair zichtbaar moeten zijn. Schakel de observatiemodus van de microscoop over van het oculair naar de gemonteerde camera en gebruik visualisatiesoftware om een afbeelding van de fluorescerende cellen vast te leggen. Specifieke instellingen variëren per instrument, apparatuur en celtype.Representatieve algencellen gekleurd met Nile Red-kleurstof worden getoond; beelden van een cultuur gekweekt met een overschot aan stikstof leiden tot een zeer lage intracellulaire lipideaccumulatie, wat in contrast staat tot monsters van OID's gekweekt onder stikstofbeperking. Onder transmissie-illuminatie kunnen de lipide lichamen van de cellen bij zorgvuldige inspectie worden gevisualiseerd, waarbij ze verschijnen als glanzende circulaire structuren en het grootste deel van het celvolume vormen. De hier getoonde cellen bevatten slechts 5% olie op basis van droggewicht en bevatten geen significante hoeveelheden lipide lichamen wanneer ze onder de juiste lichtomstandigheden worden getoond.De verschillen in deze monsters worden vergroot. De oliearme cellen verschijnen als fluorescerende ringen met donkere lichamen, terwijl de olierijke cellen een helder oranje-rode gloei vertonen op de plaatsen waar lipidlichamen zijn geaccumuleerd. Nile red fluoresceert bij verschillende golflengten afhankelijk van de aanwezigheid van neutrale lipiden, fosfolipiden gelokaliseerd op de celwand en apolaire cellulaire eiwitten, reden waarom de oliearme cellen verschijnen als fluorescerende ringen met donkere lichamen.Deze non-specificiteit is ook de oorzaak van het achtergrondniveau van fluorescentie tijdens de spectrophotometer-metingen van de neutrale lipiden; onder de geoptimaliseerde condities van de assay zijn kalibratiecurves met R-kwadraatwaarden groter dan 0,980 gemakkelijk haalbaar. De relatie tussen het oliegehalte van de cellen en de fluorescentie wordt non-lineair als de cellen worden gekleurd in een oplossing zonder een dragend oplosmiddel zoals ethanol. De hier gepresenteerde gegevens hebben een R-kwadraat van 0,395 en zijn verkregen door het protocol uit te voeren in een 0% ethanol-oplossing.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 15 tot 20 minuten worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het cruciaal om ervoor te zorgen dat alle monsters worden voorbereid bij dezelfde biomassa-concentratie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de neutrale lipidegehalte van lgal-cellen kunt meten met behulp van zowel traditionele hexaanextractieprotocollen als de eenvoudigere NAL-rood fluorescentiekleuringsprocedure.

a-simple-rapid-protocol-for-measuring-neutral-lipids-algal-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

This video demonstrates a protocol for detecting and quantifying neutral lipids in algal cells by staining them with Nile red dye.

Nile Red Staining: A Technique to Detect and Quantify Intracellular Neutral Lipids in Algae

Werkwijze voor de bepaling van vetzuren en samenstelling microalgen gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering en kwantificatie en identificatie van vetzuren met gaschromatografie wordt beschreven. Een tripentadecanoin interne standaard wordt gebruikt ter compensatie van eventuele verliezen bij de winning en onvolledige omestering.

Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen

Het gebruik van fluoroforen voor in vivo beeldvorming kan sterk beperkt worden door opsonisatie, snelle klaring, lage detectiegevoeligheid en cytotoxische effecten op de gastheer. Encapsulatie van fluoroforen in liposomen door filmhydratie en extrusie leidt tot fluorescentiekwelving en bescherming, wat in vivo beeldvorming met hoge detectiegevoeligheid mogelijk maakt.

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Hier beschrijven we een protocol om te verkrijgen van de lipide druppel index (LD index) om te bestuderen van de dynamiek van triacylglycerolen in cellen gekweekt in high-throughput experimenten. De LD index bepaling is een gemakkelijke en betrouwbare methode die gebruikmaakt van BODIPY 493/503. Deze test hoeft niet dispendious lipide extractie of microscopie analyse.

Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen Ustilago Maydis

Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Dit protocol presenteert een fluorescentiebeeldvormingsmethode die een klasse van pH-gevoelige lipidefluoroforen gebruikt om het transport van lipidemembranen tijdens celexocytose en de endocytosecyclus te volgen.

Membraan Lipid Turnover meten met de pH-gevoelige fluorescerende lipide analoog ND6

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze autofluorescentiebeeldvorming en evaluatie van fycobiliproteïneveranderingen in rode algen op basis van spectrale analyse. Dit is een labelvrije en niet-destructieve methode om cellulaire aanpassing aan extreme habitats te evalueren, wanneer alleen schaars materiaal beschikbaar is en cellen langzaam of helemaal niet groeien onder laboratoriumomstandigheden.

Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren

Leer een snelle methode voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van Nile Red fluorescentiekleuring. Deze techniek biedt een efficiënt alternatief voor traditionele kwantificeringsmethoden.

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Meer video's verkennen