Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie
30 mei 2014
Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.
Het algemene doel van het volgende experiment is om het neutrale lipidegehalte van algencellen te meten met behulp van Nile rood fluorescerende kleurstof. Dit wordt bereikt door de cellen eerst op te schorsen in een ethanoloplossing om de celwand en het celmembraan doorlaatbaar te maken. Als tweede stap wordt Nile rood fluorescerende kleurstof toegevoegd, die de cellen binnendringt en zich ophoopt in de niet-polaire gebieden van de cel, inclusief de neutrale lipidedruppels.
Vervolgens worden de monsters blootgesteld aan een excitatielichtbron van 530 nanometer, waardoor het Nile rood dat in de neutrale lipidedruppels is geabsorbeerd, fluoreert bij 604 nanometer. Resultaten worden verkregen op een massaschaal door de individuele tests uit te voeren in een microwellen multipl en met behulp van een spectrofotometer om snelle fluorescentiemetingen te produceren. De metingen tonen een lineaire relatie tussen het neutrale lipidegehalte van de algencellen en de intensiteit van de fluorescentiemeting.
Conversie van fluorescentiemetingen naar oliegehalte kan worden bereikt met een kalibratiecurve bereid met cellen van bekende oliesamenstelling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, zoals de Bly dire gravimetrische methode, is dat het een snelle bepaling van het neutrale lipidegehalte mogelijk maakt met behulp van materialen die beschikbaar zijn in de meeste laboratoria. Deze methode biedt onmiddellijke feedback op de prestaties van het bioproces tijdens de kweek van algen.
Ook is de hoge doorvoer die wordt toegestaan door de 96 Well plate reader ideaal voor screeningsstudies en factoriële experimenten. Hoewel deze techniek is geoptimaliseerd voor chlorella en s Desus, kan deze gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere algensoorten.Okay. Om te beginnen, verwijder een monstervolume uit de groeiende algencultuur dat ten minste 200 milligram droge biomassa zal opleveren.
400 tot 600 milligram is preferabel. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius bij 10.000 keer. G, gooi het supernatant weg en was de pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer geformuleerd op dezelfde pH als het groeimedium.
Herhaal dit proces in totaal drie keer voor de wasstappen. Resuspendeer de pellet in gedeïoniseerd water en breng over naar een vooraf gewogen weegschaal. Laat het monster gedurende 48 uur drogen bij 50 graden Celsius.
De gedroogde algenculturen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard voor toekomstig gebruik. Meet ongeveer 50 milligram droge algenbiomassa in een wei-schaal. Breng de biomassa over naar een mortel, vooraf gewassen met hexaan indien nodig, was de wei-schaal met een kleine hoeveelheid hexaan met behulp van een pastpipet om de biomassa volledig naar de mortel over te brengen.
Maal vervolgens de algenbiomassa gedurende vijf minuten met behulp van een stamper. Begin met zacht malen en verhoog geleidelijk de intensiteit. Maal de biomassa tot een fijne en gladde pasta.
Voeg gedurende de vijf minuten een paar milliliter hexaan toe aan de mortel en meng de resulterende suspensie met de stamper tot het homogeen is. Zorg ervoor dat alle celafval dat aan de wanden van de mortel hecht, loskomt en wordt opgehangen in de vloeistof. Breng vervolgens de hexaancelmassa-mengsel over in een compatibele centrifugeerbuis.
Herhaal drie tot vijf keer totdat alle biomassa naar de centrifugeerbuis is overgebracht. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius bij 10.000 keer. G.Na centrifugatie pipetteer voorzichtig het supernatant in een vooraf gewogen metalen schaal, die in de afzuigkap kan worden bewaard.
Voer een tweede hexaanextractie uit door drie milliliter hexaan toe te voegen aan de pellet en krachtig te vortexen. Herhaal de centrifugatie en overdracht van het supernatant gedurende één minuut. Bepaal de massa van het geëxtraheerde olie gravimetrisch nadat het hexaan volledig is verdampt.
Voor fluorometrische kwantificering bereidt u alle algenmonsters voor op dezelfde biomassaconcentratie en op dezelfde manier als de standaarden die bij de meting worden gebruikt. Doe dit door voorgedroogde monsters op te schorsen in de juiste hoeveelheid fosfaatbuffer. Gebruik indien nodig een homogenisator om de resuspendering van gedroogde algencellen te vergemakkelijken.
Voor elk monster meng 80 microliter van een bereide 30% ethanoloplossing, 10 microliter van een bereide Nile roodoplossing en 10 microliter van een algensuspensie in een enkele put van een 96-wellplaat. Voer vijf replica's van elk monster uit om de variabiliteit van de fluorescentiemeting goed te kunnen verantwoorden. Voer vervolgens een tweede kalibratiecurve met twee punten uit met eerder bereide standaarden.
Om rekening te houden met dagelijkse variaties in het instrument en de voorbereiding om de fluorescentiemetingen uit te voeren in een spectrofotometer met meerdere putjes, stelt u de parameters in om te schudden bij 1.200 RPM en drie millimeter te orbiteren gedurende 30 seconden, gevolgd door incubatie bij 40 graden Celsius gedurende 10 minuten. Schud opnieuw bij 1.200 RPM en drie millimeter gedurende 30 seconden en registreer de fluorescentie met excitatie bij 530 nanometer en emissie bij 604 nanometer. Start vervolgens de run als laatste stap.
Converteer de fluorescentiemetingen naar oliegehalte met behulp van de resultaten van de interne standaarden om fluorescentiemicroscopie uit te voeren. Gebruik het monster dat is bereid met de Nile rood-kleuring om een microscoopglaasje van het procesmonster voor te bereiden volgens standaard laboratoriumprocedures. Begin met de microscoop in transmissiemodus, laad het voorbereide glaasje in de microscoop en lokaliseer de cellen bij de gewenste vergroting.
Eenmaal scherp, schakel de microscoop van transmissie naar epifluorescentie-verlichtingsmodus. De lichtbron moet nu rechtstreeks uit de objectieve lens komen, wat visueel kan worden bevestigd door de ruimte tussen het glaasje en de objectieve lens te observeren. Plaats een groene excitatiefilter in de lichtbron en een rode emissiefilter in de observatielichtbaan.
De fluorescentie van de gekleurde cellen moet nu direct zichtbaar zijn door het oculaire. Schakel de observatiemodus van de microscoop van het oculaire naar de gemonteerde camera en gebruik beeldweergavesoftware om een afbeelding
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van het neutrale lipidengehalte van algencellen met behulp van een Nile Red-kleuringsprocedure. Deze techniek is een tijdefficiënt alternatief voor traditionele methoden voor lipidekwantificatie en is specifiek ontworpen voor het monitoren van de prestaties van bioprocessen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Bioprocessing
Achtergrond
- Neutrale lipiden zijn belangrijk voor diverse biologische processen.
- Traditionele methoden voor lipidquantificatie kunnen tijdrovend zijn.
- Nile Red is een fluorescente kleurstof die selectief neutrale lipiden kleurt.
- Deze methode maakt een snelle bepaling van het lipidegehalte in algcellen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een eenvoudig en efficiënt protocol te bieden voor de kwantificering van lipiden.
- Om de monitoring van de prestaties van algen-bioprocessen te faciliteren.
- Om de effectiviteit van Nile Red-kleuring bij de analyse van lipiden aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Algal cellen worden gesuspendeerd in een ethanoloplossing om de celmembranen te permeabiliseren.
- Nile Red-kleurstof wordt toegevoegd aan de celsuspensie.
- Monsters worden blootgesteld aan excitatielicht bij 530 nm.
- Fluorescentie wordt gemeten bij 604 nm met behulp van een spectrofotometer.
Belangrijkste resultaten
- De fluorescentie-intensiteit correleert lineair met het gehalte aan neutrale lipiden.
- De methode maakt snelle fluorescentiemetingen op grote schaal mogelijk.
- Nile Red hoopt zich effectief op in de apolaire regio's van algencellen.
- Het protocol is geschikt voor het monitoren van de prestaties van bioprocessen.
Conclusies
- De Nile Red-kleuringsmethode is een levensvatig alternatief voor lipidquantificatie.
- Deze techniek verhoogt de efficiëntie van bioprocesmonitoring.
- Verdere studies zouden de toepassing ervan in lipidonderzoek kunnen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Snelle kwantificering van neutrale lipiden in algencellen ondersteunt high-throughput screening naar biobrandstof-relevante stammen en real-time monitoring van fermentatieprocessen. De Nile Red fluorescentie-assay maakt een voorspellende beoordeling van lipide-accumulatie mogelijk, wat vroege go/no-go beslissingen in ontwikkelingspipelines voor stammen faciliteert. Deze methode vermindert de afhankelijkheid van gravimetrische technieken met een lage doorvoersnelheid, waardoor de kapitaalefficiëntie bij de optimalisatie van algenbioprocessen wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar fenotypes van lipide-accumulatie die gekoppeld zijn aan genetische of omgevingsgerelateerde verstoringen in algmodellen.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde read-outs voor functionele validatie van lipidenmetabolisme-paden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het Nile Red-signaal te correleren met het neutrale lipidegehalte via kalibratiecurves.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Maakt gebruik van het 96-well plaatformaat voor schaalbare, reproduceerbare lipidekwantificering over verschillende stammenbibliotheken.
- Standaardisatie: Vereist een consistente biomassaconcentratie en ethanolpermeabilisatie om betrouwbare fluorescentiemetingen te garanderen.
- Doorvoercapaciteit: Faciliteert factoriële experimenten en screeningscampagnes met snelle fluorescentie-uitlezingen middels standaard plaatlezers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevant systeem: Toepasbaar op algenmodellen die worden gebruikt in metabolische engineering voor de productie van hernieuwbare lipiden.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen lipiden-screening in de ontdekkingsfase en downstream procesoptimalisatie voor de ontwikkeling van biobrandstof-grondstoffen.
- Risicogebaseerde vooruitgang: Maakt datagestuurde prioritering van stammen met een hoge lipidenopbrengst mogelijk op basis van kwantitatieve fluorescentiedrempels.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie, ondersteunt hypothesetesten in het lipidemetabolisme en maakt schaalbare screening-workflows mogelijk.
- Discovery Biology: Ondersteunt functionele validatie van genetische targets die de opslag van neutrale lipiden in algencellen beïnvloeden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor screening van verbindingen of stammen met behulp van multi-wellplaten.
- Analyses: Genereert lineaire fluorescentie-lipidecorrelaties waarmee de lipidenaccumulatie tussen verschillende experimentele condities kan worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege gegevens over het lipidenfenotype met procesontwikkeling op preklinische schaal voor algenbioproductie.
- Herbruik binnen de onderneming: Vestigt een herbruikbaar platform voor fluorescentiegebaseerde lipidenkwantificering dat aanpasbaar is aan meerdere algensoorten en groeicondities.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de beoordeling van het lipidenfenotype door directe correlatie met het neutrale lipidengehalte.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via ethanol-permeabilisatie en normalisatie van de gefixeerde biomassa.
- Strategische waarde: Versnelt de cycli voor stamselectie, waardoor de tijd en middelen die worden ingezet in R&D-portefeuilles voor biobrandstoffen worden verminderd.
- Impact op portfolio: Verbetert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door vroege identificatie van lipidenproducenten met een hoge opbrengst mogelijk te maken.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en spectrofotometrie voor de opzet en validatie van de assay.
- Afhankelijk van toegang tot multi-well plate readers met configureerbare excitatie- (530 nm) en emissiefilters (604 nm).
- Maakt standaardisatie van de monstervoorbereiding noodzakelijk, inclusief biomassaconcentratie en ethanol-permeabilisatiestappen.
- Aanpassing aan andere algensoorten kan optimalisatie van de kleur- en wasprotocollen vereisen.
- Praktische beperking: Het fluorescentiesignaal kan achtergrondruis bevatten door Nile Red-binding aan niet-neutrale lipiden, waardoor controles voor specificiteit vereist zijn.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:52
Isolation of Dry Algal Biomass to be Used as Standards for Fluorescence Readings
2:52
Gravimetric Quantification of Neutral Lipids by Hexane Extraction
6:42
Fluorescence Microscopy Technique
8:04
Results: Images and Calibration Curves of A. protothecoides Stained with Nile Red
10:18
Conclusion
4:48
Fluorometric Quantification of Neutral Lipids Using Nile Red
