Isolatie van Kleine Noncoding RNA's uit humaan serum

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van RNA van hoge kwaliteit uit serummonsters, met gebruik van onze geoptimaliseerde versie van het gangbare MRC try reagent RTLS-protocol. Dit wordt bereikt door het serum eerst in een verhouding van één op vijf te verdunnen met nucleasevrij water om de eiwitcontaminatie te verlagen.

De tweede stap is het toevoegen van twee milliliter phase lock-buisjes voor de eerste centrifugatiestap. Dit vangt het merendeel van de verontreinigingen, zoals fenol en eiwitten, op in de organische fase. Vervolgens is de derde en laatste optimalisatiestap een korte centrifugatieronde op 12, 000 g, waarmee eventuele resterende contaminatie uit het RNA-pellet wordt verwijderd voorafgaand aan de ethanolwasbeurten.

De laatste stap is het samenvoegen van twee gemodificeerde RNA-preparaten van dezelfde patiënt als een hogere totale RNA-opbrengst vereist is. Uiteindelijk tonen we aan dat het mogelijk is om het herstel van kleine non-coding RNA's uit een RNA-isolatie uit serum te maximaliseren door gebruik te maken van deze gemodificeerde methode, waarbij serum wordt gesolubiliseerd in nucleasevrij water, een phase lock tube wordt gebruikt om belangrijke verontreinigingen op te vangen en een flash spin wordt geïntroduceerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het standaard triol-RNA-isolatieprotocol, is dat we door eenvoudige aanpassingen de opbrengst van RNA uit serum kunnen maximaliseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat kleine RNA's in lage hoeveelheden in serum voorkomen. De geoptimaliseerde methode en de visualisatie van deze stappen zullen het herstel van deze RNA's verbeteren en beginners leiden naar een succesvolle isolatietip.

Begin met het ontdooien vanHet eerder bereide bevroren serummonster op ijs, breng vervolgens 400 µL van het vers ontdooide serum over in een gelabelde microcentrifugebuis. Verdun daarna het serum met 100 µL RNase-vrij water en voeg 50 µL proteinase K toe met een concentratie van 1 mg/mL. Incubeer vervolgens het verdunde serum 20 minuten lang bij 37 °C om een adequate proteïnedigestie mogelijk te maken, zodat volledige solubilisatie wordt gegarandeerd bij 1,5 mL TRI-reagens RTLS en 100 µL four promo anole.

Keer het homogenaat kortstondig om en pipetteer het herhaaldelijk gedurende vijf seconden. Draag het mengsel vervolgens over naar een gelabelde heavy phase lock-buis van twee milliliter. Centrifugeer het homogenaat 20 minuten bij 12.000 GS bij vier graden Celsius.

Decanteer vervolgens voorzichtig één milliliter van de resulterende waterige oplossing in een nieuwe DNA low bind tube. De organische fase en de interface moeten worden vastgehouden onder de witte gel van de phase lock tube. Voeg daarna vijf microliters glycogeen en 500 microliters 100% isopropanol toe aan de waterige oplossing.

Meng de oplossing door te inverteren en laat deze een nacht incuberen bij -20 °C. Na de nachtelijke incubatie wordt het monster gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 ×g in een centrifuge bij 4 °C. Verwijder vervolgens de heldere supernatant en voer een flash spin uit gedurende twee minuten bij 16.000 ×g in een centrifuge bij 4 °C.

Verwijder met een pipet voorzichtig de heldere oplossing rondom het pellet. Was het pellet vervolgens met één milliliter 70% ethanol en centrifugeer het monster bij 10, 000 GS gedurende 10 minuten. Om het pellet te kunnen zien, kantelt u de buis voor een donkere achtergrond en schenkt u de wasoplossing af.

Herhaal het wassen. Volgende stap. We suspenderen het pellet in 10 µL RNA-vrij water.

Zorg dat het pellet volledig is opgelost door het monster vijf minuten lang te verhitten bij 55 °C. Mix het monster gedurende deze tijd door herhaaldelijk te pipetteren voor een hogere totale RNA-opbrengstpool, bestaande uit twee RNA-preparaten van dezelfde patiënt. Kwantificeer het resuspendeerde RNA met behulp van een UV-spectrofotometer.

Spectrofotometer en beoordeel de RNA-kwaliteit met een 2100 bioanalyzer. Bewaar vervolgens de gepoolde RNA-monsters bij minus 80 graden Celsius voor gebruik in downstream toepassingen. Spectrofotometrische profielen van RNA uit menselijk serum tonen een verbeterde RNA-opbrengst aan door de toevoeging van verschillende stappen aan de traditionele Chomsky-methode.

Een typisch UV-profiel van RNA geïsoleerd uit menselijk serum staat in contrast met profielen waarbij optimalisatiestappen zijn toegepast, waaronder de toevoeging van glycogeen en een extra spin; de combinatie van deze methoden resulteert in een vermindering van contaminanten en een verhoogde totale RNA-opbrengst. De zuiverheid van de RNA-monster werd verder verhoogd door het gebruik van een phase lock gel, die fenol en eiwitten afvangt. Daarnaast heeft het verhogen van het serumvolume een merkbare impact op de RNA-opbrengst.

Er werd een bioanalyzer-trace uitgevoerd om de kwaliteit van het monster verder te analyseren. Een enkele piek bij ongeveer 21 nucleotiden vertegenwoordigt de microRNA-fractie. Array-profilering en qPCR werden vervolgens uitgevoerd volgens de procedure. Dit array-profiel van drie hoofd-halskankers en één normale S toont de expressie van microRNA's, geanalyseerd middels hiërarchische clustering en gepresenteerd als een heatmap waarop de upregulatie en downregulatie van de microRNA's te zien is.

De volgende QPCR-amplificatiecurves werden gegenereerd voor specifieke microRNA's. Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om de ruwe CT-waarden voor het normale serum uit te zetten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek bij een willekeurig aantal patiënten worden uitgevoerd om RNA van hoge kwaliteit te produceren, mits de procedure correct wordt gevolgd. Andere methoden, zoals kwantitatieve PCR of next-generation sequencing, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de ontdekking en validatie van biomarkers.