De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties
27 augustus 2014
Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.
Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische interactie tussen een enkel DNA-bindend eiwit en een DNA-molecuul te observeren. Dit wordt bereikt door twee enkelvoudige molecuultechnieken, dubbele optische pincetten en fluorescentiemicroscopie, te combineren in een op maat gebouwde microscoop. Deze opstelling is ook uitgerust met helderveldverlichting voor visualisatie en nanometerstabilisatie van het monster.
Als tweede stap wordt een multikanaals flowcel geïntegreerd in een microflowsysteem gebouwd om tot wel vier laminare stromen efficiënt alle componenten voor het experiment te kunnen werven en assembleren. Vervolgens wordt de enkelvoudige molecuulconstructie geassembleerd om de experimenten uit te voeren. Eerst worden twee strip titin gecoate microspheres met de dubbele optische pincetten in het eerste kanaal gevangen.
De twee gevangen kralen worden vervolgens naar het tweede kanaal verplaatst om de aanhechting van de DNA-sjabloon, gelabeld met biotine aan beide uiteinden, mogelijk te maken. De aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul wordt gecontroleerd in het derde kanaal door een DNA-krachtextensieanalyse. Ten slotte wordt de kraal-DNA-kraalconstructie, genaamd DNA-dumbbell, verplaatst naar het eiwitkanaal waar het fluorescerend gelabelde lactoserepressoreiwit aanwezig is.
Er worden resultaten verkregen die diffusie en specifieke binding van enkele LAC-oogmoleculen op een enkel uitgerekt DNA-molecuul en de kwantificering van de kinetische parameters van LAC-oogbeweging laten zien. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande enkelvoudige molecuulmethoden zijn de mogelijkheid om de spanning op de nieuwe molecuul te regelen, de mogelijkheid om bewegingen van de bindende eiwitten nauwkeurig te volgen over een nanometer stabiele plek, evenals de mogelijkheid om ver van de dekselslaapoppervlak te werken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken over eiwit-DNA-interacties, met name over de mechanica van genexpressieregulatie, evenals de dynamica van eiwitdiffusie langs het DNA in de mechanismen van doelzoeken.
Deze demonstratie van deze methode is erg nuttig om de praktische aspecten van de constructie van de flowcel, monsterbehandeling en assemblage van de beat DNA-kraalconstructie te laten zien. Deze video zal eerst laten zien hoe de wijsvingerstabiliteit van de twee opvanglasers wordt gecontroleerd met behulp van microkralen die op een dekglasoppervlak zijn vastgeplakt als referentie. Details over het ontwerp en de constructie van de optische pincetset-up zijn te vinden in de bijbehorende protocoltekst.
Gebruik een 24 bij 60 millimeter dekglas om twee microliter silicakralen op het oppervlak van een 24 bij 32 millimeter dekglas te verspreiden. Gebruik twee stukken dubbelzijdig plakband. Bevestig het 24 bij 32 millimeter dekglas op een microscoopglaasje om een flowcel te maken.
Vul de flowcel met 50 millimolair fosfaatbuffer en verzegel deze met siliconenvet afbeelding. Eén silicakraal in helderveldmicroscopie bij ongeveer 2000 keer vergroting. Het gezichtsveld moet ongeveer zeven bij vijf micrometer zijn verkregen bij 7 68 bij 5 76 pixels, zodat het kraalabeeldje een diameter heeft van ongeveer 190 pixels. Compenseer thermische driften met een feedbacksoftware die de XY-positie berekent uit het centrum van het beeld en Z uit de diffractieringen en corrigeert driften.
Verplaats een pizo-trap met nanometernauwkeurigheid of beter overlap het centrum van de linkerval met het centrum van de kraal en meet het positielawaai en de standaarddeviatie ervan vanaf de quadrantdetectorfotodiode of QDP. Herhaal de meting voor de rechterval. De standaarddeviatie van het positielawaai moet binnen enkele nanometer liggen om een nauwkeurige lokalisatie van DNA-bindende eiwitten mogelijk te maken om de flowcel te maken.
Een diamanttip wordt eerst gebruikt om een millimeterdiametergaten in een 76 bij 76 bij een millimeter microscoop te boren. Glijd om vier parallelle bufferstromen mogelijk te maken. Elke bevat een van de verschillende componenten die nodig zijn voor het experiment, kralen, DNA, fluorescerend gelabeld eiwit en beeldvormingsbuffer. Reinig de microscoopplaat met ethanol en centreer de poort met de O-ring erin en de kleefring in de plaat rond de toegangsgaten. Het is essentieel om handschoenen te dragen tijdens deze stap om vingerafdrukken te voorkomen, die de lijmprocedure zouden verstoren.
Met behulp van een tweede glijd de nanopoorten naar de plaat en plaats deze in een oven die gedurende een uur op 180 graden Celsius is voorverwarmd om volledige bevestiging mogelijk te maken. Teken ondertussen het omtrekpatroon van de flowcel op een stuk papier. Het kanaal moet ongeveer drie millimeter breed zijn en overeenkomen met de hele posities op de microscoopplaat.
Plaats de tekening op twee stukken perfil en maak met een scalpel scherpe en doorlopende sneden langs de getekende omtrek. Verwijder eventuele uitsteeksels die zijn gevormd, gooi de onderste parfumlaag weg, die alleen wordt gebruikt om een schone ondersteuning te garanderen. Plaats vervolgens de microscoopplaat met de aangehechte nanopoorten ondersteboven in de metalen ondersteuning.
Lign de omtrek van de paraformkamer voorzichtig met de gaten, zorg ervoor dat de param de inlaten en uitlaten van de kamer niet uitsteekt. Bedek de deksel van de kamer met een gereinigde microscoopdekking en verwijder voorzichtig overtollig param rond de kamer. Plaats twee warmteblokken die eerder zijn verwarmd op 120 graden Celsius bovenop de flowcel om een homogene druk toe te passen. Laat de parafilm ongeveer 25 minuten smelten.
De volgende stap is het voorbereiden van het drukreservoir en de buffercontainers. Het drukreservoir is gemaakt van plexiglas en biedt plaats aan maximaal zes buffercontainers. Verbind eerst de afsluitkleppen bij de uitgang van de buffercontainers om de bufferstroom aan te zetten met de klephendel in de verticale positie of uit in de met de klok mee gedraaide positie.
Tijdens de experimenten monteert u de flowcel op de microscooptafel. Verbind vervolgens de afsluitkleppen via de polyether, etherketon of peakbuis en de flenzenloze draaiingen naar de inlaten van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het observeren van de dynamische interactie tussen een enkel DNA-bindend eiwit en een DNA-molecuul. De techniek combineert dubbele optische pincetten en fluorescentiemicroscopie om dit doel te bereiken.
Belangrijke onderdeel van het onderzoek
Wetenschappelijk gebied
- Biofysica
- Technieken voor enkelvoudige moleculen
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit-DNA-interacties is cruciaal voor moleculaire biologie.
- Technieken voor enkelvoudige moleculen maken een gedetailleerde observatie van deze interacties mogelijk.
- Optische pincetten kunnen enkelvoudige moleculen met hoge precisie manipuleren.
- Fluorescentiemicroscopie biedt visualisatie van gelabelde moleculen.
Doel van het onderzoek
- Om de interactie tussen een enkel fluorescent gelabeld eiwit en een DNA-molecuul te observeren.
- Om een op maat gebouwde microscoop te ontwikkelen die meerdere technieken integreert.
- Om het begrip van moleculaire interacties op het niveau van enkelvoudige moleculen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Combinatie van dubbele optische pincetten en fluorescentiemicroscopie.
- Gebruik van helderveldverlichting voor visualisatie van monsters.
- Constructie van een multi-kanaals flowcell voor efficiënte assemblage van componenten.
- Assemblage van constructies van enkelvoudige moleculen met behulp van titine-gecoate microsferen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle observatie van eiwit-DNA-interacties op het niveau van enkelvoudige moleculen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de op maat gebouwde microscoopopstelling.
- Inzichten in de dynamica van eiwitbinding aan DNA.
- Een betrouwbare methode voor toekomstige onderzoeken met enkelvoudige moleculen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt een gedetailleerde studie van eiwit-DNA-interacties mogelijk.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende biologische onderzoeksvragen.
- Toekomstige studies kunnen op deze techniek voortbouwen om andere moleculaire interacties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise mechanical control and real-time imaging of protein-DNA interactions, providing quantitative insights into binding kinetics and diffusion dynamics. By eliminating surface artifacts and allowing sequence-specific interrogation under tension, it supports target validation and mechanistic de-risking in nucleic acid therapeutic discovery. The approach enhances predictive confidence in early-stage programs by revealing how mechanical parameters influence protein search and binding mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing specific binding and one-dimensional diffusion of DNA-binding proteins.
- Operational Value: Provides direct observation of lacI-operator interactions, supporting functional validation of transcriptional regulators.
- Predictive Value: Quantifies kinetic parameters of protein motion, informing target engagement models and binding affinity predictions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible platform for monitoring protein-DNA interactions under controlled mechanical conditions.
- Quantitative Output: Generates measurable outputs such as diffusion coefficients and binding dwell times via mean square displacement analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other DNA-binding proteins or molecular motors where tension modulation is relevant.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic De-risking: Clarifies how mechanical tension influences protein diffusion and target search, informing models of gene expression regulation.
- Translational Continuity: Bridges biophysical mechanism with functional outcomes in transcriptional control pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing how sequence-specific binding competes with non-specific diffusion under physiological mimicry.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling hypothesis testing and target validation prior to lead identification by providing mechanistic insights into protein-DNA dynamics.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by revealing how proteins navigate DNA landscapes via diffusion and specific binding.
- Screening: Delivers assay-ready systems with nanometer stability and quantitative readouts for binding and diffusion events.
- Analytics: Enables extraction of diffusion coefficients and binding kinetics from spatial-temporal tracking data.
- Translational Research: Connects single-molecule mechanism to transcriptional regulation models only when supported by observed operator-specific binding.
- Enterprise Reuse: Represents a modular capability for studying any protein-nucleic acid interaction where force and fluorescence readouts are informative.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions by correlating binding events with mechanical state and DNA sequence.
- Operational Value: Ensures reproducibility through dual-bead stabilization and drift correction, enabling precise nanometer localization.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by distinguishing specific binding from non-specific diffusion under controlled tension.
- Portfolio Impact: Informs prioritization of nucleic acid-targeting modalities by revealing kinetic barriers to target search.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, fluorescence microscopy, and microfluidic flow cell design.
- Dependent on nanometer-stable instrumentation including piezo stages and feedback systems for drift compensation.
- Necessitates standardization across teams for sample preparation, including biotinylated DNA and fluorescently labeled proteins.
- Involves adaptation considerations when extending to other polymers such as actin or microtubules where track mechanics differ.
- Limited by the need for surface-free environments, which while advantageous, increases complexity in sample handling and buffer exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:39
Optical Tweezers Setup with Nanometer Stability
4:40
Microfluidics
8:36
Combined Optical Trapping and Single-molecule Fluorescence Imaging Experiments
11:50
Results: Detection of Single Protein Molecules Interacting with a Single DNA Molecule
12:56
Conclusion
