Name: De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Leer hoe je eiwit-DNA-interacties bestudeert met optische pincetten en fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt nauwkeurige observatie van enkele moleculen mogelijk voor biofysisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, en Peter Gross voor hulp bij de microfluidics en Alessia Tempestini voor hulp bij de monstervoorbereiding. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (KP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 284464 en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs, Universiteit en Research FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, en in het kader van de Flagship Project NANOMAX.

1 optisch pincet Setup met nanometer Stabiliteit De experimentele opstelling moet twee optische pincetten bieden met het richten van de stabiliteit op de nanometer niveau en de intensiteit schommelingen van de trapping laser onder de 1%. Combinatie van deze voorwaarden zal nanometer stabiliteit van de halter onder normale spanning te verzekeren (1 pN - enkele tientallen PN), val stijfheid (0,1 pN / nm) en meetbandbreedte (beeldaanwinst tarief 20 sec -1). Een schema van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1. <ol><li> Optische ontwerp en de bouw pincet 15,17: <ol><li> Monteer de experimentele apparaten op een optische tafel met actieve isolatoren aan mechanische trillingen te verminderen. Monteer de microscoop structuur op elastomeer isolatoren aan de akoestische muziek en mechanische resonanties van de microscoop structuur absorberen. </li><li> Plaats een optische isolator in de weg van de opsluitende laser, bij laserbron, reduce willekeurige amplitude schommelingen als gevolg van optische feedback. </li><li> Verlaag de weglengte van de vangst laser zoveel mogelijk en omsluiten de gehele pad in een verzegelde doos laser richtend fluctuaties door luchtstromen en turbulentie te verminderen. </li><li> Maak double optisch pincet door het splitsen van een nabij-infrarood laserbron (Nd: YAG laser, 1064 nm golflengte) in twee bundels met orthogonale polarisaties. Gebruik geen time-shared vallen, omdat ze leiden tot oscillatie van de halter onder spanning 12. </li><li> Gebruik akoestisch-optische deflectors (gedelegeerde ordonnateurs) gedreven door Direct Digital Synthesizer (DDSS) om fijne bewegingen van (ten minste) een val en nauwkeurige regeling van DNA spanning staan. DDSS maken een betere stabiliteit dan val-voltage controlled oscillatoren (VCO). </li><li> Plaats twee kwadranten detektor fotodiodes (QDPs) in de achterkant brandvlak van de condensor om de positie van de gevangen korrels nauwkeurig sub-nm gedetecteerd. </li></ol></li><li> Controleer of de intensiteit fkijkt wat van de trapping laser op de microscoop ingang zijn onder de 1% met behulp van een fotodiode met een bandbreedte groter dan het tarief van de beeldopname. </li><li> Controleer wijzen stabiliteit van de twee trapping lasers: <ol><li> Bereid silicapareltjes in fosfaatbuffer: Verdun 20 pi silicapareltjes (1,54 urn, 10% vaste stof) in 1 ml aceton, ultrasone trillingen 30 sec, vortex kort en centrifugeer 2 minuten bij 19.000 x g. Resuspendeer in 1 ml aceton en herhaal wassen. Resuspendeer in 1 ml 50 mM fosfaatbuffer, was 2 maal en tenslotte resuspendeer in 100 ul van 50 mM fosfaatbuffer. </li><li> Kalibreer optisch pincet met silica beads: bereid een stroomcel door het aanbrengen van een dekglaasje op een objectglaasje met dubbelzijdig plakband (ongeveer 60 urn dik). Flow 1 mg / ml BSA en wacht 3 minuten. Flow silica kralen verdund 1/1000 in fosfaatbuffer en sluit de stroom kamer met siliconenvet. Trap een kraal in elke val en kalibreren de vallen met de power spectrum methode 18. </li&gt; <li> Bereid silicapareltjes in pentyl acetaat en nitrocellulose: Verdun 20 pi silicapareltjes (1,54 urn, 10% vaste stof) in 1 ml aceton, ultrasone trillingen 30 sec, vortex kort en centrifugeer 2 minuten bij 19.000 x g. Resuspendeer in 1 ml aceton en herhaal wassen. Resuspendeer in 1 ml pentylacetaat en was 2 keer. Tenslotte resuspendeer ze in pentylacetaat met 0,1% nitrocellulose opgelost in pentylacetaat. </li><li> Spreid 2 ui 1,54 urn diameter silicapareltjes opgelost in pentylacetaat + 0,1% nitrocellulose op het oppervlak van een dekglaasje (24 x 24 mm) met een tweede dekglaasje (24 x 60 mm). Bevestig het dekglaasje op een objectglaasje met twee stukken dubbelzijdige tape een stroomcel maken. Vul het stroom-cel met 50 mM fosfaatbuffer en verzegelen met siliconenvet. </li><li> Beeld dat men silica kraal in helderveld microscopie op 2,000X vergroting. Het gezichtsveld moet 7 x 5 urn verkregen bij 768 x 576 pixel, zodat het beeld kraal heeft een diameter van 190 pixels. Compensatie thermische afwijkingen met een feedback software die, zoals in ref. 17 berekent xy positie van het beeld en zwaartepunt z van de diffractie ringen en corrigeert afwijkingen verplaatsen van een piëzo podium met nm-precisie of beter. </li><li> Overlap het centrum van links val met de hiel midden (de xy signaalniveaus van de QDP moet dezelfde gemeten tijdens de kalibratie) en meet de positie geluid en de standaardafwijking van de QDP. Herhaal de meting voor de juiste val. </li></ol></li></ol> 2 Single Molecule Localization met nanometer nauwkeurigheid <ol><li> Fluorescentie microscopie ontwerp en de bouw 15,19 <ol><li> Gebruik een hoog kwantumrendement en elektronen vermenigvuldigd CCD en hoge signaal-ruisverhouding noodzakelijk nanometernauwkeurigheid lokalisatie bereikt. </li><li> Kies optiek een pixelgrootte ~ 80 nm te krijgen (bijvoorbeeld een vergroting ~ 200X met een camera pixelgrootte van 16 um). Dit is suffidoende klein lokalisatiefout verwaarlozen door pixelation 8, maar groot genoeg om een groot aantal fotonen per pixel verzamelen. </li><li> Als excitatie bron gebruikt laserlicht dat is gepolariseerd (door passage door een niet-polarisatiebehoudende glasvezel) of circulair gepolariseerd (door passage door een λ / 4 golfplaat) tot excitatie van enkele chromoforen maximaliseren, ongeacht hun oriëntatie. </li><li> Kies emissie bandpass filters die efficiënt afgesneden zowel excitatie en trapping laserlicht. Opmerking: In onze experimenten gelabeld we onze eiwit met Atto532 kleurstof en gebruikt een bandpass emissie filter gecentreerd bij 600 nm met 100 nm bandbreedte. </li></ol></li></ol> 3 Microfluidics Om een nauwkeurige controle van de buffer uitwisseling en &#39;halter&#39; assembly, dat wil zeggen, de verankering van een enkel DNA-molecuul tussen twee optisch gevangen microbolletjes, een custom-built laminaire multichannel doorstroming te bereikensysteem worden ontwikkeld. Deze bestaat uit een stromingskamer, een druk-reservoir en een drukregelsysteem (figuur 2). <ol><li> Flow celpreparaat OPMERKING: De stroom kamer wordt gebruikt voor single-molecule experimenten op eiwit-DNA-interactie heeft bij voorkeur 4 ingangen en 1 uitgang, om maximaal 4 parallelle buffer stromen, elk met een van de verschillende componenten die nodig zijn voor het experiment: kralen, DNA, fluorescentie-gemerkt eiwit en imaging buffer. Scheiding van de componenten in de stroom-kanalen maakt een efficiënte inbouw van een halter. Bovendien is de beeldvorming kanaal is nuttig om achtergrondfluorescentie voorkomen diffundeert eiwitten en bereiken de hoge signaal-ruisverhouding vereist voor de lokalisatie van het DNA-bindende eiwit met een nauwkeurigheid in de orde van enkele nanometers. <ol><li> Boor gaten 1 mm diameter in het objectglaasje (76 x 76 x 1 mm) met een diamant-tip, om 4 ingangen en een uitgang creëren. </li><li> Clean the microscoopglaasjes met ethanol en centreren de poort met de O-ring geplaatst en de lijm ring in de slede rond de toegangsopeningen. Het is van fundamenteel belang om handschoenen te dragen tijdens deze stap om vingerafdrukken, die het lijmen proces zou verstoren voorkomen. </li><li> Klem de NanoPorts aan de glijbaan, en plaats deze in de voorverwarmde oven op 180 ° C gedurende 1 uur om volledige bevestiging mogelijk te maken. </li><li> Teken de omtrek patroon van de stroomcel op een stuk papier. De kanalen moeten worden ~ 3 mm breed en overeenkomen met de gaten positie op het objectglaasje. </li><li> Leg de tekening op de top van twee stukken van Parafilm, en met een scalpel te scherp en voortdurende bezuinigingen langs de getekende omtrek. Verwijder eventuele uitstulping gevormd. Gooi de onderste Parafilm laag, die alleen wordt gebruikt om een ​​schone support garanderen. </li><li> Plaats de microscoop dia met de bijgevoegde NanoPorts ondersteboven in de metalen steun. </li><li> Lijn de Parafilm kamer schets met de gaten en zorg ervoor dat eop de parafilm niet opdringen de inlaten en uitlaat van de kamer. </li><li> Dek af met een schoon microscoop dekglaasje (62 x 56 x 0,15 mm) en verwijder voorzichtig overtollige Parafilm rondom de kamer. </li><li> Plaats twee verwarmingsblokken vooraf bij 120 ° C verwarmd, bovenop de stroomcel constante druk uitoefenen op het. Laat de Parafilm smelten voor ongeveer 25 minuten. </li></ol></li><li> Druk reservoir en buffer containers De druk reservoir moet worden gemaakt van plexiglas (of soortgelijke) en laat accommodatie zes buffer containers. De mogelijkheid om ten minste twee extra buffer containers verbetert de flexibiliteit instrument. Merk op dat transparante containers en buizen aanzienlijk helpen in flow-systeem hanteren en oplossen van problemen van ingesloten luchtbellen. Steriele en disposable luer lock-tip spuiten (2,5 ml), waarvan de plunjers eerder zijn verwijderd, zijn goede buffer containers en maken een gemakkelijke verbinding met de inlaatslang. Zorg ervoor dathet totale vloeistofvolume is klein vergeleken met de hoeveelheid lucht in het drukreservoir, een voorwaarde noodzakelijk om een ​​goede en stabiele stroom te verkrijgen. <ol><li> Sluit afsluiters bij de uitgang van de buffer containers voor het draaien van de buffer stroom aan of uit tijdens de experimenten. </li><li> Monteer de stroom cel op de microscoop podium. Sluit de afsluiters aan de stroom kamer inlaten met polyetheretherketone buis (binnendiameter ~ 150 micrometer) en flensloze fittingen. Voeg ~ 3 cm van gefluoreerde ethyleen-propyleen-buis (binnendiameter ~ 500 micrometer) als een koppeling tussen de slang en de NanoPort vergaderingen van de stroom cel. Deze stap is essentieel om de buffer stroom bij de inlaatkamer verminderen breuk van de stroomcel of NanoPort onthechting van het glas te vermijden. Het gebruik van grote buis binnendiameter alleen, anderzijds, zouden grote hoeveelheden biologische monsters nodig. </li><li> Sluit de stromingskamer uitlaat een open Falcon buis bij atmosferische druk. Dezebuis dient als beschikking voor de buffer stroomt uit de stroming kamer. </li></ol></li><li> Drukregeling <ol><li> Bouw een drukregeling kan fijn instellen van de luchtdruk in het drukreservoir. Dit kan door twee computergestuurde magneetventielen, een verbonden met een 0,5 atm drukbron (compressor) en de tweede tot atmosferische druk. Magneetafsluiters herhaaldelijk geopend ongeveer 7 msec te verhogen of de druk te verlagen in de lijn totdat de gewenste waarde is bereikt. LET OP: deze aanpak werd aangepast van Carlos Bustamante 20, en het levert een betere doorstroming dan het gebruik van een stappenmotor injectiepomp 21. </li><li> Voeg een drukomzetter geregeld door een op maat ontworpen software om de effectieve druk op het drukreservoir controleren. Typische de werkdruk in de orde van 20 mbar voor halter montage en 200 mbar voor het wassen van de stroom systeemcomponenten. </li></ol></li&gt; </ol> 4 DNA Tailing met Biotinylated Deoxycytidine trifosfaat (biotine-dCTP) Het DNA molecuul moet langer dan 1 urn om haar uitbreiding onder de stroom en verankering aan de gevangen beads vergemakkelijken. Bovendien zal een lange DNA voorkomen IR trapping licht verlichten DNA bindend eiwit. Dit is van bijzonder belang omdat de absorptie van IR-licht van een opgewonden chromofoor resulteert in een verhoogde fotobleking. OPMERKING: In de huidige studie, het DNA-molecuul was 3,7 micrometer lang. Het molecuul bevat drie kopieën van de primaire operator O1 en een kopie van elk van de twee extra operatoren, O2 en O3. Deze sequenties zijn ingevoegd in het midden van het molecuul, hetgeen resulteert ongeveer gelijke afstand van de gevangen kralen en IR laserstralen. <ol><li> Meng 1 pmol van lineair DNA 3&#39;-uiteinden met 60 pmol van biotine-14-dCTP, 4 pl 5x Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) buffer (1 M kalium cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 bij 25 ° C)) en 1,5 pl TdT en DDH 2 O tot een totaal volume van 20 ul. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Dit resulteert in de toevoeging van tot 60 nucleotiden per DNA uiteinde. Merk op dat DNA 3&#39;-overhangen zijn tailed met hoger rendement dan verzonken of stompe uiteinden. </li><li> Zuiver tailed DNA met spin kolommen of fenol / chloroform extractie en de daaropvolgende ethanolprecipitatie om CoCl2 verwijderen uit de TdT reactie buffer. </li><li> Na zuivering, kan DNA worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken bij -20 ° C voor langere periodes maar niet herhaaldelijk ontdooien en opnieuw invriezen. </li></ol> 5. Labeling Eiwit thiolgroepen met ATTO532 Labelen door modificatie van cysteïne residuen moeten niet weg eiwit activiteit. Om dit probleem op te lossen, hebben we gebruik gemaakt van een LacI mutant, LacIQ231C, ontwh draagt ​​slechts een cysteïne per monomeer op positie 231 Deze mutant behoudt dezelfde eigenschappen van het wildtype en chemische modificaties op positie 231 is aangetoond dat ze niet interfereren met eiwitstabiliteit 22. LET OP: Wij gelabeld het eiwit met ATTO532 maleïmide. <ol><li> Zorg ervoor dat het eiwit wordt opgelost in een buffer met een pH lopend 7,0-7,5 en met een concentratie variërend van 2 tot 10 mg / ml. Opmerking: in deze experimenten werd LacI opgelost in 0,3 M kaliumfosfaat, 5% glucose, pH 7,5 (buffer A). </li><li> Los tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml in H2O TCEP oplossing moet vers bereid vóór gebruik. </li><li> Meng 100 pi van het eiwit met 3 ul TCEP en vortex goed. </li><li> Los de kleurstof in N, N-dimethylformamide (DMF) om een eindconcentratie van 10 mg / ml werken bij weinig licht. Vortex tot het volledig is opgelost. </li><li> Reactie mix: Voeg 33 ul van kleurstof aan het eiwit + TCEP en vortex voorzichtig. Snelzwierend zoveel oplossing te verzamelen. </li><li> Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur in een shaker (8.000 rpm) bij 20 ° C (of bij 4 ° CO / N), beschermd tegen licht. </li><li> Los L-Glutathione gereduceerd (GSH) tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml in H2O Voeg 3 ul aan het reactiemengsel en incubeer op de schudinrichting bij 8000 rpm gedurende 15 minuten. GSH de reactie te stoppen door blokkering van de reactiviteit van thiolgroepen. </li><li> Zuiver het gemerkt eiwit met behulp van standaard gelfiltratiekolommen, dialyse of draai concentrators. Opmerking: In deze experimenten werd gelabeld LacI gezuiverd middels 10 kDa cutoff rotatie concentrators. <ol><li> Verdun het reactiemengsel met tot 12 ml van buffer A, toepassen op de concentrator apparaat en Centrifugeer bij 8.000 xg, 1 uur, 4 ° C. De gemerkte LacI is dus geconcentreerd tot een eindvolume van 500 pl en de overmaat kleurstof passeert het membraan in het flow-through. Gooi de doorstroom en herhaal stap 5.8.1 minstens drie keer. </li></ol></li><li> Verdeel het gelabelde eiwit in kleine porties en bewaar bij -80 ° C. Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien. </li></ol> 6 gecombineerde optische overvullen en Single-molecule fluorescentie beeldvorming Experimenten <ol><li> Voeg 1 ml van buffer A tot buffer containers en breng 200 mBar druk de verbindingsleidingen wassen en flow cel. Om diffusie van het bindende eiwit op DNA, naar en in de volgende stappen te maximaliseren, buffer A worden vervangen met een lage ionische sterkte buffer. Opmerking: In deze experimenten gebruikten we TBE 0.5x. </li><li> Controleren op de aanwezigheid van lucht-belletjes, die de stroom gladheid kan verstoren. Een zachte tik op de afvoerbuis zal helpen om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. </li><li> Verlaag de druk tot 20 mbar en controleer of alle kanalen en buizen zijn duidelijk van luchtbellen en de buffer stroomt met vergelijkbare snelheden in alle kanalen. </li><li>Bereid de monsters tot een eindvolume van 300 pi: met streptavidine gecoate polystyreenkorrels 1,87 urn; 20 pM van lineair DNA, gebiotinyleerd aan beide uiteinden overeenkomstig punt 4; 300 pM van LacI tetramer gelabeld met ATTO532 volgens paragraaf 5. </li><li> Voeg elk monster een van de spuit containers in de volgende volgorde: parels in het eerste kanaal, DNA in het tweede, derde kanaal met de beeldvormende enige buffer (buffer A + zuurstofwegvanger systeem) en het gemerkte eiwit in het vierde kanaal. </li><li> Schakel de stroom op 200 mBar gedurende 3 minuten te laten de monsters pas in het stromingskanaal. Dan verminderen de druk tot 20 mbar. </li><li> Terwijl de beeldvorming van de eerste kanaal onder helderveld, het inschakelen van de twee optische pincet en vangen een polystyreenparel in elke val. </li><li> Beweeg snel naar het tweede kanaal te vermijden dat andere kralen vallen in de vallen. Merk op dat de aankomst in het DNA kanaal gemakkelijk zichtbaar door het einde van de kraal flow. </li><li> Met one AOD Verplaats een trap (kraal) heen en weer in de nabijheid van de tweede hiel naar de verbinding van de stroming uitgebreide DNA tussen de twee optisch gevangen kralen mogelijk. Wanneer een DNA halter wordt gevormd, de statische kraal begint na de beweging van de kraal die actief heen en weer door de trap wordt verplaatst. </li><li> Beweeg snel naar de buffer kanaal en zet de buffer flow. Voer een kracht-verlenging curve analyse 4,23-25 ​​om de aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul te verifiëren. Als er meer dan een molecuul aanwezig is (dat wil zeggen, de enthalpische, het verhogen fase van de kracht-extensie curve optreedt bij een lengte korter dan de DNA-contour lengte), gooi de halter en begin opnieuw vanaf stap 6.7. </li><li> Zodra een enkel DNA halter wordt verkregen, schakelt u de stroom weer en beweeg de halter aan het eiwit kanaal. Schakel over naar brede veld fluorescentie microscopie om de interactie van de gelabelde-LacI met DNA controleren. Schakel de stroom en start acquisitie. </li></ol>

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen tien jaar hebben enkel molecuul manipulatie en beeldvormende technieken een grote vooruitgang op het gebied van ruimtelijke en temporele resolutie te zien. De combinatie van manipulatie en beeldvormingstechnieken aan de basis van krachtige instrumenten die nu toelaten de controle van de mechanische condities van een biologisch polymeer, zoals DNA, RNA of cytoskelet filamenten en de gelijktijdige lokalisatie van afzonderlijke eiwitten die interageren met hetzelfde polymeer . Beheersing van de mechanische ...

Enkel molecuul (SM)-technieken zijn sterk ontwikkeld in de afgelopen dertig jaar te spelen op de behoefte van het overwinnen van een aantal van de beperkingen van de traditionele, buikoplossing metingen 1-3. De manipulatie van enkele biologische moleculen heeft de mogelijkheid om de mechanische eigenschappen van biopolymeren 4 meten en controleren van de mechanische parameters van eiwit-eiwit 5 en eiwit-DNA interacties 6,7 gemaakt. SM fluorescentiedetectie, anderzijds, vertegenwoordigt een enorm veelzijdig hulpmiddel om eiwitactiviteit in vitro en in vivo, waardoor de mogelijkheid van het lokaliseren en volgen enkele moleculen nanometerprecisie. Door montage van het instrument point spread-functie beeld SM, in feite, kan lokalisatie bereiken met een precisie hoofdzakelijk afhankelijk signaal-ruisverhouding (SNR) en tot een maximum van ongeveer een nanometer 8,9. Deze methodieken vind krachtigtoepassingen in de studie van de dynamica van motorische eiwitten, alsmede de diffusie processen die doelzoek- in DNA-bindende eiwitten. Het vermogen van het bepalen diffusieconstanten als functie van de DNA-sequentie, verblijftijd op het substraat en nauwkeurig meten van de DNA lengte onderzocht tijdens eendimensionale diffusie events, vormen een krachtig hulpmiddel voor de studie van proteïne-DNA-interactie dynamiek en het onderzoek van de mechanismen van de specifieke doelgroep zoeken. Onlangs is de combinatie van deze twee technieken een nieuwe generatie meetopstellingen 10-14 die gelijktijdige manipulatie van een biologisch substraat (bijvoorbeeld een actine filament of een DNA-molecuul) en detectie / lokalisatie van een interactie partner enzym (bijvoorbeeld geproduceerd myosine of een DNA bindend eiwit). De voordelen van deze technieken voornamelijk berusten op de mogelijkheid oefenen mechanische controle over de gevangen polymeer, waardoor enabling de studie van de interactie tussen de dynamiek versus krachten of koppels. Ook de methode maakt metingen van biochemische reacties ver van het oppervlak voorkomen een van de belangrijkste beperkingen van klassieke SM methoden, namelijk de noodzaak van immobilisatie van de moleculen onder studie op een oppervlak (glasplaatje of microbolletjes). De combinatie van twee enkelvoudige moleculen technieken vereist het overwinnen van enkele technische problemen, vooral als gevolg van de eisen van de mechanische stabiliteit en voldoende SNR (vooral wanneer die lokalisatie met nm precisie) 15. In het bijzonder wanneer SM fluorescentie detectie koppeling met een optisch pincet, de vermindering van het lawaai en fotobleken van de trapping infrarode lasers 16 en de controle van biochemische buffers voor de montage van de biologische complexen en de prestaties van de experimentele metingen 11 van het allergrootste belang. Hier beschrijven we de werkwijzen voor succesvolle uitvoeringmetingen in een dual trapping / SM Fluorescentie lokalisatie setup. De methodiek wordt geïllustreerd met het voorbeeld van lactose repressor eiwit (LacI) fluorescent gelabelde (met Atto532) en gedetecteerd als het bindt aan een DNA-molecuul (opgesloten tussen twee optische pincetten) met specifieke LacI bindingssequenties (dwz operators). We tonen de doeltreffendheid van de werkwijze het detecteren van binding van LacI aan DNA en diffusie langs de contour in het doel zoekproces. De methode is van toepassing op elke combinatie van DNA-sequentie en DNA-bindende eiwit, en andere systemen (microtubuli en actine filamenten en de motor eiwitten interactie met hen).

<table><tbody><tr><td>Elastomeren isolatoren</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Kies de juiste Newdamp-elastomeer afhankelijk van het microscoopgewicht en de resonantiefrequenties</td></tr><tr><td>Optische isolator</td><td>Optiek voor onderzoek</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG-laser, 1.064 nm golflengte</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optische def lectoren (AOD's)</td><td>A&amp;A optoelectronic</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Directe digitale synthesizers</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadrantdetectorfotodioden</td><td>OSI optoelectronics</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO- en FPGA-board</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Halogeenlamp</td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Condensor</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersie</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X en 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>Elektronen-vermenigvuldigde CCD</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Piezo-stage met nm-nauwkeurigheid</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilter</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Silica-kralen (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Pentyl acetaat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Ontvlambare vloeistof en damp (Nr 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Ontvlambare vaste stof&nbsp; (Nr 1272/2008)</td></tr><tr><td>Heat block</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>met 2 verwijderbare blokken; voorverwarmd op 120 &deg;C</td></tr><tr><td>NanoPort-assemblages</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Polyetheretherketonbuizen&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Zelfgebouwde metalen houder voor de assemblage van de flow-chamberdrukreservoir gemaakt van Plexiglas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer lock-tip spuiten 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Uitschakelkleppen&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Flensloze fittingen&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Gefluoreerde ethyleenpropyleenbuizen&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Twee computergestuurde magneetventielen</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Druktransducer</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Terminele deoxynucleotidyl transferase (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Ontvlambare vloeistof, schadelijk bij huidabsorptie. Irritante, teratogeen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311</td></tr><tr><td>Tris-(2-carboxyethyl)fosfiinchloorhydride (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathione gereduceerd (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Acute toxiciteit, oraal (categorie 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membraan, 10&nbsp;kDa cutoff spin concentrators</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-gecoate polystyreenkralen 1,87 &micro;m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

de combinatie van single-molecule manipulatie en imaging voor de studie van eiwit-dna interacties

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Het artikel beschrijft de combinatie van optische pincetten en detectie van fluorescentie op enkele moleculen voor de studie van eiwit-DNA-interactie. De methode biedt de mogelijkheid om interacties te onderzoeken die zich in oplossing voordoen (en daarmee problemen te vermijden die veroorzaakt worden door nabijgelegen oppervlakken zoals bij andere methoden op enkele moleculen), het DNA-uiteinde te controleren en interactiedynamiek te volgen als functie van zowel mechanische parameters als DNA-sequentie. De methoden voor het tot stand brengen van succesvol optisch vangen en nanometer lokalisatie van enkele moleculen worden geïllustreerd. We illustreren de experimentele omstandigheden die de studie van de interactie van lactose-repressor (lacI), gelabeld met Atto532, met een DNA-molecuul dat specifieke doelsequenties (operatoren) voor LacI-binding bevat, mogelijk maken. De methode maakt het mogelijk om specifieke interacties op de operatoren te observeren, evenals eendimensionale diffusie van het eiwit tijdens het proces van doelzoeken. De methode is breed toepasbaar voor de studie van eiwit-DNA-interacties, maar ook voor moleculaire motoren, waar controle van de spanning toegepast op het partnerbaanpolymeer (bijvoorbeeld actine of microtubuli) wenselijk is.

In een succesvolle experiment, ondergaan een (of meer) gemerkte eiwitten bindmiddel / vrijblijvend en / of monodimensional diffusie langs het DNA-molecuul (Figuur 3A). Lokalisatie van eiwitten aan het DNA-molecuul maakt de kwantificering van kinetische parameters als functie van de DNA-sequentie. Als buffer omstandigheden waardoor 1D diffusie toegepast is het mogelijk om eiwitten trajecten volgen en bepalen bijvoorbeeld de diffusiecoëfficiënt D 1D. De exacte plaat...

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Het algemene doel van deze procedure is het observeren van de dynamische interactie tussen een enkel DNA-bindend eiwit en een DNA-molecuul. Dit wordt bereikt door in een op maat gebouwde microscoop twee single-molecule technieken te combineren: dubbele optische pincetten en fluorescentiemicroscopie. Deze opstelling is daarnaast uitgerust met helderveldverlichting voor visualisatie en nanometerstabilisatie van het monster.Als tweede stap wordt een multichannel flowcel, geïntegreerd in een microflow-systeem, gebouwd om tot vier laminaire stromingen mogelijk te maken, waarmee alle voor het experiment benodigde componenten efficiënt kunnen worden geworven en geassembleerd. Vervolgens wordt het single-molecule-construct geassembleerd om de experimenten uit te voeren. Eerst worden twee met strip titine gecoate microsferen met de duale optische pincetten in het eerste kanaal gevangen.De twee gevangen kraaltjes worden vervolgens naar het tweede kanaal verplaatst om de aanhechting van het DNA-sjabloon, dat aan beide uiteinden is gelabeld met biotine, mogelijk te maken. De aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul wordt in het derde kanaal gecontroleerd via een DNA-krachtextensieanalyse. Ten slotte wordt het kraaltje-DNA-kraaltje-construct, het zogenaamde DNA-haltertje, verplaatst naar het proteïnekanaal waar het fluorescent gelabelde lactose-repressoreiwit aanwezig is.De verkregen resultaten tonen de diffusie en specifieke binding van individuele LAC eye-moleculen op een enkel uitgerekt DNA-molecuul, evenals de kwantificering van de kinetische parameters van de beweging van LAC eye. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande single-molecule methoden zijn de mogelijkheid om de spanning op het molecuul te controleren, de mogelijkheid om bewegingen van de bindende eiwitten nauwkeurig te volgen over een nanometer-stabiel punt, en het vermogen om ver van het oppervlak van het dekglas te werken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over eiwit-DNA-interacties, in het bijzonder over de mechanica van de regulatie van genexpressie, alsof over de dynamiek van eiwitdiffusie langs het DNA in de mechanismen van doelzoeking.Deze demonstratie van deze methode is zeer nuttig om de praktische aspecten van de constructie van de flowcel-monsterafhandeling en de assemblage van het DNA-bead-construct te tonen. Deze video zal eerst demonstreren hoe de richtingsstabiliteit van de twee trapping-lasers kan worden gecontroleerd met behulp van microbeads die als referentie op het oppervlak van een dekglas zijn bevestigd. Details over het ontwerp en de constructie van de optische pincetopstelling zijn te vinden in de bijbehorende protocoltekst.Gebruik een dekglas van 24 bij 60 millimeter om twee µL silicakralen te verspreiden over het oppervlak van een dekglas van 24 bij 32 millimeter. Bevestig het dekglas van 24 bij 32 millimeter met twee stukjes dubbelzijdige tape op een objectglas om een flowcell te creëren.Vul de flowcel met 50 millimolair fosfaatbuffer en sluit deze af met siliconenvet image. Eén silica-kraal in brightfield-microscopie bij een vergroting van ongeveer 2000 keer. Het gezichtsveld moet ongeveer zeven bij vijf micrometers zijn, verkregen op 768 bij 576 pixels, zodat de afbeelding van de kraal een diameter heeft van ongeveer 190 pixels; compenseer thermische drift met een feedback-software die de XY-positie berekent vanuit het centrum van de afbeelding en de Z-positie vanuit de diffractieringen en de drift corrigeert.Verplaats een piezo-stage met nanometerprecisie of beter zodat het centrum van de linker trap samenvalt met het centrum van de bead, en meet de positieruis en de standaarddeviatie hiervan met de kwadrantdetector-fotodiode of QDP. Herhaal de meting voor de rechter trap. De standaarddeviatie van de positieruis moet binnen enkele nanometers liggen om een precieze lokalisatie van DNA-bindende eiwitten mogelijk te maken bij het vervaardigen van de flowcell.Eerst wordt een diamantboor gebruikt om gaten met een diameter van 1 mm te boren in een microscoopglasplaat van 76 bij 76 bij 1 mm, om vier inlaatkan en één uitlaatgat te creëren. Dit maakt tot vier parallelle bufferstromen mogelijk.Elk bevat een van de verschillende componenten die nodig zijn voor het experiment: beads, fluorescentie-gelabelde DNA-proteïnen en beeldvormingsbuffer. Reinig het microscoopglasplaatje met ethanol en centreer de poort met de O-ring erin en de plakring op het plaatje rond de toegangsopeningen. Het is essentieel om tijdens deze stap handschoenen te dragen om vingerafdrukken te voorkomen, aangezien deze het lijmproces zouden verstoren.Klem met behulp van een tweede objectglaashouder de nanoporten aan het objectglas en plaats dit gedurende één uur in een oven die is voorverwarmd tot 180 °C om volledige hechting mogelijk te maken. Teken ondertussen het omtrekkende patroon van de flowcel op een stuk papier. Het kanaal moet ongeveer drie millimeter breed zijn en overeenkomen met de gatposities op het objectglas.Plaats de tekening bovenop twee stukken profil en maak met een scalpel scherpe en continue sneden langs de getekende omtrek. Verwijder eventuele ontstane uitsteeksels en gooi de onderste parfumlaag weg, die enkel is gebruikt om een schone ondergrond te garanderen. Plaats vervolgens het microscoopglaasje met de bevestigde nanopoorten ondersteboven in de metalen houder.Lijn de omtrek van de parafilmkamer zorgvuldig uit met de gaten, waarbij u erop let dat de parafilm niet over de in- en uitlaten van de kamerafdekking met een gereinigigd microscoopdekglaasje steekt, en verwijder voorzichtig de overtollige parafilm rondom de kamer. Plaats twee hitteblokken, die vooraf zijn verwarmd tot 120 °C, bovenop de flowcel om een homogene druk uit te oefenen. Laat de parafilm ongeveer 25 minuten smelten.De volgende stap is het voorbereiden van het drukreservoir en de buffercontainers. Het drukreservoir is gemaakt van plexiglas en biedt ruimte aan maximaal zes buffercontainers. Sluit eerst de afsluiters aan bij de uitlaat van de buffercontainers om de bufferstroom in te schakelen met de hendel in verticale positting, of uit te schakelen door de hendel met de klok mee te draaien.Bevestig tijdens de experimenten de flowcel op de microscooptafel. Verbind vervolgens de afsluiters via de polyetheretherketon (PEEK)-slangen en de flangeloze fittingen met de inlaatpoorten van de flowkamer. De PEEK-slang heeft een binnendiameter van ongeveer 150 µm; ongeveer drie centimeter gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP)-slang met een binnendiameter van ongeveer 500 µm wordt gebruikt als verbindingsstuk tussen de PEEK-slang en de nanopoortassemblages van de flowcel.Dit is essentieel om de bufferstroom bij de ingang van de kamer te beperken, zodat breuk van de flowcel of het loslaten van de nanopoort van het glas wordt voorkomen. Het uitsluitend gebruiken van slangjes met een grote binnendiameter zou daarentegen grote volumes biologische monsters vereisen. Verbind de uitlaat van de flowkamer met een open Falcon-buis bij atmosferische druk.Deze buis dient als opvang voor de buffer die uit de doorstroomkamer stroomt. Om deze procedure te starten, voegt u één milliliter buffer A toe aan elk van de buffercontainers en brengt u een druk van 200 millibar aan om de verbindingsbuizen en de doorstroomcel te spoelen. Een drukregelsysteem is hiervoor geschikt.Pas tot slot de luchtdruk in het drukreservoir aan. Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen, aangezien deze de vloeiendheid van de stroom kunnen verstoren. Een lichte tik tegen de uitlaatbuis helpt om eventuele resterende bellen te verwijderen; verlaag de druk naar 20 millibars en verifieer dat alle kanalen en buizen vrij zijn van luchtbellen en dat de buffer met vergelijkbare snelheden in alle kanalen stroomt.Bereid de monsters voor tot een eindvolume van 300 microliters. Voor dit experiment worden streptavidine-gecoate polystyreenkralen gebruikt, lineair DNA dat aan beide uiteinden is gebiotineerd en specifieke doelsequenties bevat voor de binding van het lactose-repressoreiwit, en fluorescent gelabeld lactose-repressoreiwit. Voeg elk monster toe aan een van de spuitcontainers in de volgende volgorde: de kralen in het eerste kanaal, het DNA in het tweede, de imagingbuffer in het derde en het gelabelde eiwit in het vierde kanaal.Zet de flow aan op 20 millibars en open de afsluiters zodat de monsters in het flowkanaal terechtkomen. Dit is eenvoudig waarneembaar in het bead-kanaal. Terwijl het eerste kanaal wordt afgebeeld onder brightfield-verlichting, schakelt u de twee optische pincetten in en vangt u in elke trap een polystyreen bead.Beweeg snel naar het tweede kanaal om te voorkomen dat de andere kraaltjes in de traps vallen. Let op dat de aankomst in het DNA-kanaal gemakkelijk merkbaar is door het einde van de kraalstroom. Gebruik een AO-optische deflector of een OD-verplaatsing om één trap-kraaltje heen en weer te bewegen in de nabijheid van het andere kraaltje, zodat het door de stroming verlengde DNA zich tussen de twee optisch gevangen kraaltjes kan hechten.Wanneer een DNA-haltermolecuul is gevormd, begint het statische kraaltje de beweging te volgen van het kraaltje dat actief door de trap heen en weer wordt bewogen. Ga snel naar het bufferkanaal en schakel de bufferstroom uit. Voer een kracht-extensiecurve-analyse uit om de aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul te verifiëren.Dit wordt bereikt door de twee kraaltjes uit elkaar te trekken terwijl de DNA-spanning wordt gemeten. Zodra er een enkel DNA-haltertje is verkregen, wordt de stroom opnieuw ingeschakeld en het haltertje naar het proteïnekanaal verplaatst. Schakel over naar breedveld-fluorescentiemicroscopie om de interactie van het gelabelde lactose-repressoreiwit met het DNA te monitoren, schakel de stroom uit en start de acquisitie.Deze methode maakt de detectie mogelijk van individuele lactose-repressor- of lac-eiwitmoleculen die interageren met een uitgerekt DNA-molecuul. In dit representatieve diagram diffundeert een enkel lac-eiwitmolecuul langs aspecifieke DNA-sequenties, terwijl een ander lac-eiwitmolecuul specifiek is gebonden aan één operator in het centrum van het DNA-molecuul. Deze grafiek toont de positie van de twee lac-eiwitmoleculen langs de richting die de centra van de twee traps verbindt.Als functie van de tijd werden de posities van de moleculen bepaald door het algoritme voor het radiale symmetriecentrum; hier wordt een plot getoond van de gemiddelde kwadratische verplaatsing of MSD tegenover de tijd voor een enkel lacI-molecuul dat diffundeert langs een uitgerekt DNA-molecuul. De diffusiecoëfficiënt van het eiwit kan eenvoudig worden verkregen via lineaire regressie van de gegevens. De combinatie van manipulatie- en beeldvormingstechnieken is een krachtige methode, waarmee mechanische controle over een enkel biologisch polymeer zoals DNA, RNA of een cytoskeletfilament mogelijk is, samen met de gelijktijdige lokalisatie van enkelvoudige eiwitmoleculen die met het polymeer zelf interageren.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de combinatie van manipulatietechnieken voor enkelvoudige moleculen en beeldvormingstechnieken een zorgvuldig ontwerp van de experimentele opstelling vereist om stabiliteit op nanometerniveau van het gesuspendeerde polymeer te garanderen. Daarnaast is een correct ontwerp van de biologische probe nodig om een ruimtelijke scheiding tussen de vallenstellende G-laser en de fluorescente probe te waarborgen. Raadpleeg de bijbehorende protocoltekst voor details.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het DNA-molecuul tussen de twee optische snelle beats assembleert. De assemblage van dit construct wordt beter bereikt met de multichannel flowcell, waarvoor we een gedetailleerde beschrijving hebben verstrekt. We hebben ook aangegeven hoe u de bufferstroom kunt optimaliseren en luchtbellen kunt verwijderen, die anders uw experimenten in gevaar zouden kunnen brengen.In het gecombineerde tekstprotocol vindt u de protocollen om het DNA te labelen met bioTE, wat noodzakelijk is voor de assemblage met de streptavidine-gecoate beads, evenals de protocollen om het eiwit te labelen. Ten slotte hebben we de stapsgewijze handelingen geïllustreerd om de binding en de diffusie van een enkel lactose-repressoreiwit op een uitgerekt DNA-molecuul te kwantificeren.

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een tapping mode atomic force microscoop (AFM) methode voor de visualisatie van plasmide DNA, cytoplasmatische eiwitten en DNA-eiwitcomplexen is beschreven. De methode bestaat uit alternatieve benaderingen voor het bereiden van monsters voor AFM beeldvorming volgende biochemische manipulatie. DNA met specifieke eiwit interactie regio's zijn waargenomen in de buurt-fysiologische buffer omstandigheden.

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

This video describes a method to visualize the assembly of fusion protein condensates on DNA molecules at specific loci using single-molecule imaging. These condensates are formed due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, which allow for the recruitment of RNA polymerase II and enhanced gene transcription.

Single-Molecule Imaging to Visualize Fusion Protein Condensates Assembly on DNA Curtains

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

We rapporteren een hybride ensemble- en single-molecule-assay om de beweging van fluorescerend gelabelde, volledig gereconstitueerde Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase op lineaire DNA-moleculen die op hun plaats worden gehouden in een optische val, direct in beeld te brengen en te kwantificeren.

Hybride ensemble en single-molecule assay om de beweging van volledig gereconstitueerde CMG in beeld te brengen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van diepe, whole-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met optische fotonherplaatsing, waardoor DNA-PAINT-beeldvorming mogelijk is zonder de noodzaak van aangepaste optica of complexe verlichting.

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Leer hoe je eiwit-DNA-interacties bestudeert met optische pincetten en fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt nauwkeurige observatie van enkele moleculen mogelijk voor biofysisch onderzoek.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Meer video's verkennen