Name: Confocale beeldvorming van Confined Quiescent en Vloeiende colloïd-polymeermengsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer hoe confocale microscopie fasegedrag en transporteigenschappen van colloïdale suspensies onder confinement analyseert. Deze methode onthult structurele dynamica en niet-Newtoniaanse stroming in colloïd-polymeermengsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een Universiteit van Houston Nieuwe faculteit Grant, een zaad subsidie ​​van de Texas Center for Supergeleiding, en het Fonds American Chemical Society Petroleum Research (52537-DNI).

1. Bereiding van colloïdaal polymeermengsels Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van poly (methylmethacrylaat) (PMMA) deeltjes, sterisch gestabiliseerd met poly (12-hydroxystearinezuur) en gelabeld met een fluorescente kleurstof (zoals Nile Red, rhodamine B, of fluoresceïne), die werden bereid volgens een standaard Recept 52. <ol><li> Bereid een 3:01 w / w mengsel van cyclohexylbromide (CXB) en decahydronaftaleen (DHN) als voorraad oplosmiddel. Dit mengsel nagenoeg overeenkomt met de dichtheid en brekingsindex van de deeltjes. Voeg een organisch zout, tetrabutylammoniumchloride (TBAC) 46, om het oplosmiddel in een concentratie van 1,5 mM gedeeltelijk scherm de ladingen op de deeltjes. </li><li> Om de dichtheid van de deeltjes nauwkeurig te kunnen bepalen, bereiden een suspensie bij benadering volumefractie Φ = 0,10 in de CXB: DHN oplosmiddel. Centrifugeer de suspensie bij 800 xg gedurende 75 min en voeg CXB of DHN druppelsgewijs aan het drijfvermogen te verbeterenmatching. In deze experimenten, de dichtheid van de PMMA deeltjes werd gemeten wordt ρ = 1,223 g / ml. </li><li> Bereid een geconcentreerde voorraad schorsing van PMMA deeltjes (hier, Φ = 0,40) in de CXB: DHN oplosmiddelenmengsel. </li><li> Bereid een geconcentreerde oplossing van lineair polystyreen (PS) in de CXB: DHN oplosmiddelmengsel. Hier werd een oplossing van PS molecuulgewicht Mw ≈ 3.000.000 is (gyrostraal r g = 15 nm) bereid concentratie c t ≈ 50 mg / ml. </li><li> Meng Geschikte gewichten van het deeltje, polymeer en oplosmiddel stock mengsels suspensies formuleren de gewenste concentraties van deeltjes en polymeren. Opmerking: Hier, suspensies van monodisperse deeltjes worden voorbereid tegen constante colloïdale volumefractie Φ = 0,15 en variabele polymeer concentratie in de vrije volume 53 c p = 0,25 mg / ml, en bidispersed suspensies die twee maten van colloïdale deeltjes, with elke maat waarop een afzonderlijke fluorescent label, bereid op vaste totale colloïde volumefractie Φ = 0,15, volumefractie verhouding kleine deeltjes r = 0,50 en polymeerconcentratie in het vrije volume van 5 of 25 mg / ml. </li><li> Na elke suspensie wordt bereid, voeg CXB of DHN druppelsgewijs en centrifugeer de monsters bij 800 g gedurende tenminste 75 minuten te bevestigen dat de deeltjes en clusters in de suspensie blijven drijfvermogen afgestemd. </li><li> Equilibreer alle monsters gedurende ten minste 24 uur vóór plaatsbepalingen. </li></ol> . 2 Quiescent Sample Experimenten: fasegedrag <ol><li> Om de bulkfase gedrag bepalen, fabriceren rechthoekige kamers van dekglaasjes (figuur 1a). Voor de colloïd-polymeermengsels in deze studie, kamers dikte h = 1 mm (de dikte van een microscoopglaasje set) geven massa gedrag. </li><li> Toegang tot meerdere bevallingen in een microscopie experiment, fabriceren dunne wig-vormige kamers, met een dekglaasje als spacer aan een wig (Figuur 1b). De openingshoek van de kamer is &lt;0,5 °, zodat in een gezichtsveld van de muren zijn bijna parallel. Een vertegenwoordiger kamer biedt toegang tot opsluiting diktes van h = 6 tot&gt; 100 urn. </li><li> Bouw kamers op een dekglaasje basis voor beeldvorming op een omgekeerde microscoop en afdichting met UV-uithardbare epoxy, die niet oplossen in het CXB-DHN oplosmiddelmengsel. </li><li> Afbeelding monsters met behulp van een confocale microscoop. Dit protocol toont beeldvorming met een line-scanning confocale bevestigd aan een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100x olie-immersie lens van de numerieke opening NA = 1,40. </li><li> Excite de kleurstoffen met behulp van een laserbron. Hier golflengten λ = 491 of 561 nm worden gebruikt om de fluoresceïne en rhodamine / Nile Red kleurstoffen wekken, respectievelijk. </li><li> In de punt-scansysteem, wordt een beeld door snel scannen van het brandpunt over het monster (in de x-y vlak) met de confocale software. Een twee-dimensionale afbeelding van 512 pixels x 512 pixels, die ongeveer 50 urn x 50 urn, kan in 1/32 seconde worden verkregen. Het verbeteren van de beeldkwaliteit door het gemiddelde van meerdere afbeeldingen of het verhogen van de acquisitie tijd. </li><li> Zoek de bodem van de kamer (z = 0), bijvoorbeeld door te focussen op deeltjes gehecht aan de bodem. In deze opstelling, de hoogte (z) toe met toenemende aandacht in de kamer. </li><li> Als voorbeeld, kenmerken het effect van de begrenzing op de dynamiek van de deeltjes door het verwerven van een 2-D tijdreeksen beelden (in het xy-vlak) en het middenvlak van de kamer. In een typisch experiment, 500 afbeeldingen van afmeting 512 pixels x 512 pixels worden verkregen tegen een frame rate van 1 beeld / sec (tijd spacing At = 1 sec). </li><li> Als een tweede voorbeeld, kenmerken de 3-D structuur van deeltjes door het verwerven van een driedimensionale reeks beelden (x, y, z). In een typisch experiment, tweedimensionale afbeeldingen (512 pixels x 512 pixels) zijnverworven op meerdere z posities binnen de kamer, met een constante afstand van Az = 0,2 um tussen opeenvolgende beelden door een piëzo ingesteld. Een volume stapel die een dikte van h = 30 micrometer bevat dus 151 beelden. </li><li> Lokaliseren en track deeltjes na verloop van tijd in 2-D of 3-D met behulp van-deeltje tracking software geschreven in IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, of Python 60. Deze algoritmes typisch kan de middelpunten van de deeltjes in 40-50 nm worden opgelost. Succesvolle deeltje volgen noodzaakt dat de deeltjes bewegen dan de wisselwerking afstand tussen opeenvolgende frames. </li><li> Van het deeltje posities, berekenen structurele en dynamische metrics. Drie handige metrics hier zijn de 3-D paar correlatie functie g (r) 61, de 2-D mean-squared verplaatsing (MSD) 58,62, en de 2-D zelf een deel van de van Hove correlatie functie G s ( x, t) 58. De laatste twee statistieken kan ook berekend worden in 3-D. </li></ol> . 3 Vloeiende Experimenten: Flow Eigenschappen <ol><li> Vervaardig een eenvoudige stroomcel met een glazen microcapillair met vierkante doorsnede (100 urn x 100 um) die is aangebracht teflon buis. Gebruik dekglaasjes de capillaire steunen en mechanische stijfheid, zoals in het schema in figuur 7. </li><li> Laad de colloïd-polymeer mengsel in een glazen injectiespuit. Bevestig de spuit aan een injectiepomp of een pneumatische vloeistof doseersysteem. </li><li> Monteer de stroom cel setup op de omgekeerde microscoop. De injectiespuit, flow cel en uitlaat op dezelfde hoogte om het effect van de zwaartekracht op het stromingsprofiel minimaliseren. </li><li> Controleer de stroomsnelheid van de suspensie door de stroomcel van de volumetrische stroomsnelheid (voor de spuitpomp) of de toegepaste druk (voor de drukbox). De gemiddelde snelheid van de suspensie in de microkanaal ook afhankelijk van de suspension formulering. Typische waarden van de maximale snelheid in het kwadraat microchannel hier gemeten zijn 200-2.000 um / sec. </li><li> Tijdens stroming, het verwerven van een 2-D confocale tijdreeksen bij hoge framerates. Hier, 500 beelden van afmeting 512 pixels x 512 pixels worden verkregen tegen 32 frames / sec (tijd spacing Δ t = 1/32 seconde) op verschillende hoogten boven de bodem van het microkanaal (z = 0 pm) vinden z = 5 - 50 urn. Elk beeld beslaat ongeveer de helft van de dwarsafmeting (y) van het microkanaal, zoals in de inzet van figuur 7. Indien de deeltjes zichtbaar elliptische, verhogen de framesnelheid van verwerving. </li><li> Zoals in rustige experimenten, zoekt de deeltjes in 2-D met standaard algoritmen voor het lokaliseren en volgen van deeltjes in IDL of MATLAB. Voor langzame stromen, waarin deeltjes bewegen minder dan de gemiddelde wisselwerking afstand tussen frames, gebruik het volgen algoritmen om de trajecten te verkrijgen. </li><li> Gebruik beeldcorrelatie te calcUlate de snelheidsprofielen voor snelle stromen. <ol><li> Verdeel het beeld in horizontale beelden van constante hoogte (y) langs de stroomrichting (x). Twee opeenvolgende afbeeldingen 1 I (x, y) en I2 (x, y) verschuiven laatstgenoemde beeld met een factor Ax en berekent het kruis-covariantie tussen 1 I (x, y) en I2 (x + Ax, y). </li><li> Identificeer de piekpositie van de histogram van Ax waarden kruis-covariantie tussen elk paar afbeeldingen maximaliseren om de gemiddelde snelheid advectieve op elke laterale positie y verkrijgen. Als deze verdeling is niet sterk piekte, verwerven beelden in een sneller frame rate. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Colloïdale suspensies worden op grote schaal bestudeerd als modellen voor beperkt fasegedrag, omdat microscopisch kleine colloïdale deeltjes vertonen beduidend langzamer dynamiek dan atomen en moleculen en kan dus gemakkelijk worden afgebeeld en gevolgd in de tijd 10. Voor deze fundamentele studies, het begrijpen van de werking van de wisselwerking attracties op beperkt fasegedrag biedt de mogelijkheid om fenomenen zoals capillaire condensatie en verdamping 21,22,67 verkennen. Daarnaast beperkt aan...

Dit document toont (a) confocale beeldvorming van rustende en stromende beperkt colloïd-polymeermengsels in twee en drie dimensies en (b) deeltjes-tracking en correlatie analyse van de resulterende afbeeldingen kwantitatieve informatie over het fasegedrag en stromingseigenschappen te verkrijgen. Colloïdale suspensies met aantrekkelijke interparticle interacties lijken alomtegenwoordig in technologische toepassingen als materialen voor gerichte assemblage 1-3, drug delivery 4, verbeterde herstel koolwaterstof 5-7, en energieopslag 8. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze applicaties is dat de deeltjes moet worden doorstroomd fijne geometrieën, zoals spuitdoppen, printkoppen, microkanalen, of poreuze media, en / of worden gevormd in dunne films of staven. Technieken die worden gebruikt om de structuur van microscopisch kleine colloïden in begrensde geometrieën, zoals elektronenmicroscopie 17,18, x-ray microscopie 19 en laser-diffractie m probeicroscopy 20 kan worden gebruikt om de structuur en dynamiek van deeltjes op microschaal te meten. Deze technieken hebben echter geen toegang tot de banen van afzonderlijke deeltjes, waarvan de structurele en dynamische metrieken worden berekend voor directe vergelijking met numerieke simulaties 21,22 toestaan. Confocale microscopie is een variant van fluorescentiemicroscopie die beeldvorming van dunne secties van een fluorescent monster mogelijk maakt. Voor colloïdale wetenschap 10 Deze techniek is bijzonder nuttig voor de beeldvorming diep in dichte suspensies of in drie dimensies. Particle-tracking-algoritmen 23 toegepast op twee-of drie-dimensionale tijdreeksen van confocale microfoto leveren de trajecten van alle zichtbare deeltjes. Hierdoor is de combinatie van confocale microscopie van deeltjes tracking aangebracht op het fasegedrag, structuur en dynamica van colloïdale suspensies bestuderen, inclusief bestelde kristallen 24-27 en stoornised glazen 28-31 en gels 32-35. Andere beeldanalyse algoritmes kunnen worden toegepast op deeltjes dynamiek meet van tijdreeksen van confocale microfoto. Zo kunnen diffusieve deeltje dynamiek bestudeerd door analyseren van de fluctuaties in intensiteit over de tijd via confocale microscopie differentiële dynamische 36. Wanneer de deeltjes verplaatsingen groter dan de wisselwerking afstand kan beeldcorrelatie 37 gebaseerd op stromingsvisualisatie 38-40 worden toegepast snelheidsprofielen van de deeltjes te meten. De combinatie van tracking en correlatie algoritmen heeft toegestaan ​​colloïdaal dynamiek te meten in systemen die een langzame en snelle doorstroming 11-16,41-45. We maken gebruik van colloid-polymeer mengsels als modellen voor aantrekkelijke colloïdale suspensies 9. In deze mengsels, het bereik en de sterkte van de wisselwerking aantrekkelijke mogelijkheden worden via de verhoudingvan het polymeer gyratiestraal aan de straal van de deeltjes en de concentratie van het polymeer en de elektrostatische afstoting wordt via de toevoeging van een eenwaardig organisch zout 46. Omdat de wisselwerking interacties nauwkeurig kan worden afgesteld, is het stollen van deze mengsels uitgebreid onderzocht met confocale microscopie 34,47-51. Hier laten we confocale beeldvorming en beeldanalyse 37 van rustende en stromende colloïd-polymeermengsels, waarbij het ​​colloïde volumefractie vaste gehouden bij Φ = 0,15, dat sonde het effect van de begrenzing op het fasegedrag en vloeieigenschappen van deze mengsels. Deze technieken zijn breed toepasbaar op systemen die deeltjes refractie-index zijn afgestemd en waarbij de deeltjes en / of oplosmiddel met een fluorescerende kleurstof worden gemerkt.

<table><tbody><tr><td>Cyclohexyl bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>CAS Number&nbsp; 108-85-0, Molecuulgewicht = 163,06, Gebruikt in stock solvent</td></tr><tr><td>Decahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>CAS Number 91-17-8, Molecuulgewicht = 138,25, Gebruikt in stock solvent</td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Fluorescent kleurstof</td></tr><tr><td>Fluoresceïne 5(6)-isothiocyanaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Fluorescent kleurstof</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Fluorescent kleurstof</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering&nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>DLS-apparatuur gebruikt voor deeltjesgroottemeting</td></tr><tr><td>Polystyreen&nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Polystyreen (polymeer) voor het induceren van depletie-aantrekkerkracht</td></tr><tr><td>Tetrabutyl(ammoniumchloride) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>monovalent zout</td></tr><tr><td>UV Lijm</td><td>Norland Adhesive</td><td>NOA 68T</td><td>Onderdeelnummer 68T01 (UV-uitgeharde lijm)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Eye</td><td>confocale scanner</td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Infinity</td><td>confocale scanner</td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>Omgekeerd microscoop</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5.000 rpm</td></tr><tr><td>Teflon buis</td><td>smallparts</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0,016" ID x 0,003" Wall</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 min epoxy</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>glas spuit met metalen luer lock tip</td></tr><tr><td>Spuittips&nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA precisietips&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuitpomp&nbsp;</td><td>New Era Pump System Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Programmeerbare microfluïdische pomp (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0,0001-220 g</td></tr><tr><td>PMMA-deeltjes</td><td>gesynthetiseerd</td><td></td><td>poly(methylmethacrylaat) colloïdale deeltjes</td></tr></tbody></table>

confocale beeldvorming van confined quiescent en vloeiende colloïd-polymeermengsels

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

Het gedrag van opgesloten colloïdale suspensies met aantrekkelijke interparticle interacties is essentieel voor de rationele ontwikkeling van materiaal voor gerichte assemblage 1-3, drug delivery 4, verbeterde winning van koolwaterstoffen 5-7, en vloeibare elektroden voor energie-opslag 8. Suspensies die fluorescente colloïden en niet-adsorberende polymeren aantrekkelijk modelsystemen, als de verhouding van het polymeer gyratiestraal de deeltjes radius en polymeerconcentratie hendel respectievelijk het traject en sterkte van de wisselwerking aantrekking,. Door het afstemmen van de polymeereigenschappen en de volumefractie van de colloïden, colloïde vloeistoffen, vloeistoffen clusters, gels, kristallen en glazen zijn verkrijgbaar 9. Confocale microscopie, een variant van fluorescentiemicroscopie, kan een optisch transparant en fluorescerende monster af te beelden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie in drie dimensies. In deze techniek wordt een klein gaatje of spleet blokkeert het uitgestraalde fluorescerend licht van gebieden van het monster die buiten het middelpunt volume van de microscoop optische systeem. Hierdoor wordt slechts een dunne deel van het monster in het brandvlak afgebeeld. Deze techniek is bijzonder geschikt voor de structuur en dynamica in dichte colloïdale suspensies sonde bij de enkele-deeltje schaal: de deeltjes groot genoeg worden opgelost met zichtbaar licht en diffunderen langzaam genoeg om te worden opgenomen bij typische scansnelheden commerciële confocale systemen 10 . Verbeteringen in scansnelheden en analyse algoritmes konden ook kwantitatieve confocale beeldvorming van vloeiende schorsingen 11-16,37. In dit artikel tonen we aan confocale microscopie experimenten om de opgesloten fasegedrag en de vloei-eigenschappen van colloid-polymeer mengsels sonde. We hebben eerst coll bereidenoid-polymeer mengsels die dichtheid en brekingsindex zijn afgestemd. Vervolgens brengen wij een standaard protocol voor het afbeelden van latente dichte colloid-polymeer mengsels onder wisselende opsluiting in dunne wigvormige cellen. Tot slot tonen we een protocol voor beeldvorming colloid-polymeer mengsels tijdens microchannel flow.

Om confocale beeldvorming en particle tracking tonen, hebben we het effect van de bevalling op het fasegedrag van colloid-polymeer mengsels 63-65. Voor deze experimenten het colloïde diameter is 2 a = 0,865 urn. De colloïde volumefractie werd vastgesteld op Φ = 0,15 en de polymeerconcentratie c p werd gevarieerd 0-23,6 mg / ml. Representatieve confocale beelden worden getoond in figuur 2 63, linkerkolom. Uit het deeltje posities verkregen middels het vo...

Confocale microscopie wordt gebruikt om beelden rustige en vloeiende colloïd-polymeer mengsels die worden bestudeerd als modelsystemen voor aantrekkelijke schorsingen. Beeldanalyse algoritmen worden gebruikt om structurele en dynamische parameters voor de colloïdale deeltjes die veranderingen vanwege geometrische opsluiting meten berekenen.

Confocale beeldvorming van Confined Quiescent en Vloeiende colloïd-polymeermengsels

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de veranderingen in het gedrag van de beperkte fase en de transporteigenschappen van attractieve colloïdale suspensies te kwantificeren met behulp van confocale microscopie. Dit wordt bereikt door colloïd-polymeermengsels te formuleren om attractieve colloïdale suspensies te modelleren. De mengsels worden afgebeeld en beperkt in dunne wigcellen om aan te tonen hoe beperking de structurele dynamiek en het fasegedrag van deze mengsels beïnvloedt.Vervolgens worden de mengsels gefotografeerd terwijl ze door microkanalen stromen om het effect van de aantrekkingskracht tussen de colloïden op de transporteigenschappen van de mengsels onder opsluiting te bepalen. Geautomatiseerde beeldanalyse en algoritmen voor particle tracking kunnen aantonen hoe rustige opsluiting leidt tot stolling en beeldcorrelatie. Algoritmen kunnen aantonen hoe een toenemende aantrekkingskracht leidt tot een steeds sterker non-Newtoniaans stromingsgedrag.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals elektronenmicroscopie en dynamische lichtverstrooiing, is dat het directe toegang biedt tot trajecten van individuele deeltjes, waaruit dynamische en structurele metrieken kunnen worden berekend voor directe vergelijking met simulaties. Deze standaardmethode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de zachte gecondenseerde materiefysica, zoals hoe suspensies zelf assembleren in aanwezigheid van interpartikelinteracties, of hoe solide lichte suspensies vervormen onder een aangelegde kracht of spanning. Voor dit protocol zijn PMMA-deeltjes gebruikt die zijn gelabeld met een kleurstof; raadpleeg het gekoppelde referentiemateriaal in het tekstprotocol voor standaardpreparaties.Maak een mengsel van drie op één op basis van gewicht van broy heane in deco hydro nataline lean. Voeg vervolgens tetrabutylammonium en organisch zout toe tot een concentratie van 1,5 millimolar. Het oplosmiddel komt overeen met de brekingsindex van de deeltjes en schermt hun lading gedeeltelijk af om de dichtheid van de deeltjes nauwkeurig te bepalen. Suspendeer de deeltjes in het bereide oplosmiddel in een volume-volumeverhouding van 0,1. Centrifugeer de suspensie bij 800 G gedurende 75 minuten.Controleer of de partikels na het centrifugeren niet sedimenteren. Voeg vervolgens, om te voorkomen dat de partikels bezinken, druppelsgewijs basisoplosmiddel toe om de dichtheid van het oplosmiddel aan te passen aan die van de partikels. Bereid daarna een 40% suspensie van de PMMA-partikels in het bereide oplosmiddelmengsel.Bereid daarnaast lineair polycyreen in het solventmengsel voor in een hoge concentratie. Bijvoorbeeld 50 mg/mL, berekend op basis van het molecuulgewicht en de gyratie-straal van het polystyreen. Door gebruik te maken van de geconcentreerde PMMA-deeltjessuspensie en de polystyreenoplossing kunnen suspensies worden gemaakt met de gewenste concentratie deeltjes met polymeren.Hier bevat de suspensie 15 volumeprocent PMMA-deeltjes en varieert de polymeerconcentratie van nul tot 25 mg/mL door gedispergeerde suspensies van twee PMMA-deeltjes met verschillende groottes en verschillende labels in gelijk volume. Fracties kunnen ook worden gemengd met de polymeeroplossing. Centrifugeer elke suspensie na het mengen en voeg vervolgens druppelsgewijs een oplosmiddel toe om de dichtheid van het oplosmiddel nauwkeurig af te stemmen op die van de deeltjes.Equilibreer tot slot alle monsters door de verzegelde monsters gedurende ten minste 24 uur in een tumbler te plaatsen voordat ze worden afgebeeld. Begin met het assembleren van rechthoekige kamers van glazen dekglasplaatjes. De dikte van het microscoopglas is hier één millimeter, en daarmee is ook de dikte van de kamer, wat bulkgedrag door de polymeermengsels met kraag mogelijk maakt.Indien een kamer met variabele hoogte gewenst is, maak dan dunne, wigvormige kamers met behulp van een enkel dekglas dat op een wig is geplaatst. De openingshoek van de kamer is minder dan 0,5 graden en de dikte van de kamer neemt toe van zes micron tot één millimeter. Deze configuratie maakt het mogelijk om de opsluitingsdikte continu te variëren; fabriceer de kamers zodanig dat ze op een omgekeerde microscoop kunnen worden geplaatst en verzegel ze met een UV-uithardende epoxy die bestand is tegen het gebruikte oplosmiddelmengsel van de microscoop.Hier is een line-scanning confocale scankop bevestigd aan een omgekeerde microscoop met een 100 x olie-immersielens. Met een numerieke apertuur van 1,4 worden de juiste golflengten gebruikt om de kleurstoffen te exciteren en worden afbeeldingen van 50 micron vierkant genomen bij 512 pixels vierkant. Begin met een belichtingstijd van een tweeëndertigste seconde en pas dit vervolgens aan voor de beeldkwaliteit.Lokaliseer vervolgens de bodem van de kamer; de deeltjes zullen daar aanhechten. Verplaats daarna de focus naar het midden van de kamer. Neem nu ongeveer 500 beelden op met een snelheid van één frame per seconde in het middenvlak voor 2D-analyse.Neem vervolgens voor 3D-analyse Z-stack beelden met tussenruimtes van 0.2 micron over 30 microns bij elk collateraal beeldvormingsexperiment. Het optimaliseren van de beeldvormingscondities om beelden met een hoog contrast te verkrijgen is van cruciaal belang. Analyseer de beelden met een softwarepakket voor particle tracking.Er moet een algoritme beschikbaar zijn dat de deeltjes kan oplossen tot 40 of 50 nanometers. Deeltjestracking is alleen mogelijk als de deeltjes minder bewegen dan de interpartikelaire afstand tussen opeenvolgende frames. Gebruik de volgende metrieken om de deeltjesstructuur en -dynamiek te evalueren.Een 3D-paarcorrelatiefunctie, een 2D- of 3D-gemiddelde kwadratische verplaatsing, en een 2D- of 3D-zelfdeel van de Van Hove-correlatiefunctie. Maak voor dit experiment een eenvoudige doorstroomcel van een vierkante glazen capillair van 100 microns breed. Bevestig Teflon-buisjes en gebruik glazen dekglas voor structurele ondersteuning.Laad vervolgens het colloid-polymeermengsel van belang in een glazen spuit en bevestig deze aan een doseersysteem, zoals een pomp. Monteer nu de opstelling op de omgekeerde microscoop zoals gebruikt in de vorige sectie. De flowcel van de spuit en de uitlaat moeten zo waterpas mogelijk worden gehouden.Stel de stroomsnelheid in op basis van het colloïde polymeermengsel. Voor de stroming door vierkante capillairen van 200 tot 2000 micron per seconde zijn concentraties gebruikt. Verzamel 2D-beelden, zoals beschreven in de vorige sectie, op verschillende afstanden van de kanaalbodem, variërend van vijf tot 50 micron.Als de deeltjes elliptisch lijken, verhoog dan de framerate van de acquisitie. Gebruik trackingsoftware en IDL of MATLAB om de stroming te analyseren. Het verkrijgen van subpixelresolutie bij particle tracking vereist een zorgvuldige afstelling van de trackingparameters om OID's te verkrijgen die niet in een specifieke richting bevooroordeeld zijn.Tijdens een langzame stroming. Wanneer deeltjes zich tussen frames over een afstand bewegen die kleiner is dan de interpartikelaire afstand, kunnen trajecten worden verkregen met behulp van trackingroutines bij een snellere stroming. Gebruik beeldcorrelatie om de snelheid te berekenen.Verdeel elke afbeelding in horizontale stroken in de richting van de stroming. Verschuif bij opeenvolgende afbeeldingen de tweede afbeelding zodat deze overeenkomt met de eerste en gebruik de verschuifingsafstand om de snelheid tussen beeldparen of elke onderverdeling van de oorspronkelijke afbeeldingen te berekenen. Maak een histogram van alle berekende verschuifingswaarden.Als de waarden geen sterke pieken vertonen, herhaal het experiment dan bij een hogere framerate. PMMA-deeltjes met een diameter van 0,865 microns werden gesuspendeerd in een volumepercentage van 15% in 23,6 milligram polymeer per milliliter van een mengsel van oplosmiddelen. Structurele en dynamische metrieken worden gebruikt om de beelden te evalueren, waaronder paarcorrelatie en de gemiddelde kwadratische verplaatsing.Het wijzigen van de suspensie kan de structuur en dynamiek van ingesloten suspensies beïnvloeden. Er werd bijvoorbeeld een gedispergeerde suspensie geformuleerd van deeltjes van 1,48 micron en 0,73 micron waarbij de deeltjes 15% van het volume innamen door de dikte van de insluiting te verkleinen. Er werd een vaste, colloïdale gel-fase geïnduceerd die beide soorten deeltjes bevatte; de gemiddelde kwadratische verplaatsing van de grote deeltjes nam af naarmate het systeem sterker werd ingesloten.In overeenstemming met de stollingstroom werden de eigenschappen van zwak aantrekkende en sterk aantrekkende deeltjes vergeleken. De polymeerconcentratie varieerde van 5 tot 25 mg/mL. In suspensies vertoonde de zwak aantrekkende suspensie een dichtheidsprofiel dat sterk varieerde met de positie over het kanaal.Bij een stroomsnelheid van 10 microliters per uur was het dichtheidsprofiel van de sterk attractieve suspensie nagenoeg constant over het kanaal onder dezelfde omstandigheden. Evenzo waren er verschillen in de snelheidsprofielen van deze suspensies. Zwak attractieve deeltjes kwamen dicht bij de Newtoniaanse voorspelling voor hun snelheid, terwijl sterk attractieve deeltjes licht afweken van de Newtoniaanse voorspelling voor hun snelheid, vooral dichter bij de zijwand van het kanaal waar Y gelijk is aan nul.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe confocale microscopie kan worden gebruikt om het fasegedrag en de vloeieigenschappen van colloïdale suspensies te onderzoeken door deze procedure te volgen. Andere parameters, zoals clustergroottes en fractale dimensies, kunnen worden berekend op basis van de partikelposities om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe opsluiting de vorm van de geaggregeerde clusters beïnvloedt.

confocal-imaging-confined-quiescent-flowing-colloid-polymer

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

In dit werk leggen we de fabricage en het gebruik van een microfluïdische mixer voor het mengen van twee oplossingen in ~ 8 ps. We tonen ook aan het gebruik van deze mixers met spectroscopische detectie met behulp van UV-fluorescentie en fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET).

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Niet-geroerde precipitatie polymerisatie geeft een snelle, reproduceerbare prototyping aanpak van de synthese van stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) microgels smalle grootteverdeling. In dit protocol synthese, lichtverstrooiing karakterisering en enkel deeltje fluorescentie volgen van deze microgels in een wide-field microscopie setup worden gedemonstreerd.

Gecontroleerde Synthese en Fluorescentie Tracking of Highly Uniform Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

De voorgestelde techniek zal een nieuwe, efficiënte, zuinige en niet-invasieve benadering bieden voor het in beeld brengen van de vloeistofstroom door een verpakt poederbed, wat een hoge ruimtelijke en temporele resolutie oplevert.

Zuinige beeldvormingstechniek van capillaire stroom door driedimensionale polymere drukpoeders

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch apparaat dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren. De synthese van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modelleringstechnieken maakt een flexibel systeem mogelijk dat bij uitstek geschikt is om het cellulaire cytoskelet in vitro te onderzoeken.

Ontwikkeling van een op microfluïdica gebaseerde benadering voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren

Leer hoe confocale microscopie fasegedrag en transporteigenschappen van colloïdale suspensies onder confinement analyseert. Deze methode onthult structurele dynamica en niet-Newtoniaanse stroming in colloïd-polymeermengsels.

Confocale beeldvorming van Confined Quiescent en Vloeiende colloïd-polymeermengsels

Meer video's verkennen