Name: High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer een high-throughput screeningsprotocol voor kwantitatieve expressie en zuivering van oplosbare disulfide-rijke eiwitten in E. coli met behulp van geautomatiseerde vloeistofafhandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door The VENOMICS project, Europese projectsubsidie ​​N ° 278346 via het Zevende Kaderprogramma (KP7 GEZONDHEID 2011-2015). De VENOMICS project is een samenwerking tussen verschillende onderzoeksinstellingen en bedrijven in Europa: AFMB, Aix-Marseille Universite (Frankrijk), CEA Saclay (Frankrijk), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanje), de Universiteit van Luik (België), VenomeTech (Frankrijk), Vitamib (Frankrijk), Zeeland Pharma (Denemarken) Dit werk werd ondersteund door de Franse infrastructuur voor Integrated Structural Biology (Frisbi) ANR-10-InSb-05-01. De auteurs willen ook graag de heer Jeremy Turchetto bedanken voor het helpen met de voorbereidingen voor de opnames van de video.

<ol><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li>
<li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli%3A+advantages+of+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li>
<li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li>
<li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li>
<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
<li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37(2013).</li>
<li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusions+to+maltose-binding+protein%3A+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li>
<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
<li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865(2013).</li>
<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
<li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+%28Collection+Rencontres+en+Toxicologie%2C+Publications+de+la+SFET%2C+Chatenay-Malabry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+and+new+technologies+in+toxinology%22%5BJournal%5D)">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li>
<li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARINE-EXPRESS%3A+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact.%22%5BJournal%5D)">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45(2010).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 Forthcoming.</li>
<li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li>
<li>Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaez%2C+NJ+%22Structural+Genomics%3A+General+Applications+%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22">Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology</a>. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+%28R%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li>
<li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+pharmacology+under+flow%3A+automation+via+well-plate+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li>
<li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+approach+to+protein+crystallization%3A+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li>
<li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZanier%2C+K+%22Structural+basis+for+hijacking+of+cellular+LxxLL+motifs+by+papillomavirus+E6+oncoproteins%22">Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins</a>. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).</li>
<li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P1%27+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li>
<li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli%3A+becoming+faster+and+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RF+cloning%3A+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er bestaat geen universele protocol voor de expressie van oplosbare, gevouwen, functionele eiwitten. Om kosten-en tijd-efficiënt zijn, de meeste laboratoria of eiwit kernfaciliteiten werken met meerdere doelen te gebruiken dan ook de hoogste throughput eiwit expressie screening om de beste &#39;generieke&#39; combinatie van variabelen om een ​​oplosbare actieve eiwit te verkrijgen voor de meerderheid van de doelen te vinden. We hebben DsbC geïdentificeerd als een algemeen toepasbaar fusiepartner voor oplosbare expressie van disulfide-rijke peptiden en proteïnen 11. Met DsbC fusies en high throughput methoden binnen een week de oplosbare expressie van meerdere doelen kunnen worden waargenomen 11 en aanvullende variabelen, zoals beschreven in de inleiding, kan worden gescreend in latere rondes op de doelen die verdere optimalisatie vereisen. De hierin beschreven protocollen worden gericht op de expressie van disulfide-rijke eiwitten en peptiden. Voor gebruikers die expruk niet-netvormig eiwitten in een high throughput manier, de bijbehorende protocollen zijn eerder gepubliceerd en kan elders 22,24 worden gevonden. De high throughput opzet is ideaal voor een aantal toepassingen, waaronder het screenen van een groot aantal verschillende eiwitten voor oplosbare expressie en screening van een groot aantal expressieconstructen (waaronder verschillende fusie-tags) voor verscheidene doelgenen tegelijk ( of meerdere expressieconstructen voor een enkel doel) om slagingspercentages te verbeteren. Het platform kan ook worden gebruikt voor benchmarking en validering van nieuwe protocollen op een groot aantal doelwitten. Andere toepassingen omvatten het screenen van varianten van een moeilijke doel, bijvoorbeeld alle orthologen of leden van dezelfde familie, of het succes van de productie van een paneel van mutanten van een enkel doel in een experiment getest. Dit protocol is ook gebruikt in combinatie met co-expressievectoren (with een gelabeld eiwit) om de uitklap en voorlopige karakterisatie van eiwit-eiwit complexen vervolgens grondiger biofysische analyse om de juiste complexvorming en stoichiometrie 33 bevestigen mogelijk. De hoeveelheid eiwit gezuiverd is soms geschikt voor micro-assays (functionele testen, eiwit-DNA 34 of eiwit-eiwit interactie assays). Er zijn verschillende voordelen voor de high throughput screening strategie expressie: (i) het vermogen om een ​​groot aantal doelwitten te testen of een groot aantal variabelen in een enkel experiment, (ii) beperkt batch-to-batch variatie, (iii) de eenvoud en het gemak van het werken op een kleinere schaal met behulp van diepe putten, (iv) schaalbaarheid en reproduceerbaarheid op grotere schaal, (v) de mogelijkheden voor automatisering, en (vi) de eenvoud van tracking en handling (geen etikettering van de afzonderlijke buizen, minder fouten ontstaan ​​bij gebruik van de plaatformaat dan bij de behandeling van individuele buizen in het mengen of uitwisselen van klonen). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hoewel niet in het protocol besproken, zijn er een aantal belangrijke overwegingen voor de bereiding van de proef die hieronder kort worden besproken. Voor een nadere toelichting zie onze vorige publicatie 24. Voor een maximale efficiëntie, is het nuttig om een geschikt systeem voor hoge doorvoer klonen hebben, naar de sub-klonen van grote aantallen doelen te vereenvoudigen. Voor de eerste fase van het VENOMICS project maken we gebruik van de veelzijdige Gateway recombinatie systeem 25 dat subklonering mogelijk maakt in elke bestemming vector in een tempo van honderden klonen per week. Protocollen voor Gateway recombinatie klonen is te vinden op de website van Invitrogen. Andere alternatieven voor high throughput klonen omvatten ligatie-onafhankelijke klonen (LIC) 35,36 en-beperking free (RF) klonen 37. Er zijn meerdere manieren om het doel genen te verkrijgen voor expressie, onder meer door PCR uit template-DNA, van instapniveau kloon collecties ofsynthetische genen, die is gekozen voor het VENOMICS projectstrategie. Synthetische genen kunnen worden besteld met recombinatie locaties aan weerszijden van het gen en gen-synthese maakt een eenvoudige codonoptimalisering van de doelgen sequentie (zeldzame E. coli codons sluiten). Dit is aanbevolen maar niet essentieel. Voor objecten zonder codonoptimalisering dat een groot aantal zeldzame codons, 2 Rosetta (DE3) pLysS (welke tRNA draagt ​​voor zeldzame codons die niet hoog tot expressie in E. coli) bevatten, kunnen beter geschikt zijn dan BL21 (DE3) pLysS. Hoewel er stammen beschikbaar die de reductie van disulfide bindingen in de normaal reducerende omgeving van het cytoplasma beperken, in onze handen zij niet zo succesvol als normale E. geweest coli stammen 11. Analytische weegschaal affiniteitszuivering wordt uitgevoerd vanaf de testexpressie culturen om de oplosbare fusie-eiwitten herstellen en kwantificeren opbrengsten. Kwantitatieve gegevens kan worden verkregen op the oplosbare opbrengst van fusie-eiwitten die binnen een bereik van 0,1-100 mg / l cultuur. Als een doel is niet oplosbaar, kunnen alternatieve expressie en inductie temperaturen, stammen of media worden getest voor verschillende fusiepartners worden nagestreefd. Voor oplosbare expressie van disulfide-rijke eiwitten, eerder gerangschikt we het effect van fusiepartners als DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-tag voor cytoplasmatische expressie 11. Periplasmische meningsuiting is een andere mogelijkheid dat de succesvolle vouwen van disulfide-rijke doelen kan helpen. Het periplasma is minder reducerende omgeving dan het cytoplasma en bevat nuttige redox chaperones disulfide binding staan. DsbC, DsbA en MBP-eiwitten zijn gewoonlijk gelokaliseerd in het periplasma van de periplasmatische signaalsequenties. Dit biedt de mogelijkheid om deze tags te benutten om de disulfide-rijke doelstellingen om de periplasmaruimte sturen teneinde vouwen helpen. Voor hardnekkige targets, zou de volgende stap om purify de onoplosbare HIS-gelabeld doelwit van insluitingslichamen, oplosbaar te maken en opnieuw te vouwen (dit is buiten het bestek van dit protocol en zal hier niet besproken 3 9). Dit kan relatief eenvoudig voor doelen met slechts een of twee disulfidebindingen, maar wordt steeds moeilijker naarmate het aantal disulfidebindingen toeneemt. Alternatief, en met name voor eiwitten en peptiden met vier of meer disulfidebindingen, kan het gunstig om complexere productiesystemen zoals gist, insecten of zoogdierlijke expressie proberen. Met de vooruitgang in miniaturisatie en automatisering, zullen HTP elektrofysiologie lab-on-a-chip technologie 28 ongetwijfeld de weg van de toekomst voor functionele analyses zijn. We voorzien dat voor de meeste doeleinden (misschien met uitzondering structurele studies) zal de noodzaak voor grootschalige kweken ontkrachten. Kleinschalige kweken niet alleen nuttig voor het screenen van expressie omstandigheden, maar ook in staat om suf biedendoende hoeveelheden monster voor deze geminiaturiseerde functionele assays. De mogelijkheid om meerdere doelen gelijktijdig produceren in voldoende hoeveelheden voor functionele karakterisatie de kosten van het kweken en gebruiken van deze soort platforms verlagen Expressie en karakterisering van recombinant eiwitten meer tijd en kosten-effectief. De protocollen die hierin zijn toegepast om de expressie van disulfide-rijke peptiden en eiwitten in de beginfase van de Europese FP7 VENOMICS project. Vergiften zijn een uitstekende bron van bioactieve peptiden die vaak interessante farmacologische potentie. Echter, de productie is een uitdaging vanwege hun complexe disulfide-binding patronen en kleine omvang. Met behulp van high-throughput platformen zoals die hierin beschreven, het VENOMICS project heeft tot doel een bibliotheek van 10.000 nieuwe gif peptiden genereren om de diversiteit in de natuur waargenomen reproduceren. Deze bibliotheek wordt benut voor de karakterisering van disulfide-rich peptiden met potentiële farmacologische of therapeutische toepassingen met het doel de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Het platform wordt momenteel gebruikt voor benchmarking en valideren van nieuwe protocollen voor gebruik in de VENOMICS project.

Gemotiveerd door de vooruitgang van de genomica en versneld tempo van de ontdekking van nieuwe eiwitten, zijn hoge doorvoer leidingen ontwikkeld om de traditionele benaderingen voor de screening en identificatie van optimale eiwitproductie strategieën parallelize. Potentiële variabelen te optimaliseren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, variërende expressie stammen 1,2, temperatuur 3,4, 2,3 media, doel varianten 5, fusiepartners 6-13, co-expressie met chaperones 14,15, cytoplasmatische of periplasmische expressie 16-18, en zuivering bufferbestanddelen 3. Door de implementatie van high-throughput benaderingen, veel variabelen of veel doelen kunnen parallel worden getest met een hoog rendement, terwijl het beperken van batch-to-batch variatie. In onze ervaring, de strategie geeft ook goede reproduceerbaarheid bij opschaling met dezelfde cultuur (temperatuur, media, airconditioning, enz.) en zuivering omstandigheden (dezelfde resin, buffers, enz.). Verschillende high throughput platforms zijn in het afgelopen decennium de voorwaarden bepalen voor oplosbare eiwitexpressie, namelijk door het variëren van parameters als fusiepartners, expressie stammen of temperatuur 19-23. We hebben onlangs gebruikten de high throughput screening benadering voor de expressie van oplosbare disulfide-rijke eiwitten 11. De geselecteerde eiwitten waren niet alleen giftig bronnen, maar ook disulfide-rijke remmers van diverse soorten waaronder planten, varkens, koeien en mensen. Het experiment werden de effecten van 12 verschillende fusiepartners en drie verschillende expressie spanningen op de oplosbaarheid en vouwing van 28-disulfide verknoopt eiwitten. We hebben aangetoond dat het gebruik van DsbC als fusiepartner voor de productie in de stam BL21 (DE3) pLysS enorm outproduced (in zowel opbrengst en het aantal oplosbare eiwitten verkregen) een andere combinatie van stam en fusie getest 11. Deresultaten van dit experiment vormde de basis voor het aanpassen van onze oorspronkelijke algemene hoge doorvoer pijpleiding (die is gebruikt voor de expressie screening van een groot aantal eiwitten) 22,24 in een meer geschikt voor de expressie van disulfide-rijke doelen. Disulfide-rijke eiwitten uit dierlijke giffen zijn van bijzonder belang. Vergiften zijn een complex mengsel van bioactieve peptiden en eiwitten, met potentiële waarde farmacologisch en therapeutisch. Expressie van disulfide-binding bevattende eiwitten is niet triviaal. Deze eiwitten bevatten in het algemeen tussen 6:59 disulfidebindingen en worden geoxideerd met de juiste disulfide-binding patronen om actief te zijn. Momenteel is het platform wordt gebruikt voor het screenen van de expressie van een groot aantal disulfide-rijke dierlijke eiwitten gif kader van KP7 Europese VENOMICS Project (www.venomics.eu) en benchmarking nieuwe protocollen voor hoge doorvoer expressie van duizenden doelen . Hier, een geautomatiseerde methodeis voorzien high throughput kleinschalige expressie screening en zuivering (zie figuur 1) die aan disulfide-rijke dierlijke eiwitten gif. De strategie voor disulfide rijke peptiden en eiwitten gebruikt een HIS-tag voor zuivering en de redox-actieve fusiepartner, DsbC, creëren splitsbare HIS-DsbC fusies met de eiwitten (zie figuur 2). Hoewel de focus van de protocollen die hierin is automatisering met behulp van een vloeibare handlingrobot en HTP elektroforese, deze methoden zijn ook geschikt voor een high throughput handmatige aanpak, wat betekent dat zelfs laboratoria met een basisconfiguratie kunnen profiteren van de protocollen zonder enige voorwaarde voor dure apparatuur . Handmatige protocollen voor transformatie zuivering en analyse (niet specifiek voor disulfide-rijke eiwitten) zijn elders gepubliceerd 24 en wordt hier niet herhaald. De doorvoer van de handmatige procedure (van expressie kloon, geproduceerd door recombinatienationale klonen 25, de analyse van oplosbaar eiwit levels) is 96 (met SDS-PAGE detectie) of 384 (4 x 96, met dot-blot en SDS-PAGE 26) culturen per week (zie figuur 1). Dit kan worden verhoogd als die in een semi-geautomatiseerde manier (met behulp van een vloeibare handlingrobot en dot blot 26 of HTP elektroforese, zoals met een schuifmaat GXII LabChip systeem 22 analyse van de resultaten) tot maximaal 1.152 (12 x 96) culturen parallel dan een week, zoals hierin beschreven. Het kweken wordt uitgevoerd in deepwell 24 (DW24) formaat zodat regelmatig schudden incubators kan in tegenstelling culturen gekweekt in deepwell 96 (DW96) formaat, dat het gebruik van korte orbitale snelle schudden incubators voldoende beluchting noodzakelijk (schudden 800 rpm). Het gebruik van auto-inductie media 27 vereenvoudigt ook expressie, waardoor de handleiding inductie stap. Zelfs wanneer laboratoria vooraf gedefinieerde expressie en puri maken al gebruikficatie omstandigheden kunnen deze direct in de HTP systeem overgebracht gewoon efficiëntie. Een gedetailleerd schema van de high throughput screening pijpleiding disulfide-rijke eiwitten wordt verschaft in Figuur 3. De parameters geschrapt werden geselecteerd op basis van uitgebreide screening experimenten 11, 22, waardoor we de nuttigste voorwaarden voor eiwitproductie te kiezen. Karakterisering kan worden uitgevoerd op gelabelde eiwitten direct gezuiverd uit kleinschalige uitingen in modelstudies waar tientallen microgram steekproef voldoende is, of voor gevoelige functionele assays en bindingsbepalingen (bijvoorbeeld een laag volume HTP patchklem systemen 28). Hetzelfde kan ook worden uitgevoerd op de ongemerkte doelstellingen na splitsing, mits de tag protease verwijderd (bijvoorbeeld door omgekeerde fase HPLC). Kwaliteitscontrole kan ook worden uitgevoerd door massaspectrometrie (om de verwachte grootte en oxidatie st bevestigenaten) of chromatografische methoden (om de zuiverheid of heterogeniteit te bevestigen) 29. Soms taggen decollete is niet nodig of zelfs ongewenst (vooral bij slecht oplosbare eiwitten 30,31), dus in dit protocol decollete is optioneel. Ongeacht, alle constructen is er een TEV protease splitsingsplaats (ENLYFQ / [G] 32) direct voorafgaand aan het doelgen natief eiwit na splitsing (zie figuur 2 en discussie). Bij splitsing van het fusie-tag gewenst, kan splitsing worden getest (de elutie fractie of &quot;over kolom) en het kleine schaal efficiënt analyseren optimale voorwaarden indien nodig en het verkrijgen van betrouwbare schattingen van de opbrengsten voor verdere opschaling experimenten. Er zijn twee mogelijkheden voor de hoeveelheid korrels tijdens de affiniteitszuivering, afhankelijk van de doelstellingen en verwachtingen van het experiment. Om te kunnen om zo veel eiwit te vangen mogelijk (te zuiveren voor proef testen of MS, of extrapolaten opschaling rente) een eindvolume van 200 pl hars te gebruiken, waardoor detectie van oplosbaar eiwit in het traject van 1-100 mg / L kweek voor verzadiging van het systeem (zie protocol (A) in paragraaf 8.1) . Indien het doel van het experiment is de detectie van geringe hoeveelheden oplosbare eiwitten dan een eindvolume van 50 pl hars geschikt is, waardoor detectie van oplosbaar eiwit in het traject van 0,1-25 mg / L kweek (zie protocol (B ) in paragraaf 8.2). De productie kan worden opgeschaald eventueel tot milligram hoeveelheden gezuiverd doelen te vinden voor verdere structurele en functionele studies met de geïdentificeerde voor oplosbare expressie voorwaarden. De details van opschaling protocollen gebruikt AFMB zijn elders 22,24 besproken. Verdere details aan de experimentele opstelling, kritische stappen in het protocol relevant zijn wijzigingen en trouble-shooting en de beperkingen van de techniek die in de schijfussion. Lees de discussie alvorens tot experimenten. Gedurende de protocollen we verwachten slagingspercentage van 90% bij elke stap (bijvoorbeeld ten minste 90% van de kweken moet groeien op ieder stap). Als het succes van een stap in de proef beneden 90% van de monsters verwijderd en het experiment wordt herhaald voor de volledige collectie van constructen. Echter, dit succes is niet van toepassing op het aantal constructen die als oplosbare eiwitten of het aantal constructen die klieven met 100% rendement expressie, omdat dit sterk afhankelijk van de geteste eiwitten zijn. De specifieke details voor de set-up van de robot werktafel zijn voorzien voor elk protocol (zie ook figuur 4), maar ze kunnen worden aangepast zoals vereist voor alternatieve werktafel set-ups. De robot hardware (Tecan) bestaat uit een 96-meerkanaals arm (MCA96), robot manipulator (Roma) en de 8-kanaals liquid handling hoofd (Liha). Alle stappen met behulp van de MCA96 kan ook worden uitgevoerd met de liha als een MCA96 niet beschikbaar, maar ze zullen langer duren omdat de liha moet worden gewassen tussen de stappen. Terwijl de robot is technisch niet een steriele omgeving, de opname van antibiotica algemeen voor zorgen dat er geen problemen met verontreinigingen of steriliteit.

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>Protocollen kunnen worden aangepast aan elke vloeistofbehandelingsrobot met een vacuümverdeler voor platen. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&amp;ID=5270&amp;Menu=1&amp;Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96-well PCR (PCR96) platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr><tr><td>LB-medium</td><td></td><td></td><td>Geautoclaveerd voor steriliteit.</td></tr><tr><td>Antibioticumvoorraden</td><td></td><td></td><td>Kanamycine (50 mg/ml), ampicilline (100 mg/ml), chlooramfenicol (34 mg/ml in ethanol), voorraden bewaren bij &minus;20 &deg;C. Gebruik een 1:1.000 verdunning.</td></tr><tr><td>Diep-wel 96 (DW96) plaat met 2,42 ml volumecapaciteit</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>Geautoclaveerd voor steriliteit. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr><tr><td>Expressievectoren</td><td></td><td></td><td>Voor de expressie van doelconstructies. Bewaar bij &minus;20 &deg;C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS competente cellen</td><td></td><td></td><td>Of alternatieve E. coli expressiestam naar keuze van de gebruiker. Bewaar bij &minus;80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Breathseal ademende zelfklevende film</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>PCR-machine met 96-well plaatblok</td><td></td><td></td><td>Voor de transformatie heatshock en het koken van SDS-PAGE/Caliper monsters.</td></tr><tr><td>24-well steriele weefselkweekplaten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr><tr><td>LB-agar</td><td></td><td></td><td>Geautoclaveerd voor steriliteit.</td></tr><tr><td>200 µl steriele wegwerptips</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&amp;ID=4118&amp;Menu=1&amp;Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron schuddende incubator, met 3 mm worp</td><td>Infors</td><td>AJ103</td><td>Niet essentieel, een reguliere schuddende incubator kan ook worden gebruikt. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr><tr><td>Plaatincubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiterplaat</td><td></td><td></td><td>Voor glycerolvoorraden en elutie met behulp van zuiveringprotocol B.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td></td><td>Voor de bereiding van glycerolvoorraden.</td></tr><tr><td>200 µl wegwerptips</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&amp;ID=4118&amp;Menu=1&amp;Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Zelfklevende tapepads&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Group</td><td></td><td>Of gelijkwaardig microbieel desinfectiemiddel.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 medium</td><td></td><td></td><td>Zie Tabel 1 voor recepten van componenten.</td></tr><tr><td>Diep wel 24 (DW24) platen, 10 ml capaciteit</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>Geautoclaveerd voor steriliteit. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>Vlakbodem, heldere microtiterplaat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Voor absorptiemetingen. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr><tr><td>Plaatleesspectrofotometer</td><td></td><td></td><td>Optioneel. Voor het meten van OD600 van culturen.</td></tr><tr><td>Centrifuge met rotor voor diep wel platen&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Geschikt voor 3.800 x g.</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml in water. Bewaar bij &minus;20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Imidazool ACS-kwaliteit</td><td>Merck</td><td>IX0005-1</td><td>Er moet een imidazool van hoge kwaliteit worden gebruikt zodat het de A280-metingen voor het berekenen van de eiwitopbrengst niet zal verstoren.</td></tr><tr><td>Lysebuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool pH 8 bevattend 0,25 mg/ml lysozym (of uw voorkeursbuffer). Voeg elk keer lysozym toe uit de voorraden en bewaar niet voor langere periodes.</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaatsonificator (Ultrasoon verwerker XL, aangepast voor diep wel platen)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>Niet essentieel. Lysozym alleen is normaal gesproken voldoende voor bijna complete lyse.</td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg/ml voorraad in water, filter gesteriliseerd. Bewaar aliquoten bij &minus;20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M voorraad in water, geautoclaveerd.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE of Caliper monsterbuffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bindingbuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool pH 8 (of uw voorkeursbuffer). Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Wasbuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazool pH 8 (of uw voorkeursbuffer). Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Elutiebuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool pH 8 (of uw voorkeursbuffer). Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>96-well Receiver/Filter Plaat 20 µm, 1,8 ml capaciteit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 µl wegwerptips met brede boring</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 34

high throughput screening kwantitatieve expressie en zuivering toegepast op recombinant disulfide-rijke venom eiwitten die in<em&gt; e. coli</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is de meest gebruikte expressiesysteem voor de productie van recombinante eiwitten voor structurele en functionele studies. Echter, zuiveren eiwitten soms moeilijk omdat veel eiwitten worden uitgedrukt in een onoplosbare vorm. Bij het werken met moeilijke of meerdere doelen is daarom raadzaam om high throughput (HTP) eiwitexpressie screening op kleine schaal (1-4 ml culturen) gebruiken om snel de voorwaarden voor oplosbare expressie te identificeren. Om te gaan met de verschillende structurele genomics programma&#39;s van het lab, een kwantitatieve (binnen een bereik van 0,1-100 mg / L cultuur van recombinant eiwit) en HTP eiwitexpressie screening protocol is geïmplementeerd en gevalideerd op duizenden eiwitten. De protocollen zijn geautomatiseerd met gebruik van een vloeistofverwerking robot, maar kan ook handmatig worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur. Disulfide-rijke gif eiwitten winnensteeds meer erkenning voor hun potentieel als therapeutische drug leads. Zij kunnen zeer krachtige en selectieve, maar hun complexe disulfidebinding netwerken ze moeilijk te produceren. Als lid van de Europese FP7 Venomics project ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), onze uitdaging is om succesvolle productie strategieën te ontwikkelen met het doel de productie van duizenden nieuwe gif eiwitten voor functionele karakterisering. Geholpen door de redox eigenschappen van disulfidebinding isomerase DsbC, passen wij onze HTP productie pijpleiding voor de expressie van geoxideerd, functionele gif peptiden in E. coli cytoplasma. De protocollen zijn ook voor de productie van verschillende disulfide-rijke eiwitten. Hier laten we pijpleiding voor het produceren van dierlijke eiwitten gif. Met de hierin beschreven protocollen is het waarschijnlijk dat oplosbaar disulfide-rijke eiwitten worden verkregen in slechts een week. Zelfs een kleine schaal, is er de mogelijkheid om e gebruikene gezuiverde eiwitten voor het valideren van de oxidatietoestand door massaspectrometrie, voor de karakterisering in pilotstudies of voor gevoelige micro-assays.

Representatieve resultaten worden getoond in Figuur 6 voor de expressie screening van 96 disulfide-rijke eiwitten van de VENOMICS pijpleiding. De eiwitten zijn gerangschikt toenemend aantal disulfidebindingen vervolgens toenemend aantal resten. De peptiden werden uitgedrukt in het cytoplasma met een HIS-tag en DsbC fusiepartner. Bij gebruik van de aanbevolen kweekomstandigheden, wordt een OD 600 van 12 normaal bereikt. De peptiden werden gezuiverd met behulp protocol 8.2-B met een eindvolume van 50 pl nikkel affiniteitshars, dus maximaal ~ 25 mg / l fusie-eiwit kan worden gedetecteerd in dit experiment. Figuur 6A toont de resultaten van de elektroforese Caliper LabChip-systeem (met de fusie voor splitsing) en het scoresysteem gebaseerd op extrapolatie op in mg / L kweek van het fusie-eiwit (in niveaus van 0,1 tot 2 mg / L kweek, 2 10 mg / L kweek, 10 tot 25 mg / l cultuur en geen<html> t gedetecteerd.) Merk op dat de gesplitste DsbC tag normaal draait op ongeveer 32 kDa, in plaats van 27 kDa zoals verwacht. Ook de DsbC fusies ook draaien rond 5 kDa hoger dan verwacht. Voor een groot deel van de doelstellingen zien we niet alleen de intacte fusie (bovenste band), maar ook de fusiepartner alleen (onderste band). Voor sommige van deze doelstellingen optimale kweekomstandigheden de verhouding van het intacte fusie (bovenste band) vergeleken DsbC alleen waardoor een toename van de uiteindelijke opbrengst kunnen verbeteren. Het scoresysteem is gebaseerd alleen op het niveau van intacte fusie. Slechts 16 van de 96 proteïnen kon niet worden gedetecteerd op het fusie-niveau. Dit betekent een algehele succes niveau van 83%. Van de 80 proteïnen die kunnen worden gedetecteerd, 45 daarvan werden gedetecteerd in concentraties van meer dan 2 mg / L kweek (56%). Afhankelijk doel en fusie eiwit opbrengsten zijn gewoonlijk in het traject van 2-100 mg / L kweek (hoewel in dit voorbeeld met het protocol 8.2 B maximaal ~ 25 mg / l fusie-eiwit kan worden gedetecteerd). t &quot;&gt; Analyse van het succes door het aantal disulfide bindingen (figuur 6B) toont redelijk succes voor alle getallen disulfidebindingen getest (tussen 1 en 7), met de laagste succesniveau zijnde 66% voor doelen die 6 disulfide obligaties. Een analyse van de verdeling van uitdrukkingssucces basis van iso-elektrische punt en het aantal resten (figuur 6C) vertoont geen bijzondere voorkeur voor de techniek, zowel met succes tot expressie doelen en doelstellingen die niet werden waargenomen verspreid over de plot. Figuur 6D toont een voorbeeld van de massaspectrometrie resultaten van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) voor een enkel doel, vóór en na reductie van het monster met DTT. Normaliter zou een exhaustieve massaspectrometrie niet te worden uitgevoerd (een deelmonster niet moeten worden geanalyseerd), maar met het oog op een grondige demonstration we hebben laten zien beide resultaten. De getoonde doel is een 5,7 kDa disulfide-rijk gif eiwit met 4 disulfidebindingen. Het spectrum links toont de resultaten voor het eiwit voorafgaand aan reductie met DTT, aangezien het na splitsing ontziltingsinstallatie zonder verdere tussenkomst. Het spectrum aan de rechterkant toont het eiwit na reductie met DTT gevolgd door ontzouten om overtollig DTT verwijderen. De ionen die overeenkomt met de experimentele massa zijn aangegeven met pijlen op het spectrum en de aanduiding voor elk ion wordt getoond in groen. De experimentele massaspectrometrie berekend voor deze ionen (voor het eiwit voorafgaand aan reductie (-DTT) en na verlaging (+ DTT)) worden weergegeven in de tabel. De massa (5709,6 Da voor de steekproef voor de verkorting en 5717,6 Da voor het gereduceerde monster) vertonen een massa verschil van 8 Da. Een massaverschil van 2 Da overeen met de aanwezigheid van geoxideerd 1 disulfidebinding derhalve een massaverschil van 8 Da de aanwezigheid van 4 disulfide bindingen (zoals verwacht) inde niet-gereduceerd monster. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Schematische weergave van de hoge doorvoer expressie onderzoeksprotocol Met dit protocol. Kan 96-384 omstandigheden worden beproefd door een persoon in een week met handmatige methoden of tot 1,152 voorwaarden beschreven semi-geautomatiseerde apparatuur. Expressieplasmiden zijn opgebouwd volgens een recombinatie klonering technologie, zodat vele doelstellingen kunnen worden gesubkloneerd in een keer. Zodra oplosbare expressieomstandigheden zijn geïdentificeerd en splitsing uitgevoerd, indien gewenst, het eiwit kan overgaan tot kwaliteitscontrole oxidatie en zuiverheid microassays en / of grote schaal controleren. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; Figuur 2. Schematische universele recombinatorisch kloneren en construct ontwerpen. Van doelvermelding klonen, verschillende expressievectoren kan worden gesubkloneerd in een experiment in een high throughput wijze (tot 6 x 96 klonen inschrijving in een week). De expressie gebrachte eiwit codeert voor een HIS-tag voor nikkel affiniteit zuivering. De DsbC (ontbreekt de periplasmatische signaalsequentie voor cytoplasmatische expressie) fusiepartner gebruikt om oplosbaarheid en / of steun vouwen en correct oxidatie van het doeleiwit verhogen. Merk op dat het doelwit coderende sequentie een N-terminal TEV protease ter (ENLYFQ) moet bevatten als tag splitsing gewenst. De inzet linksboven toont de productie van het item klonen met een donor vector en doelsequenties, die kan worden verkregen door PCR of gensynthese. Entry klonen kunnen ook worden verkregen uit commerciële binnenkomst kloon collecties. Meerdere recombinationele klonen systemen zijn beschikbaar, maar maken we gebruik van de Gateway system, zoals weergegeven in het schema. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3. High throughput screening pijpleiding meerdere disulfide-rijke doelen. Doelen worden initieel uitgedrukt als HIS-DsbC fusies in het cytoplasma van BL21 (DE3) pLysS E. coli bij 37/17 ° C met behulp van auto-inductie medium (Zyp-5052). Zuivering wordt uitgevoerd op nikkel hars gevolgd door detectie van oplosbare constructen door HTP elektroforese (of dot blot / SDS-PAGE). Als de eerste ronde van expressie screening mislukt, worden alternatieve kweekomstandigheden geprobeerd. Als constructen oplosbare eiwitten in voldoende hoge opbrengsten, microassays en kwaliteitscontrole kan worden uitgevoerd en desgewenst kan grootschalige productie worden nagestreefd. Voor objecten waar oplosbare opbrengst niet hoog genoeg zijn, kan expressie screening verder met alternatieve strains en temperaturen dan andere fusiepartners en periplasmische expressie. Optionele stappen zijn aangegeven met stippellijnen dozen. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4. Robot Werktafel instelling van de HTP platform. De indeling op onze vloeistofverwerking robot werktafel getoond, hoewel alternatieve werktafel kan worden gebruikt, mits deze soortgelijke sites beschikbaar. De opstelling bestaat uit een wassen station (WS) voor de (8-kanaals liquid handling hoofd (liha)), twee microplaat dragers met 4 posities elk (MP4, posities 1-4 en 5-8), een vacuüm zender met 2 standen (Te-stofzuigers, posities 9 en 10), een microplaat drager met 3 standen (MP3, posities 11-13), twee plaat shakers met 2 posities elk (Te-Shakers, posities 14-15 en 16-17) en een drager voor wegwerp tips met 3 standen (Diti, posities 18-20). Naast dere twee hotel dragers voor diepe putjes en een voor microplaten (niet getoond). De hardware op de vloeistof handlingrobot geïnstalleerd is een 96-meerkanaals arm (MCA96) voor gebruik met disposable tips, een 8-kanaals liquid handling hoofd (liha) met vaste tips en een robot manipulator (Roma) die platen / apparatuur beweegt rond op de werktafel. De nummering van de posities aangeduid gehele protocol. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5. Schematische voor het overbrengen van een 96-well plaat in vier 24-well platen. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figuur 6. Representatieve resultaten worden getoond voor de expressie scherm van 96 disulfide-rijke venom proeiwitten. De eiwitten werden als HIS-DsbC fusies in het cytoplasma en gezuiverd met 50 pi nikkel hars (Protocol 8.2-B). A) expressiescreenen resultaten tonen virtuele gel en vergroot tot de expressieopbrengst. Het contrast in de virtuele gel is aangepast lane naar lane ter compensatie van zeer zwakke of intense banden. Merk op dat voor sommige doelen twee banden te zien, de bovenste band overeenkomend met de intacte fusieproteïne en de onderste band overeenkomend met het fusie-tag alleen. B) Het aandeel eiwitten aanwezig op elk expressieniveau in vergelijking met het aantal disulfidebindingen in het eiwit. Het werkelijke aantal eiwitten in elke groep overlayed op de grafiek. C) De verdeling van expressieniveaus basis van iso-elektrisch punt (pI) en het aantal resten. D) Een voorbeeld van de massaspectrometrie resultaten voor een 5,7 kDa disulfide-rijk venoom eiwit met 4 disulfidebindingen. Het spectrum vande linkerkant toont het eiwit voorafgaand aan reductie met DTT en het spectrum aan de rechterkant toont het eiwit verminderd met DTT en vervolgens ontzout. De ionen die overeenkomt met de experimentele massa zijn gemarkeerd met pijlen en hun opdrachten worden in het groen. De experimentele massa voor het eiwit voorafgaand aan reductie en na reductie zijn in de tabel en vertonen een massaverschil van 8 Da, corresponderend met de aanwezigheid van geoxideerde eiwitten voor toevoeging van reductiemiddel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Recept </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g trypton 5 g gistextract 925 ml water </td><td> Mix en vervolgens autoclaaf te steriliseren. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO4 </td><td> 100 ml 49,3 g MgSO4 · 7H 2 O ~ 60 ml water </td><td> Roer totdat het is opgelost dan autoclaaf te steriliseren. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g glycerol 730 ml water 25 g glucose 100 g α-lactose </td><td> Voeg in de juiste volgorde, roer op vuur tot alle opgeloste dan autoclaaf te steriliseren. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml water 66 g (NH4) 2 SO4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 </td><td> Voeg in de juiste volgorde en roer tot alles opgelost dan autoclaaf te steriliseren. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Recept voor onderdelen van Zyp-5052 medium.

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om een expressiescreeningprotocol met hoge doorvoer te gebruiken om het niveau van oplosbare eiwitten in e coli te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde vloeistofbehandelingsrobot. Dit wordt bereikt door eerst .96 te inoculeren. De volgende dag worden 24-well platen gevuld met auto-inductiemedia geïnoculeerd met de overnachtelijke pre-culturen om expressie te genereren.Cultures na oogst en het vriezen van oplosbare eiwitten uit de expressieculturen worden vervolgens gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. Uiteindelijk kunnen de oplosbaarheidsniveaus voor elke intacte doelfusie worden gemeten om de optimale expressiecondities voor eiwitproductie en de generatie van succesvolle doelen te bepalen. Van de voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden van verhoogde efficiëntie, de beperkte batch tot batch straling en de eenvoud van de gegevensbehandeling en tracking. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.De geautomatiseerde stappen kunnen ontmoedigend en moeilijk te begrijpen zijn in tekstvorm alleen, aangezien de tekst niet de snelheid of eenvoud van de procedure overbrengt. Na transformatie van de bacteriën begint u met het gebruik van de robotische grijper om de deksel van de eerste 24-well LB agar plaat opzij te zetten. Gebruik vervolgens de achtkanaals vloeistofbehandelingsarm om 50 microliter transformatiemix van een 96-well transformatieplaat te mengen en vervolgens te aspireren.Stort de transformatiemix binnen de eerste vier kanalen van de vloeistofbehandelingsarm in de eerste kolom van de LB agar plaat en de transformaties binnen de laatste vier kanalen in de tweede kolom van de LB agar plaat. Was alle tips grondig na het doseren en ga dan verder met het overbrengen van de transformatiemix van de 96-well plaat in alle putjes in de volgende vier kolommen van de LB agar plaat tot die plaat klaar is. Zodra de overdracht naar de eerste plaat is voltooid, plaatst u het deksel en begint u met de overdracht voor de volgende plaat. Zodra alle transformaties zijn geplaatst, schudt u alle platen gedurende één minuut op 1200 RPM om een homogene verdeling van de transformatiemix te genereren.Gebruik vervolgens de 96-multikanaalsarm om 60 microliter van de resterende transformatiemix uit de 96-well plaat aan te zuigen en de mix in een diepe well 96 plaat met LB bouillon te storten. Dicht de diepe well 96 pre-culturen met adembare kleeffolie om cultuurventilatie mogelijk te maken en plaats de plaat vervolgens in een schuddende incubator van 37 graden Celsius op maximale snelheid overnacht. Zodra de pre-culturen in de incubator zijn, stuur de LB agar platen in een kap met hun deksels eraf gedurende ongeveer 10 minuten.Keer vervolgens de platen om in een 37 graden Celsius platen-incubator overnacht. De volgende dag gebruikt u de vloeistofbehandelingsarm om 100 microliter van de overnachtelijke pre-cultuur in een diepe well 96 plaat aan te zuigen om de expressieculturen te inoculeren op een verdunning van één op de veertig, met behulp van hetzelfde schema als voorheen, waarbij de vloeistofbehandelingsarm grondig wordt gewassen bij het wasstation tussen elke kolom van de pre-culturen. Wanneer de inoculatie is voltooid, plaatst u de expressieculturen in een schuddende incubator van 37 graden Celsius, afgesloten met adembare kleefstof gedurende vier uur.Verlaag vervolgens de temperatuur naar 17 graden Celsius voor een overnachtelijke incubatie. Centrifugeer de volgende ochtend de diepe well 24 platen gedurende 10 minuten bij 3000 Gs. Gooi het supernatant in een afvalinzamelbak met een antimicrobieel middel en tik vervolgens de platen ondersteboven op absorberend papier om eventueel resterend medium te verwijderen om te verifiëren dat de culturen correct zijn gegroeid. Controleer op de aanwezigheid van pellets in de diepe well.Zuig vervolgens 125 microliter lysisbuffer aan en verdeel de buffer tweemaal in elke put van de diepe well 24 platen met vier tips in elke put. Om het eindvolume van één milliliter lysisbuffer te bereiken om de pellets te resuspenderen, schudt u de platen gedurende vijf minuten op 1200 RPM. Breng op de robot de celsuspensies terug over naar de juiste putjes van een diepe well 96 plaat en bewaar de platen afgesloten bij min 80 graden Celsius gedurende minimaal één uur.Voor deze demonstratie zullen we het protocol met 50 microliter nikkelkralen gebruiken voor de zuivering van de doelfusie-eiwitten. Ontdooi eerst de diepe well 96 plaat in een waterbad gedurende ongeveer 15 minuten. Resuspensieer vervolgens de cellysaten in de schuddende incubator op maximale snelheid gedurende nog eens 10 minuten, de culturen moeten viskeus worden.Gebruik vervolgens een handmatige achtkanaals pipette om DNA's en magnesiumsulfaat te doseren en meng in elke put van de diepe well 96 plaat tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 microgram per milliliter en 20 millimolair. Schud de plaat afgesloten gedurende nog eens 15 minuten, waarna de cultuur niet-viskeus moet worden. Om verstopping van de filterplaat tijdens de zuivering te voorkomen, is het van cruciaal belang om zorgvuldig visueel te controleren of geen van de lysaten nog viskeus is.Gebruik op de vloeistofbehandelingsrobot 200 microliter brede mondtips om de harsslurry grondig te mengen voordat u 200 microliter van de slurry overbrengt in de diepe well 96 plaat met het lysaat. Schud de diepe well 96 plaat gedurende 10 minuten op 1400 RPM en kamertemperatuur om binding mogelijk te maken, en gebruik vervolgens de brede mondtips om te mengen en vervolgens de volledige 1200 microliter harslysaat slurry in 200 microliter aliquoten over te brengen naar de filterplaat. Schakel nu de vacuüm in gedurende ongeveer 30 seconden om het lysaat door de plaat te filteren, waarbij het doorstroom in een diepe well wordt verzameld.De diepe well 96 onder de diepe well 96 met het doorstroom wordt verwijderd en bewaard op een rek tot het einde van het experiment. Was vervolgens de hars twee keer met 800 microliter bindingsbuffer per keer, gebruik de robotische grijper om een nieuwe, die

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bacteriële productie van recombinante eiwitten, waaronder typisch onoplosbare of disulfide-bindingsbevattende eiwitten, verpakt in extracellulaire membraangebonden blaasjes. Dit heeft het potentieel om te worden toegepast op veelzijdige gebieden van wetenschappelijk onderzoek, waaronder toegepaste biotechnologie en geneeskunde.

Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.

High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Dit protocol beschrijft de productie van recombinante humane SLFN14-ribonuclease en de stoichiometrische analyse daarvan door massafotometrie.<br...

Snelle productie van recombinante menselijke SLFN14-ribonuclease en stoichiometrische analyse door massafotometrie

Leer een high-throughput screeningsprotocol voor kwantitatieve expressie en zuivering van oplosbare disulfide-rijke eiwitten in E. coli met behulp van geautomatiseerde vloeistofafhandeling.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in E. coli (Video) | JoVE Journal

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in

Meer video's verkennen