High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in E. coli
30 juli 2014
Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.
Het algemene doel van de volgende procedure is om een expressiescreeningprotocol met hoge doorvoer te gebruiken om het niveau van oplosbare eiwitten in e coli te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde vloeistofbehandelingsrobot. Dit wordt bereikt door eerst .96 te inoculeren. De volgende dag worden 24-well platen gevuld met auto-inductiemedia geïnoculeerd met de overnachtelijke pre-culturen om expressie te genereren.
Cultures na oogst en het vriezen van oplosbare eiwitten uit de expressieculturen worden vervolgens gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. Uiteindelijk kunnen de oplosbaarheidsniveaus voor elke intacte doelfusie worden gemeten om de optimale expressiecondities voor eiwitproductie en de generatie van succesvolle doelen te bepalen. Van de voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden van verhoogde efficiëntie, de beperkte batch tot batch straling en de eenvoud van de gegevensbehandeling en tracking. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.
De geautomatiseerde stappen kunnen ontmoedigend en moeilijk te begrijpen zijn in tekstvorm alleen, aangezien de tekst niet de snelheid of eenvoud van de procedure overbrengt. Na transformatie van de bacteriën begint u met het gebruik van de robotische grijper om de deksel van de eerste 24-well LB agar plaat opzij te zetten. Gebruik vervolgens de achtkanaals vloeistofbehandelingsarm om 50 microliter transformatiemix van een 96-well transformatieplaat te mengen en vervolgens te aspireren.
Stort de transformatiemix binnen de eerste vier kanalen van de vloeistofbehandelingsarm in de eerste kolom van de LB agar plaat en de transformaties binnen de laatste vier kanalen in de tweede kolom van de LB agar plaat. Was alle tips grondig na het doseren en ga dan verder met het overbrengen van de transformatiemix van de 96-well plaat in alle putjes in de volgende vier kolommen van de LB agar plaat tot die plaat klaar is. Zodra de overdracht naar de eerste plaat is voltooid, plaatst u het deksel en begint u met de overdracht voor de volgende plaat. Zodra alle transformaties zijn geplaatst, schudt u alle platen gedurende één minuut op 1200 RPM om een homogene verdeling van de transformatiemix te genereren.
Gebruik vervolgens de 96-multikanaalsarm om 60 microliter van de resterende transformatiemix uit de 96-well plaat aan te zuigen en de mix in een diepe well 96 plaat met LB bouillon te storten. Dicht de diepe well 96 pre-culturen met adembare kleeffolie om cultuurventilatie mogelijk te maken en plaats de plaat vervolgens in een schuddende incubator van 37 graden Celsius op maximale snelheid overnacht. Zodra de pre-culturen in de incubator zijn, stuur de LB agar platen in een kap met hun deksels eraf gedurende ongeveer 10 minuten.
Keer vervolgens de platen om in een 37 graden Celsius platen-incubator overnacht. De volgende dag gebruikt u de vloeistofbehandelingsarm om 100 microliter van de overnachtelijke pre-cultuur in een diepe well 96 plaat aan te zuigen om de expressieculturen te inoculeren op een verdunning van één op de veertig, met behulp van hetzelfde schema als voorheen, waarbij de vloeistofbehandelingsarm grondig wordt gewassen bij het wasstation tussen elke kolom van de pre-culturen. Wanneer de inoculatie is voltooid, plaatst u de expressieculturen in een schuddende incubator van 37 graden Celsius, afgesloten met adembare kleefstof gedurende vier uur.
Verlaag vervolgens de temperatuur naar 17 graden Celsius voor een overnachtelijke incubatie. Centrifugeer de volgende ochtend de diepe well 24 platen gedurende 10 minuten bij 3000 Gs. Gooi het supernatant in een afvalinzamelbak met een antimicrobieel middel en tik vervolgens de platen ondersteboven op absorberend papier om eventueel resterend medium te verwijderen om te verifiëren dat de culturen correct zijn gegroeid. Controleer op de aanwezigheid van pellets in de diepe well.
Zuig vervolgens 125 microliter lysisbuffer aan en verdeel de buffer tweemaal in elke put van de diepe well 24 platen met vier tips in elke put. Om het eindvolume van één milliliter lysisbuffer te bereiken om de pellets te resuspenderen, schudt u de platen gedurende vijf minuten op 1200 RPM. Breng op de robot de celsuspensies terug over naar de juiste putjes van een diepe well 96 plaat en bewaar de platen afgesloten bij min 80 graden Celsius gedurende minimaal één uur.
Voor deze demonstratie zullen we het protocol met 50 microliter nikkelkralen gebruiken voor de zuivering van de doelfusie-eiwitten. Ontdooi eerst de diepe well 96 plaat in een waterbad gedurende ongeveer 15 minuten. Resuspensieer vervolgens de cellysaten in de schuddende incubator op maximale snelheid gedurende nog eens 10 minuten, de culturen moeten viskeus worden.
Gebruik vervolgens een handmatige achtkanaals pipette om DNA's en magnesiumsulfaat te doseren en meng in elke put van de diepe well 96 plaat tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 microgram per milliliter en 20 millimolair. Schud de plaat afgesloten gedurende nog eens 15 minuten, waarna de cultuur niet-viskeus moet worden. Om verstopping van de filterplaat tijdens de zuivering te voorkomen, is het van cruciaal belang om zorgvuldig visueel te controleren of geen van de lysaten nog viskeus is.
Gebruik op de vloeistofbehandelingsrobot 200 microliter brede mondtips om de harsslurry grondig te mengen voordat u 200 microliter van de slurry overbrengt in de diepe well 96 plaat met het lysaat. Schud de diepe well 96 plaat gedurende 10 minuten op 1400 RPM en kamertemperatuur om binding mogelijk te maken, en gebruik vervolgens de brede mondtips om te mengen en vervolgens de volledige 1200 microliter harslysaat slurry in 200 microliter aliquoten over te brengen naar de filterplaat. Schakel nu de vacuüm in gedurende ongeveer 30 seconden om het lysaat door de plaat te filteren, waarbij het doorstroom in een diepe well wordt verzameld.
De diepe well 96 onder de diepe well 96 met het doorstroom wordt verwijderd en bewaard op een rek tot het einde van het experiment. Was vervolgens de hars twee keer met 800 microliter bindingsbuffer per keer, gebruik de robotische grijper om een nieuwe, die
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor high throughput expressiescherming en zuivering van fusie-eiwitten uit Escherichia coli-culturen. De methode richt zich op het kwantificeren van oplosbare eiwitten en het optimaliseren van expressiecondities voor disulfide-rijke dierlijke venom-eiwitten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwitexpressie
- Biotechnologie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Fusieeiwitten zijn belangrijk voor het bestuderen van eiwitfunctie.
- Traditionele methoden voor eiwitzuivering kunnen inefficiënt zijn.
- High throughput technieken kunnen de productiviteit verbeteren.
- Geautomatiseerde systemen vereenvoudigen de omgang met meerdere monsters.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor efficiënte expressiescherming van eiwitten.
- Om de oplosbaarheid van doel-fusie-eiwitten te kwantificeren.
- Om condities voor eiwitproductie te optimaliseren.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van pre-culturen in 96-well platen.
- Gebruik van geautomatiseerde robots voor vloeistofbehandeling voor monsterverwerking.
- Zuivering van eiwitten met behulp van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie.
- Meting van oplosbaarheidsniveaus om optimale condities te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van disulfide-rijke fusie-eiwitten.
- Kwantificering van oplosbare eiwitten bereikt door automatisering.
- Verbeterde efficiëntie in vergelijking met traditionele methoden.
- Duidelijke visualisatie van het protocol verbetert het begrip.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor eiwitexpressiescherming.
- Automatisering vermindert aanzienlijk de handmatige arbeid en fouten.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende eiwitdoelen in onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High throughput expression screening enables rapid identification of soluble expression conditions for challenging targets like disulfide-rich venom proteins, reducing time-to-insight in early discovery. Quantitative solubility measurement supports data-driven go/no-go decisions, improving capital efficiency and de-risking lead identification. This approach enhances predictive confidence in target validation by linking expression success to structural features such as disulfide bond count and isoelectric point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking expression success to structural determinants like disulfide bond count and isoelectric point.
- Operational Value: Supports rapid screening of hundreds of constructs to identify soluble candidates for downstream characterization.
- Predictive Value: Quantifies soluble yield across expression conditions, enabling data-driven prioritization of targets with higher likelihood of success.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative solubility data (0.1–25 µg/L) that enables comparison of expression constructs and conditions.
- Operational Value: Standardizes protein production workflows using automated liquid handling, improving reproducibility across batches.
- Assay Readiness: Produces purified protein suitable for downstream applications including mass spectrometry validation and functional micro-assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides oxidized, functional venom proteins amenable to structural and functional characterization, supporting early-stage target validation.
- Mechanistic De-risking: Confirms correct disulfide bond formation via mass spectrometry, reducing ambiguity in protein quality before preclinical use.
- Scalability: Enables production of sufficient quantities from small-scale cultures for pilot studies and assay development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through expression screening and solubilization, and enabling progression to lead identification via purified protein availability.
- Discovery Biology: Tests expression hypotheses by linking plasmid design to soluble yield, clarifying which constructs produce functional protein.
- Screening: Delivers standardized, quantitative solubility outputs that allow side-by-side comparison of expression conditions across targets.
- Analytics: Provides measurable outputs (soluble protein yield, mass spectrometry confirmation) that inform go/no-go decisions in target selection.
- Translational Research: Yields purified, oxidized venom proteins suitable for pilot functional studies, bridging discovery and preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening disulfide-rich proteins across multiple projects, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by linking expression success to structural features and confirming oxidation state via mass spectrometry.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through automation, reducing manual labor and batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by enabling rapid assessment of expression success rates across hundreds of targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying soluble, correctly oxidized candidates early in the discovery pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and automated liquid handling systems.
- Dependent on access to robotic platforms for high-throughput inoculation, lysis, and purification steps.
- Necessitates standardized protocols for lysis, binding, washing, and elution to ensure reproducibility across plates.
- Requires adaptation of lysis and buffer conditions when extending to non-venom disulfide-rich proteins or alternative host systems.
- Limited by the need for downstream analytics (e.g., mass spectrometry) to confirm correct disulfide bonding and rule out misfolded species.
