Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van een groot volume zelfassemblerende, lipidengebaseerde zuurstofmicrobellen of OMS voor intraveneuze zuurstoftoediening. Dit wordt bereikt met behulp van een high-shear homogenisator en een gastight tank om OMS te produceren en serieel te concentreren. De tweede stap is het gebruik van gemodificeerde spuiten om een LOM-emulsie te extruderen die 70 volumeprocent zuurstof bevat.

Vervolgens wordt de emulsie door centrifugatie geconcentreerd om een zuurstofschuim met een volumepercentage van 90% te verkrijgen. De laatste stap is het uitvoeren van de kwaliteitscontrole door het volumepercentage zuurstof te berekenen en de deeltjesgrootteverdeling te beoordelen met behulp van lichtverstrooiingstechnologie. Uiteindelijk levert homogenisatie bij hoge afschuifkracht twee liter OMS op die voor 90% uit zuurstof bestaat (volumeprocent).

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande productiemethoden zoals sonicatie en amalgamatie is dat homogenisatie zelfassemblerende microbellen produceert op een schaal van liters, een volume dat noodzakelijk is voor tests met therapeutische zuurstoftoediening bij grote dieren. Een van de toepassingen van deze techniek is de behandeling van patiënten met ernstige hypoxemie, omdat met zuurstofgas gevulde microbellen binnen enkele seconden zuurstof overdragen aan deoxyhemoglobine en drie keer zoveel zuurstof bevatten als bloed Visual. Demonstratie van deze methode is belangrijk met betrekking tot de diepte van de homogenisatorkop.

Het handhaven van een puur geoxideerde omgeving en het onderscheiden van geconcentreerde LMS ten opzichte van de waterige fase kan lastig te beoordelen zijn. Het systeem voor de productie van lipide-gebaseerde zuurstofmicrobellen of OMS bestaat uit een bewaar- en concentratietank (HCT) voorzien van een enkelstapsmenger, een inline high-shear homogenisator, een rolpomp voor het verplaatsen van vloeistof tussen de HCT en de homogenisator en een warmtewisselaar.

Om de systeemopstelling te beginnen, plaatst u een gesteriliseerd glazen opvangvat van vier liter met een brede opening, voorzien van twee basispoorten en drie zijpoorten, onder de enkeltrapsmenger. Voorzie een van de basispoorten van de HCT poort nummer één met een steriele transparante slang met een binnendiameter van drie achtste inch, ongeveer 10 inch lang, voorzien van een driewegkraan aan het uiteinde voor het opvangen van de geconcentreerde emulsie. Voorzie vervolgens de tweede basispoort, poort nummer twee, met een steriele slang met een binnendiameter van drie achtste inch en een lengte van ongeveer 36 inch. Leid deze slang door de rollerpomp.

De inlaat van de high-shear homogenisator is voorzien van een T-stuk met twee poorten. Verbind een slang van poort nummer twee via de rollerpomp met de zijpoort van het T-stuk. Sluit de andere poort aan op een zuurstoftank met behulp van een zuurstofgasflowmeter met een laag debiet.

Verbind de uitlaatpoort van de high-shear homogenisator met de inlaatpoort van een inline warmtewisselaar die op 4 °C wordt gehouden. Verbind de uitlaatpoort van de warmtewisselaar met de retourpoort van de HCT om een gesloten lussysteem te creëren. Sluit de zuurstoftank via een debietmeter aan op poort nummer vier van de HCT.

Bevestig tot slot een gascompositiemonitor die openstaat naar de atmosfeer aan de bovenste poort van de HCT. Om met deze procedure te beginnen, plaatst u 20 gram GMP een twee DYS steer olie, SN glycerol drie PHOSPHOCHOLINE of DSPC en 10 gram cholesterol in de bodem van de HCT. Voeg één liter plasma light A toe aan de HCT en roer dit één minuut lang met de hand om zoveel mogelijk lipiden in de waterige fase te integreren.

Laat de enkeltrapsmenger in de waterige fase zakken en zorg ervoor dat de volledige mixerkop door de waterige fase wordt bedekt. Om te voorkomen dat omgevingslucht de headspace verontreinigt, dienen rubberen afdichtingen of tape te worden gebruikt om te garanderen dat de bovenkant van de HCT gasdicht is en dat er geen open zijpoorten zijn. Zet de gasbron aan die is aangesloten op poort nummer vier en wacht tot de zuurstoffractie van de HCT-headspace hoger is dan 95%. Meng de precursor-emulsie gedurende vijf minuten met de enkeltrapsmenger. Bij 5.000 RPM moet het resulterende mengsel bleekwit ogen en geen zichtbare lipidklonten bevatten.

Zodra gemengd, kan het ongebruikte lipide-watermengsel tot 30 dagen bij vier graden Celsius worden bewaard voor eenmalig gebruik. Ontlucht het volledige gesloten lussysteem met de precursor-emulsie door de rollerpomp in te schakelen op 1,3 liter per minuut of LPM. Zodra het systeem is ontlucht, blijft de pomp aanstaan op 1,3 LPM om te beginnen met de productie van de LO's.

Zet de inline high-shear homogenisator aan op 7.500 RPM. Zet direct daarna de zuurstoftoevoer naar het inlaatgedeelte van de homogenisator aan op 0,5 LPM. Houd de enkelstapsmixer in de HCT aan op 3.500 RPM.

Oms worden gevormd op het grensvlak van de rotorbladen en de emulsiesieven binnen de inline-homogenisator. Binnen de eerste paar minuten moet de vloeistof zichtbaar viskeuzer worden. Laat het systeem 15 minuten draaien en schakel vervolgens de high-shear homogenisator en de zuurstofinlaat daarvan uit.

Dit vermindert fasescheiding en houdt het product relatief uniform binnen de HCT. Let op dat het volume van de gasgevulde emulsie ongeveer twee tot drievoudig moet toenemen tijdens de seriële concentratiefase. De 140 milliliter luer-lock spuiten voor het opvangen van de geproduceerde OMS zijn vooraf aangepast door 100 milliliter lucht in de spuit te trekken en vervolgens het overtollige zuiger- en spuitmateriaal boven de 140 milliliter markering af te zagen.

Bevestig een steriele gemodificeerde spuit aan de stopkraan van poort nummer één op het opvangvat; gebruik getande pincetten om de zuiger te laten zakken en trek 100 milliliters vloeistof op. Sluit de spuit stevig af met een dop en herhaal dit proces totdat alle vloeistof is verwijderd. Centrifugeer de spuiten met de afgedopte zijde naar beneden in een gekoelde centrifugeerbak bij 225 ×g gedurende 10 minuten. Na centrifugatie zullen drie lagen materiaal zichtbaar zijn; verwijder en gooi de onderste laag van de overtollige troebele waterige fase weg.

De tweede laag is helderwit en bevat geconcentreerde oms. Breng het geconcentreerde schuim over naar een gasondoorlatende glazen spuit met behulp van een driewegkraan om contaminatie door omgevingsgas te voorkomen. Verwijder de laatste laag, die vrij zuurstofgas bevat afkomstig van gebroken oms.

De schuimkwaliteit kan worden beoordeeld door de gasconcentratie als volgt te berekenen. Een schuim van hoge kwaliteit zal een gasconcentratie bereiken van groter dan of gelijk aan 90 volume procent; als tweede kwaliteitscontrole wordt de grootte van de microbellen bepaald via optische lichtverstrooiing om vast te stellen of de deeltjesgrootte binnen het verwachte bereik ligt. Er moet rekening mee worden gehouden dat een wijziging in de homogenisatietijd of de formulering de belgrootte kan beïnvloeden; sluit de glazen spuiten die geconcentreerde oms bevatten stevig af.

Met een lure lock-aansluiting kunnen spuiten worden bewaard bij 22 °C, 4 °C of -20 °C. Lagere temperaturen kunnen zorgen voor een verbeterde stabiliteit van de houdbaarheid. Met dit protocol kan in 90 minuten tot twee liter geconcentreerde OMS worden geproduceerd.

Visualisatie van een monster van 10 µL OMS middels lichtmicroscopie toonde sferische OMS en een relatieve hoeveelheid lipiderestanten aan. Wanneer hetzelfde monster OMS werd beoordeeld via optische verstrooiing, was de gemiddelde particeldiameter 2,624 ± 0,332 µm. Meer dan 90% van de OMS had een diameter van minder dan 10 µm en de populatie was polydispers.

De viscositeit van de emulsie was sterk afhankelijk van de gasfractie en daarmee van de concentratie microbellen. Aliquoten van 2 milliliter LOM-emulsie bij 60, 70 en 90 volume procent gas werden bestudeerd met een steady-state flow sweep met behulp van een parallelle plaat van 40 millimeter.

De geometrie vertoonde een radiologisch profiel dat vergelijkbaar was met menselijk bloed bij OMS met 60 volumeprocent gas, terwijl de spanning varieerde van 0,1 tot 1000 past gass. Het zuurstofgehalte van OMS werd getest door variërende volumes zuurstof, opgenomen in 60 volumeprocent OMS, toe te voegen aan aliquoten gedesatureerd menselijk bloed met een bekend zuurstoftekort. De relatie tussen het toegevoegde volume zuurstof binnen de OMS en de volumetrische toename van het zuurstofgehalte in het bloed was 1,053 plus of minus 0,03025.

Dit suggereert dat de geteste OMS bijna 100% zuurstof bevatten, weinig ingesloten gasbellen vertoonden en hun volledige zuurstoflast in vitro effectief overdroegen op menselijk bloed. Zodra deze techniek beheerst is, kunnen er bij een correcte en efficiënte uitvoering in 90 minuten twee liter LMS worden geproduceerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de ophopende OMS visueel te blijven controleren en kwaliteitscontroles uit te voeren op de concentratie van het LOM-schuim. Na deze productieprocedure kan OMS worden gebruikt voor grootschalige intraveneuze injectie en toediening van therapeutische gassen.