Name: Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Leer hoe je lipide-gebaseerde zuurstofmicrobellen produceert voor intraveneuze zuurstoftoediening met behulp van high-shear homogenisatie en seriële concentratie. Deze schaalbare methode levert twee liter emulsie met 90% zuurstof.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering: US Army Medical Research &amp; Materieel Command (USAMRMC) en beheerd door de Telemedicine &amp; Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji droeg de wijziging van de injectiespuiten zoals hier beschreven.

1. Systeem Set-up Het systeem bestaat uit een holding en het concentreren van de tank (HCT), met een enkel podium mixer, een in-line high shear homogenisator, een roller pomp vloeistof tussen de HCT en de homogenisator bewegen, en een warmtewisselaar (figuur 1). <ol><li> Plaats een gesteriliseerde, brede opening 4 L glascollectie vat uitgerust met 2 voet-poorten en 3 poorten aan de zijkant onder de single stage mixer. Laat de mixer hoofd tot aan de monding van het schip en zorgen voor een gasdichte montage met behulp van rubber afdichtingen of tape (om te voorkomen dat de lucht verontreinigen het hoofd ruimte). </li><li> Monteer een van de basis-poorten (Figuur 1, poort # 1) van het HCT met steriele 3/8 &quot;(ID) transparante slang, ongeveer 10&quot; lang, uitgerust met een 3-weg kraan aan het uiteinde voor het verzamelen van de geconcentreerde emulsie . </li><li> Monteer het tweede honk poort (Figuur 1, poort # 2) met steriele 3/8 &quot;(ID) slangen, approximately 36 &#39;lengte. Voed deze slang door een roller pomp. Passen bij de inlaat van de high shear homogenisator met een T-stuk met twee poorten en sluit als volgt: Sluit de leidingen van de haven # 2, door de rol pomp en aan te sluiten op de zijpoort van het T-stuk. Maak de andere poort om een ​​zuurstoftank met een low-flow zuurstofgas flowmeter. </li><li> Verbind de uitlaatpoort van de hoge afschuiving homogenisator naar de inlaatpoort van een in-line warmtewisselaar gehandhaafd op 4 ° C. Verbind de uitlaatpoort van de warmtewisselaar aan de terugvoerpoort van de HCT (figuur 1, poort # 3), waardoor een gesloten lussysteem. </li><li> Bevestig een zuurstoftank (via een flowmeter) aan de HCT (Figuur 1, poort # 4). Bevestig een gassamenstelling monitor die open sfeer aan de bovenste poort van de HCT (Figuur 1, poort # 5) is. </li><li> Als steriliteit gewenst is, steriliseren van de glazen en metalen onderdelen voor elk gebruik door autoclaaf. Steriliseer de slang componenten en kunststof connectors met ethyleenoxide voor elk gebruik. Dit is vooral belangrijk wanneer het product wordt getest in vivo. </li></ol> 2. LOM Fabricage <ol><li> Breng 20 g GMP 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC) en 10 g cholesterol in de basis van de HCT. Voeg 1 L van Plasma-Lyte A de HCT en hand roer gedurende 1 min, integreren zoveel lipide mogelijk in waterfase. </li><li> Laat de enkele mengtrap in de waterige fase, zodat de gehele mengkop onder de waterfase. Zorg ervoor dat de bovenkant van de HCT is gasdicht (zie stap 1.1 hierboven) en dat er geen open poorten aan de zijkant. Zet het gas bron bevestigd aan de haven # 4 en wacht totdat het zuurstofpercentage van de HCT kopruimte bereikt&gt; 95%. Bij 10 L / min (LPM), moet dit ~ 10 minuten. </li><li> De eentraps mixer, meng de precursor emulsie gedurende 5 minuten bij 5000 rpm. Het resulterende mengsel moet bleke witte verschijnen en bevat geen zichtbare Lipid bosjes. Eenmaal gemengd, kunnen ongebruikte lipide-watermengsel worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 30 dagen voor eenmalig gebruik. </li><li> Prime de gehele closed loop systeem met de voorloper emulsie door te draaien op de rol pomp op 1,3 LPM. Zodra het systeem helemaal klaar, laat u de pomp op op 1,3 LPM. </li><li> Om de productie van de LOM beginnen, zet de in-lijn hoge afschuiving homogenisator tot 7.500 tpm. Onmiddellijk daarna Schakel zuurstoftoevoer naar het inlaatdeel van de homogenisator 0.5 LPM. Houd de eentraps mixer (in het HCT) op bij 3.500 tpm. LOM gevormd op het grensvlak van rotorbladen en emulgeerzeef schermen binnen de in-line homogenisator (figuur 2). Binnen enkele minuten, moet vloeistof zichtbaar meer viskeus. Een meer rigoureuze benadering is de viscositeit als functie van de tijd, die kan worden gedaan door het verwijderen van porties van Port 1 tijdens fabricage en analyseren met een viscometer. Opmerking: Als zichtbare luchtbellen in de slang het verlaten van de mixer, zuurstofstromen naar de in-line homogenisator te hoog. Titreer beneden gasstroom tot de vloeistof is ondoorzichtig en bevat geen zichtbare gasbellen. </li><li> Voer het systeem gedurende 15 minuten, en zet de high shear homogenisator en de zuurstof inlaat aan. Blijf de eentraps mixer draaien in de HCT totdat de emulsie wordt verwijderd; Dit vermindert fasescheiding en houdt het product relatief uniforme binnen het HCT. Opmerking: Het volume van de gasgevulde emulsie een ongeveer 2-3x verhogen tijdens de seriële concentratiefase. Als dit niet gebeurt, controleer dat zuurstof stroomt in de high shear homogenisator en dat lipide concentraties in de voorloper emulsie correct zijn. Rendement van de af lipide concentratie afneemt. </li></ol> 3. Collection, Concentratie, Assessment, en opslag van LOM <ol><li> Bevestig een steriele, gemodificeerd 140 ml luerlockspuit aan de kraan bevestigd aan thuishaven # 1 op het vat. Opstellen 100 ml vloeistof. Nauw cap spuit en herhaal tot alle vocht is verwijderd. <ol><li> Spuiten wijzigen door intrekking van 100 ml lucht in de spuit en dan zagen het overtollige zuiger en spuit materiaal boven de 140 ml markering. Vullen en lege spuiten met behulp van getande tang voor het opstellen van de plunjer. Deze wijziging maakt het mogelijk makkelijker centrifugeren. </li></ol></li><li> Centrifugeer spuiten met het afgedekte gedeelte omlaag gericht in een gekoelde (4 ° C) bucket centrifuge bij 225 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Drie lagen van materiaal verschijnen na centrifugeren. Verdrijf de onderste laag van overtollig bewolkt waterfase en gooi deze weg. De tweede laag is helder wit en bevat geconcentreerde LOM. Transfer geconcentreerd schuim om een ​​gasondoorlaatbare spuit met een drie-weg kraan om verontreiniging van de omgeving wordt voorkomen. Gooi de laatste laag, die vrije zuurstof gas van gescheurde LOM&#39;s bevat. </li><li> Schuim kwaliteit kan worden beoordeeld door het bereiken van ≥ 90% gas geconcentreerd schuim. Calculaten gasconcentratie als volgt: Volume% gas = [(Foam gewicht / Foam volume) - 1] x 100 <ol><li> Als tweede kwaliteitscontrole maat microbellen door lichtverstrooiing te bepalen of deeltjesgrootte binnen het verwachte bereik. Opgemerkt zij dat een verandering in homogenisatietijd of formulering bellengrootte zouden kunnen wijzigen. </li></ol></li><li> Nauw cap het glas spuit met een luer-lock fitting. Geconcentreerde LOM kunnen met Plasma-Lyte A verdund worden op het moment van gebruik. Spuiten kunnen worden bewaard bij 22, 4, of -20 ° C; koudere temperaturen kunnen verbeterde houdbaarheid stabiliteit 7 bieden. </li></ol>

<ol><li>Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+loaded+microbubble+design+for+ultrasound+triggered+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery.</a> Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).</li>
<li>Ren, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasound+Microbubble+Carrying+Gene+and+Tat+Peptide%3A+Preparation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization.</a> Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).</li>
<li>Tinkov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+as+Ultrasound+Triggered+Drug+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).</li>
<li>Hernot, S., Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+ultrasound-triggered+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).</li>
<li>Lanza, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site-targeted+ultrasonic+contrast+agent+with+broad+biomedical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application.</a> Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).</li>
<li>Cavalli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+dextran+nanobubbles+for+oxygen+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery.</a> International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).</li>
<li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+Provide+Intravenous+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery.</a> Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).</li>
<li>Lindner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+rheology+of+definity+microbubbles+after+intra-arterial+and+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).</li>
<li>Zhao, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in+vivo+observation+of+phospholipid-based+gas-filled+microbubbles+containing+hirudin%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).</li>
<li>Seo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Assembly+of+Monodisperse%2C+Nanoparticle-Incorporated+Perfluorocarbon+Microbubbles+for+Medical+Imaging+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy.</a> Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).</li>
<li>Wan, J. D., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+Gas+Bubbles+for+the+Continuous+Synthesis+of+Hollow+Inorganic+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles.</a> Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).</li>
<li>Duncanson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+Gas-Filled+Microparticles+from+Reactions+in+Double+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions.</a> Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).</li>
<li>Kendall, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaled-Up+Production+of+Monodisperse%2C+Dual+Layer+Microbubbles+Using+Multi-Array+Microfluidic+Module+for+Medical+Imaging+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Science+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Szijjarto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Perfluorocarbon+Gases+on+the+Size+and+Stability+Characteristics+of+Phospholipid-Coated+Microbubbles%3A+Osmotic+Effect+versus+Interfacial+Film+Stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization.</a> Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid-Coated+Gas+Bubble+Engineering%3A+Key+Parameters+for+Size+and+Stability+Control%2C+as+Determined+by+an+Acoustical+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method.</a> Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).</li>
<li>Swanson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid-Stabilized+Microbubble+Foam+for+Injectable+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery.</a> Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).</li>
<li>Kvåle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+fractionation+of+gas-filled+microspheres+by+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Separations+Technology%22%5BJournal%5D)">Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation.</a> Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).</li>
<li>Dressaire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+polygonal+nanopatterning+of+stable+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles.</a> Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).</li>
<li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De belangrijkste stappen voor het creëren van geconcentreerde, zeer zuurstofrijk LOM&#39;s omvatten: 1) ervoor zorgen dat de bovenruimte in het HCT volledig blijft zuurstofrijk; 2) ervoor te zorgen dat de zuiverheid van de lipide hulpstoffen is optimaal (inclusief opslagcondities en het gebruik van GMP-producten); 3) de garantie dat de poedervormige lipiden mengen volledig met de waterige fase voorafgaand aan het systeem priming; en 4) met veel aandacht voor de stijging van de gas-fractie binnen het HCT om ervoor te zor...

Microbubbles samengesteld eiwit, polymeer en lipide schelpen zijn ontwikkeld als vectoren voor geneesmiddelafgifte, gentherapie en ultrageluid contrastmiddelen 1-5. Omdat deze therapeutische toepassingen vereisen intravasculaire microbellen doorzettingsvermogen, worden dergelijke microbellen vaak gevuld met inert, moleculair gewicht gassen hoog zoals perfluorkoolstoffen 6, die een lage oplosbaarheid hebben in het bloed en het stabiliseren van de bel 3,4. Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om de therapeutische doses van zuurstof, die end-orgel zuurstof levering kunnen behouden en tijdens perioden van luchtwegobstructie of hypoxemie 7 voorkomen hemodynamische instabiliteit te leveren. Emulsies ontworpen voor intraveneuze gas levering vereisen verschillende design kenmerken dan die welke worden gebruikt voor ultrageluid contrastmiddelen of gerichte toediening van medicijnen. Ten eerste, omdat het lichaam verbruikt grote hoeveelheden zuurstofgas (~ 200 ml / min), LOM worden vervaardigd engeïnjecteerd op grote schaal. Dit vereist dat het productieproces efficiënt. Ten tweede moet het productieproces gesloten lus om stikstof besmetting door de blootstelling van LOM (dat moet worden gevuld met 100% zuurstof) vermijden omgevingslucht. Ten derde, omdat het doel van het LOM is intraveneuze levering van gas, het gas fractie van LOM gemaximaliseerd moet worden, erkenning van de voorwaarden door emulsie viscositeit 7 beperkingen. Ten slotte, zoals bij elk intraveneus injecteerbare, nauwkeurige controle over deeltjesgrootteverdeling is essentieel voor het vermijden van microvasculaire obstructie 8. Er zijn een aantal gevestigde methoden voor microbellen vervaardigen. Sonicatie gebruikt hoge intensiteit laagfrequente ultrageluid toegepast op de lucht-vloeistof-interface van een emulsie die een oppervlakteactieve stof, zoals een amfipathische fosfolipide, in aanwezigheid van een gas kopruimte om microbellen 7,9 produceren omvat. Dit proces is regelbaar door het variëren ultrageluidsfrequentie, kracht en pulsduur en de verkregen grootteverdeling kan worden aangepast aan microbellen een specifieke grootteverdeling produceren, maar sonicatie zelden gebruikt bij de vervaardiging van klinisch gebruikte microbellen. Fusie is de intense mechanische agitatie van een oppervlakteactieve stof en gas in een gesloten systeem, dat ook moeilijk te schalen naar grote volumes 2 tegemoet. Droplet-gebaseerde microfluidics zorgt voor een precieze controle van microbellen grootteverdeling 10-13. Hoewel traditioneel moeilijk op te schalen, multi-channel, high-speed microfluidics beschreven die microbellen productie-efficiëntie te verhogen 13. Microbellen vervaardigd met behulp van een van deze methoden kan de post-productie verkleinen van de deeltjes processen, zoals centrifugaal fractionering 14,15 en microbellen beursgang 16,17 nodig. Een andere beproefde methode voor het vervaardigen van zeer stabiele microbellen is shear homogenizatie 6, wat kan resulteren in een stabiliserend fosfolipide hexagonaal patroon op het oppervlak microbelletjes 18. Voortbouwend op dit concept, beschrijven we de oprichting van een in-line high shear homogenisator naar zelfassemblage LOM 19 te creëren. In dit proces, maakt gebruik van de homogenisator snel roterende messen in de nabijheid van dual fijnmazige emulgeerzeef schermen, het creëren van een hoge mechanische en hydraulische schaar voor de creatie van microbellen. Seriële concentratie van het lipide-emulsie via dit systeem levert een verhoogde concentratie gasfractie, die verder kan worden geconcentreerd door centrifugatie.

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>770365</td><td>Alternatief product: niet-GMP van NOF America (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>Alternatief kan NaCl worden gebruikt</td></tr><tr><td>Glas opvangvat</td><td>Specialty Glass, Inc.</td><td>Op maat</td><td>Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>Gassamenstelling (zuurstof) monitor</td><td>Precision Medical</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>Sarns 8000 rolpomp</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>Onderdeel van een modulair perfusiesysteem</td></tr><tr><td>BIOtherm Warmtewisselaar</td><td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso laboratorium in-line mixer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td><td>Gebruik meervoudige werkhoofden en front-end verlenging met T-stuk</td></tr><tr><td>T-stuk voor Silverson Verso inlaatpoort</td><td>Process Innovations</td><td>Op maat</td><td>Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266</td></tr><tr><td>L5M-A laboratoriummixer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>NC0136483</td><td>Gebruik gaas emulsorscheermaal (fijn)</td></tr><tr><td>Rochester-Ochsner getande tang</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-18</td><td></td></tr><tr><td>140 ml spuit</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>Zorg ervoor dat er een luer lock is.</td></tr><tr><td>IX71 omgekeerde lichtmicroscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Retiga-2000R microscoopcamera</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Accusizer 780A Autodilution</td><td>PSS-NICOMP Particle Sizing Systems</td><td>Niet meer in productie</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde oxygen microbellen emulsies door high shear homogenisering en serial concentratie

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Met gas gevulde microbolletjes zijn ontwikkeld als ultrageluid contrast en drug delivery agenten. Microbellen kan worden verkregen door verwerking oppervlakteactieve middels sonicatie, mechanisch roeren, microfluïdische apparaten of homogeniseren. Onlangs zijn lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) is ontworpen om zuurstof intraveneus toedienen tijdens medische noodgevallen, omkeren levensbedreigende hypoxemie, en voorkomen van verdere orgaanschade, hartstilstand en de dood. We presenteren methoden voor opgeschaalde productie van zeer zuurstofrijk microbellen met een closed-loop high-shear homogenisator. Het proces kan 2 L van geconcentreerde LOM&#39;s (90% van het volume) te produceren in 90 minuten. Resulterende belletjes hebben een gemiddelde diameter van ca. 2 pm en een reologisch profiel overeenkomend met die van bloed wanneer verdund tot 60 volume%. Deze techniek produceert LOM&#39;s in hoge capaciteit en met een hoge zuurstof zuiverheid, wat suggereert dat deze techniek bruikbaar voor translationeel onderzoek labs kunnen zijn.

Hoge afschuiving homogenisering kan de efficiënte (dwz binnen een middag) productie van voldoende LOM&#39;s voor een studie bij dieren en geen technische expertise nodig. Eenmaal bedreven, kan tot 2 L van geconcentreerde LOM&#39;s worden vervaardigd in 90 minuten. Microbellen grootte en morfologie werd beoordeeld door lichtmicroscopie en door lichtverstrooiing. Wanneer een 10 ul monster van LOM werd gevisualiseerd werden bolvormige LOM genoteerd, evenals een relatieve schaarste aan ...

We beschrijven werkwijzen voor de bereiding van grote hoeveelheden lipide-gebaseerde zuurstof microbellen (LOM) ontworpen voor intraveneuze zuurstoflevering onder hoge afschuiving homogenisatie en seriële concentratie.

Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van een groot volume zelfassemblerende, lipidengebaseerde zuurstofmicrobellen of OMS voor intraveneuze zuurstoftoediening. Dit wordt bereikt met behulp van een high-shear homogenisator en een gastight tank om OMS te produceren en serieel te concentreren. De tweede stap is het gebruik van gemodificeerde spuiten om een LOM-emulsie te extruderen die 70 volumeprocent zuurstof bevat.Vervolgens wordt de emulsie door centrifugatie geconcentreerd om een zuurstofschuim met een volumepercentage van 90% te verkrijgen. De laatste stap is het uitvoeren van de kwaliteitscontrole door het volumepercentage zuurstof te berekenen en de deeltjesgrootteverdeling te beoordelen met behulp van lichtverstrooiingstechnologie. Uiteindelijk levert homogenisatie bij hoge afschuifkracht twee liter OMS op die voor 90% uit zuurstof bestaat (volumeprocent).Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande productiemethoden zoals sonicatie en amalgamatie is dat homogenisatie zelfassemblerende microbellen produceert op een schaal van liters, een volume dat noodzakelijk is voor tests met therapeutische zuurstoftoediening bij grote dieren. Een van de toepassingen van deze techniek is de behandeling van patiënten met ernstige hypoxemie, omdat met zuurstofgas gevulde microbellen binnen enkele seconden zuurstof overdragen aan deoxyhemoglobine en drie keer zoveel zuurstof bevatten als bloed Visual. Demonstratie van deze methode is belangrijk met betrekking tot de diepte van de homogenisatorkop.Het handhaven van een puur geoxideerde omgeving en het onderscheiden van geconcentreerde LMS ten opzichte van de waterige fase kan lastig te beoordelen zijn. Het systeem voor de productie van lipide-gebaseerde zuurstofmicrobellen of OMS bestaat uit een bewaar- en concentratietank (HCT) voorzien van een enkelstapsmenger, een inline high-shear homogenisator, een rolpomp voor het verplaatsen van vloeistof tussen de HCT en de homogenisator en een warmtewisselaar.Om de systeemopstelling te beginnen, plaatst u een gesteriliseerd glazen opvangvat van vier liter met een brede opening, voorzien van twee basispoorten en drie zijpoorten, onder de enkeltrapsmenger. Voorzie een van de basispoorten van de HCT poort nummer één met een steriele transparante slang met een binnendiameter van drie achtste inch, ongeveer 10 inch lang, voorzien van een driewegkraan aan het uiteinde voor het opvangen van de geconcentreerde emulsie. Voorzie vervolgens de tweede basispoort, poort nummer twee, met een steriele slang met een binnendiameter van drie achtste inch en een lengte van ongeveer 36 inch. Leid deze slang door de rollerpomp.De inlaat van de high-shear homogenisator is voorzien van een T-stuk met twee poorten. Verbind een slang van poort nummer twee via de rollerpomp met de zijpoort van het T-stuk. Sluit de andere poort aan op een zuurstoftank met behulp van een zuurstofgasflowmeter met een laag debiet.Verbind de uitlaatpoort van de high-shear homogenisator met de inlaatpoort van een inline warmtewisselaar die op 4 °C wordt gehouden. Verbind de uitlaatpoort van de warmtewisselaar met de retourpoort van de HCT om een gesloten lussysteem te creëren. Sluit de zuurstoftank via een debietmeter aan op poort nummer vier van de HCT.Bevestig tot slot een gascompositiemonitor die openstaat naar de atmosfeer aan de bovenste poort van de HCT. Om met deze procedure te beginnen, plaatst u 20 gram GMP een twee DYS steer olie, SN glycerol drie PHOSPHOCHOLINE of DSPC en 10 gram cholesterol in de bodem van de HCT. Voeg één liter plasma light A toe aan de HCT en roer dit één minuut lang met de hand om zoveel mogelijk lipiden in de waterige fase te integreren.Laat de enkeltrapsmenger in de waterige fase zakken en zorg ervoor dat de volledige mixerkop door de waterige fase wordt bedekt. Om te voorkomen dat omgevingslucht de headspace verontreinigt, dienen rubberen afdichtingen of tape te worden gebruikt om te garanderen dat de bovenkant van de HCT gasdicht is en dat er geen open zijpoorten zijn. Zet de gasbron aan die is aangesloten op poort nummer vier en wacht tot de zuurstoffractie van de HCT-headspace hoger is dan 95%. Meng de precursor-emulsie gedurende vijf minuten met de enkeltrapsmenger. Bij 5.000 RPM moet het resulterende mengsel bleekwit ogen en geen zichtbare lipidklonten bevatten.Zodra gemengd, kan het ongebruikte lipide-watermengsel tot 30 dagen bij vier graden Celsius worden bewaard voor eenmalig gebruik. Ontlucht het volledige gesloten lussysteem met de precursor-emulsie door de rollerpomp in te schakelen op 1,3 liter per minuut of LPM. Zodra het systeem is ontlucht, blijft de pomp aanstaan op 1,3 LPM om te beginnen met de productie van de LO's.Zet de inline high-shear homogenisator aan op 7.500 RPM. Zet direct daarna de zuurstoftoevoer naar het inlaatgedeelte van de homogenisator aan op 0,5 LPM. Houd de enkelstapsmixer in de HCT aan op 3.500 RPM.Oms worden gevormd op het grensvlak van de rotorbladen en de emulsiesieven binnen de inline-homogenisator. Binnen de eerste paar minuten moet de vloeistof zichtbaar viskeuzer worden. Laat het systeem 15 minuten draaien en schakel vervolgens de high-shear homogenisator en de zuurstofinlaat daarvan uit.Dit vermindert fasescheiding en houdt het product relatief uniform binnen de HCT. Let op dat het volume van de gasgevulde emulsie ongeveer twee tot drievoudig moet toenemen tijdens de seriële concentratiefase. De 140 milliliter luer-lock spuiten voor het opvangen van de geproduceerde OMS zijn vooraf aangepast door 100 milliliter lucht in de spuit te trekken en vervolgens het overtollige zuiger- en spuitmateriaal boven de 140 milliliter markering af te zagen.Bevestig een steriele gemodificeerde spuit aan de stopkraan van poort nummer één op het opvangvat; gebruik getande pincetten om de zuiger te laten zakken en trek 100 milliliters vloeistof op. Sluit de spuit stevig af met een dop en herhaal dit proces totdat alle vloeistof is verwijderd. Centrifugeer de spuiten met de afgedopte zijde naar beneden in een gekoelde centrifugeerbak bij 225 ×g gedurende 10 minuten. Na centrifugatie zullen drie lagen materiaal zichtbaar zijn; verwijder en gooi de onderste laag van de overtollige troebele waterige fase weg.De tweede laag is helderwit en bevat geconcentreerde oms. Breng het geconcentreerde schuim over naar een gasondoorlatende glazen spuit met behulp van een driewegkraan om contaminatie door omgevingsgas te voorkomen. Verwijder de laatste laag, die vrij zuurstofgas bevat afkomstig van gebroken oms.De schuimkwaliteit kan worden beoordeeld door de gasconcentratie als volgt te berekenen. Een schuim van hoge kwaliteit zal een gasconcentratie bereiken van groter dan of gelijk aan 90 volume procent; als tweede kwaliteitscontrole wordt de grootte van de microbellen bepaald via optische lichtverstrooiing om vast te stellen of de deeltjesgrootte binnen het verwachte bereik ligt. Er moet rekening mee worden gehouden dat een wijziging in de homogenisatietijd of de formulering de belgrootte kan beïnvloeden; sluit de glazen spuiten die geconcentreerde oms bevatten stevig af.Met een lure lock-aansluiting kunnen spuiten worden bewaard bij 22 °C, 4 °C of -20 °C. Lagere temperaturen kunnen zorgen voor een verbeterde stabiliteit van de houdbaarheid. Met dit protocol kan in 90 minuten tot twee liter geconcentreerde OMS worden geproduceerd.Visualisatie van een monster van 10 µL OMS middels lichtmicroscopie toonde sferische OMS en een relatieve hoeveelheid lipiderestanten aan. Wanneer hetzelfde monster OMS werd beoordeeld via optische verstrooiing, was de gemiddelde particeldiameter 2,624 ± 0,332 µm. Meer dan 90% van de OMS had een diameter van minder dan 10 µm en de populatie was polydispers.De viscositeit van de emulsie was sterk afhankelijk van de gasfractie en daarmee van de concentratie microbellen. Aliquoten van 2 milliliter LOM-emulsie bij 60, 70 en 90 volume procent gas werden bestudeerd met een steady-state flow sweep met behulp van een parallelle plaat van 40 millimeter.De geometrie vertoonde een radiologisch profiel dat vergelijkbaar was met menselijk bloed bij OMS met 60 volumeprocent gas, terwijl de spanning varieerde van 0,1 tot 1000 past gass. Het zuurstofgehalte van OMS werd getest door variërende volumes zuurstof, opgenomen in 60 volumeprocent OMS, toe te voegen aan aliquoten gedesatureerd menselijk bloed met een bekend zuurstoftekort. De relatie tussen het toegevoegde volume zuurstof binnen de OMS en de volumetrische toename van het zuurstofgehalte in het bloed was 1,053 plus of minus 0,03025.Dit suggereert dat de geteste OMS bijna 100% zuurstof bevatten, weinig ingesloten gasbellen vertoonden en hun volledige zuurstoflast in vitro effectief overdroegen op menselijk bloed. Zodra deze techniek beheerst is, kunnen er bij een correcte en efficiënte uitvoering in 90 minuten twee liter LMS worden geproduceerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de ophopende OMS visueel te blijven controleren en kwaliteitscontroles uit te voeren op de concentratie van het LOM-schuim. Na deze productieprocedure kan OMS worden gebruikt voor grootschalige intraveneuze injectie en toediening van therapeutische gassen.

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een ​​gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.

High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide...

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

De generatie van microfluïdische dubbele emulsies omvat doorgaans apparaten met een patroon van bevochtigbaarheid of op maat gemaakte glazen onderdelen. Hier beschrijven we de fabricage en het testen van een geheel uit polydimethylsiloxaan (PDMS) bestaande dubbele emulsiegenerator die geen oppervlaktebehandeling of gecompliceerde fabricageprocessen vereist en die in staat is om dubbele emulsies tot 14 µm te produceren.

Dubbele Emulsion Generation Met een Polydimethylsiloxaan (PDMS) Co-axiale Flow Focus Device

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Het protocol presenteert de geoptimaliseerde parameters voor de voorbereiding van thermogevoelige liposomen met behulp van de gespreide visgraat micromixer microfluidics apparaat. Dit maakt het ook mogelijk co-inkapseling van doxorubicin en indocyanine groen in de liposomen en de fotothermale geactiveerde release van doxorubicin voor gecontroleerde / getriggerde drug release.

Microfluïde productie van lysolipidenhoudende temperatuurgevoelige liposomen

Dit protocol beschrijft een methode om grote hoeveelheden lipide ingekapselde decafluorbutaan microbubbels te genereren met behulp van sonde-tip sonicatie en ze vervolgens te condenseren tot faseverschuiving nanodruppels met behulp van hogedruk extrusie en mechanische filtratie.

Productie van membraangefilterde faseverschuivingsdecafluorbutaan nanodruppels uit voorgevormde microbubbels

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Dit protocol schetst de fabricage van lipide microbubbels en een compatibele eenpots microbubbel radiolabelingmethode met zuiveringsvrije &gt;95% etiketteringsefficiëntie die de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen behoudt. Deze methode is effectief in verschillende formuleringen van lipide-microbubbels en kan worden aangepast om radioactieve en/of fluorescerende microbubbels te genereren.

Microbellen fabriceren en labelen met fluorescerende en radioactieve tracers

Echografie Gerichte microbelletjes Destruction (UTMD) kan worden gebruikt om site-specifieke levering van bioactieve moleculen, waaronder therapeutische genen direct, hun organen toegankelijk is voor echografie, zoals het hart en de lever...

Inleiding tot de Ultrasound Gerichte microbellen Destruction Techniek

Leer hoe je lipide-gebaseerde zuurstofmicrobellen produceert voor intraveneuze zuurstoftoediening met behulp van high-shear homogenisatie en seriële concentratie. Deze schaalbare methode levert twee liter emulsie met 90% zuurstof.

Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie (Video) | JoVE Journal

Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie

Meer video's verkennen