Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische veranderingen in het FTSZ-eiwit tijdens celdeling in bacteriën te observeren. Dit wordt bereikt door bacillus subtles-cellen die het FTS-gezegde GFP-fusie tot expressie brengen, op het oppervlak van een kleine aros-pad aan te brengen. De pad wordt vervolgens omgekeerd en overgebracht naar een petrischaal met een glazen dekglasbodem.

De tweede stap is om time-lapse beelden van de bacteriën tijdens celdeling te verkrijgen met behulp van een 3D-gestructureerd verlichtingsmicroscopie of 3D SIM-beeldvormingssysteem. Vervolgens wordt de kwaliteit van de ruwe gegevens beoordeeld en worden beelden met een intensiteitsvermindering van meer dan 30% als gevolg van fotobleking weggegooid. De laatste stap is om de veranderingen in de eiwitlokalisatie tijdens celdeling kwantitatief te analyseren door de fluorescentie-intensiteitsverdeling van het F-T-S-Z-G-F-P-eiwit in de loop van de tijd te meten.

Uiteindelijk wordt fast 3D SIM gebruikt om te laten zien hoe dynamisch de dione-eiwitten zijn tijdens celdeling in bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals confocale microscopie is dat we driedimensionale informatie krijgen over de veranderingen die plaatsvinden tijdens celdeling in levende cellen. Hoewel deze methode inzicht biedt in bacteriële cytokinese, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waarbij we dynamische eiwitveranderingen willen bekijken, zoals M-zoogdiercellen.

We kwamen voor het eerst op dit idee toen we traditionele 3D-sim-beelden van gefixeerde bacteriecellen zagen die aantoonden dat het FDZ-eiwit niet homogeen verdeeld was rond de zed-ring. We wilden verder onderzoeken of deze verdeling verband hield met veranderingen die plaatsvonden tijdens de zed-ringconstricie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze techniek worstelen vanwege een falen om de brekingsindex van hun olie aan te passen aan hun monster, en dit zal leiden tot beelden van slechte kwaliteit.

Om bacillus subtlest-cellen voor beeldvorming voor te bereiden, laat de cellen groeien tot de middenexponentiële fase zoals beschreven in het tekstprotocol. Bevestig vervolgens een zelfklevende frame op een standaard glazen microscoopglaasje door eerst de dunne polyesterfolie te verwijderen. Breng vervolgens het blootgestelde zelfklevende oppervlak van de frame aan op het oppervlak van het microscoopglaasje om effectief een vierkante put bovenop het glaasje te creëren, laat het dikke polyesterblad aan de frame bevestigd om het vastzetten van het dekglas in volgende stappen te voorkomen.

Melt vervolgens een aro-oplossing in de magnetron tot het kookt, pipet 67 microliter van de gesmolten aros in de zelfklevende frame. Plaats onmiddellijk een dekglas bovenop de aros om een platte oppervlakte te creëren en laat vijf tot 10 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder het dekglas gedurende één tot twee minuten terwijl het monster wordt geoogst.

Oogst een milliliter-aliquot van het monster na centrifugatie bij 8.000 RPM gedurende de seconden, decanteer het supernatant, resuspendeer het pellet in 200 microliter vers medium. Neem 2,5 microliter van het geconcentreerde monster en pipet op de voorbereide aros-pad. Verspreid het monster gelijkmatig over het platte oppervlak van de aros-pad.

Verwijder vervolgens de zelfklevende frame van het microscoopglaasje met behulp van een pincet zonder de aros-pad aan te raken. Breng de aros-pad over vanaf de microscoop. Glijd naar een 35 millimeter diameter petrischaal met een glazen dekglasbodem.

Voor hoogwaardige beeldvorming. Draai de aros-pad om zodat de celsuspensie in contact komt met het dekglas van de petrischaal. Op de dag van het experiment, zet het OMX 3D SIM-beeldvormingssysteem ten minste een uur voorafgaand aan de beeldvorming aan om het systeem en de lasers volledig te laten stabiliseren.

Schakel vervolgens de verschillende componenten in zoals vermeld in het tekstprotocol op de master controller werkstation. Open de OMX-software door op het pictogram te klikken. Stel het bestandspad in voor gegevensopslag naar een geschikte gegevensmap.

Start vervolgens de soft work-software. Schakel de lasers in die vereist zijn voor de experimenten op het hoofdscherm in de lichtparameterssectie. Activeer de FITC-camera vanuit de kanaalselectie en ga verder met het controleren van de parameters zoals vermeld in het tekstprotocol.

Breng een druppel olie aan op de bovenkant van het objectief. Plaats de petrischaal met de voorbereide cellen in de stage-inzet en dek af met het ronde verwarmingsdeksel. Laat de stage zakken tot het olie de bodem van de petrischaal raakt.

Laat de schaal 15 minuten gelijkmatig verwarmen. Gebruik in de stage een lage belichtingsinstelling, focus op het monster met behulp van de nano-positioneringsstage-bedieningselementen. Focus omhoog en omlaag door het monster om te bepalen of het licht gelijkmatig boven en onder het monster-brandpuntsvlak is verspreid. Gebruik vervolgens stappen van 0,5 micrometer en markeer de boven- en onderkant van de beeldstapel voordat u terugkeert naar het midden van het monster in het experimenttabblad, klik op de knop 'dikte ophalen' om de monsteracquisitiedikte in te stellen.

Bepaal de maximale intensiteitswaarde van de monsterafbeelding met de huidige belichtingsinstellingen en het percentage overgedragen licht. Deze waarde vindt u onder het beeldvenster. Voor time-lapse beeldvorming, pas de belichting en het percentage overgedragen licht aan om een maximale intensiteit van 1100 tot 1400 te verkrijgen.

Boven de achtergrond. Voor de afbeelding, activeer het time-lapse-gedeelte in het experimenttabblad. Stel de vereiste framesnelheid in en de totale tijd in het databestand.

Voer een geschikte bestandsnaam in. Klik op de knop 'uitvoeren' om de beeldacquisitie te starten aan het begin van de beeldacquisitie. Noteer de maximale intensiteitswaarde van