Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide
15 december 2014
We beschrijven een werkwijze voor het induceren neutrofiele longontsteking door uitdaging om vernevelde lipopolysacharide door verneveling, te modelleren acute longbeschadiging. Daarnaast worden fundamentele chirurgische technieken long isolatie, tracheale intubatie en bronchoalveolaire lavage beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om consistente en reproduceerbare luchtwegneutrofilie te genereren door blootstelling aan geaerosoliseerde LPS. Dit wordt bereikt door eerst LPS, opgehangen in zoutoplossing, in een vernevelaar te laden die is aangesloten op een blootstellingskamer. Vervolgens worden muizen blootgesteld aan het geaerosoliseerde LPS en dan wordt bronchoalveolaire lavage verzameld en worden inflammatoire cellen in de lavage geteld.
Ten slotte wordt het longweefsel gefixeerd in, formeel in voor inbedding en sectie en immunohistochemische analyse. Uiteindelijk kunnen de totale en differentiële celtellingen van de bronchoalveolaire lavage worden gebruikt om neutrofielenrekrutering naar de longen te beoordelen. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals intratracheale LPS-toediening zijn de gelijkmatige verdeling van geaerosoliseerde LPS door de longen, de gemakkelijke uitvoering en de minimale training die vereist is voor een succesvolle toepassing Om een LPS-aerosol te genereren met behoorlijke PPL en binnen een geventileerde biohazard kap van niveau twee, begint u door een rode inlaat in een vernevelaar te plaatsen en vervolgens de vernevelaar aan te sluiten op geperste kamerlucht door de slang die door de fabrikant is geleverd.
Gebruik vervolgens een luchtfilter om de uitlaat van de vernevelaar aan te sluiten op een massastroommeter en verbind vervolgens de massastroommeter met een elektrische voeding. Stel de luchtstroom in op vijf liter per minuut, houd de druk op één tot twee bar en verwijder vervolgens de massastroommeter en ontkoppel de luchtstroom. Verbind vervolgens de uitlaat van de vernevelaar naar een 15,9 millimeter bifurcerende buis die is verbonden met 2 1 50 bij 1 63 bij 2 0 5 millimeter plexiglasdozen voorzien van verwijderbare deksels.
Elke doos moet een vijf millimeter gat hebben aan de kant tegenover de inlaat om druk opbouw te voorkomen. Plaats nu maximaal vijf muizen in elke doos en sluit de deksels. Open vervolgens de vernevelaar.
Vul de inlaat met vier tot acht milliliter LPS opgelost in zoutoplossing of alleen zoutoplossing als drager, en sluit de inlaat weer aan op de luchttoevoer. Laat de aerosol stromen in de gesloten plexiglasdozen met continu toezicht op de dieren en zorg ervoor dat de luchttoevoer tijdens de aerosolisatie stevig vastgezet blijft aan de inlaat van de vernevelaar. Na 10 minuten ontkoppelt u de luchttoevoer en laat u de dieren nog twee minuten in de plexiglasdozen.
Open vervolgens de deksels. Laat de aerosol verspreiden en breng de muizen terug naar hun kooien op het experimentele eindpunt Voor elk dier afzonderlijk, maak eerst een enkele anterieure posterieure snede met een schaar om de thorax bloot te leggen. Til vervolgens het ribbenkastje op door de anterieure punt van het borstbeen en prik het diafragma op het meest ventrale punt zonder in enig longweefsel te snijden.
Open vervolgens het ribbenkastje met twee sneden die elkaar onder de kaak in anterieure posterieure richting ontmoeten. Zodra het ribbenkastje is geopend, gebruikt u een pincet om het voorzichtig uit elkaar te trekken en snijdt u de luchtpijp onder de larynx. Til nu de luchtpijp op en snijdt u de ligamenten die de longkwabben verbinden met de borstholte door.
Trek vervolgens voorzichtig de longen en luchtpijp omhoog en weg van het vet- en hartweefsel en plaats ze op een stuk spuitpakpapier. Breng vervolgens een 0,965 millimeter polyethyleenbuis in de luchtpijp in en bevestig deze met een draad van zijden draad. Bind ook de multi-kwab af met zijden draad en breng vervolgens een 23 gauge naald in de polyethyleenbuis in.
Gebruik vervolgens een enkele milliliter spuit om langzaam 250 microliter ijsgekoeld steriel PBS in de enkele kwab te injecteren en om voorzichtig de longen te tikken en tegen het oppervlak van de werkbank 30 keer langzaam het vocht weer in de spuit te trekken en het in een buis te verzamelen na het herhalen van de procedure met 200 microliter verse PBS, plaats de bronchoalveolaire lavage op ijs voor latere analyse. Om het longweefsel voor histologische analyse te fixeren, verwijdert u de multi-kwab en klikt u. Bevriez het op droog ijs.
Bewaar de kwab bij min 80 graden Celsius. Om het weefsel voor histologische analyse te fixeren, monteert u een 60 milliliter spuit zonder plunjer op een metalen ondersteuningsstand en blaast u de enkele kwab vijf minuten lang met formaline in. Ontkoppel vervolgens de naald en trek aan de zijden draad om deze samen met de polyethyleenbuis uit de luchtpijp te verwijderen.
Sluit tegelijkertijd de luchtpijp en houd de druk in de long vast. Dompel vervolgens de kwab 24 uur lang in formin bij vier graden Celsius. De volgende dag wast u het gefixeerde weefsel drie keer gedurende minimaal 20 minuten elke keer in 70% ethanol.
Na inbedding van het gedehydrateerde weefsel in parafilm, snijdt u de kwab in vier tot vijf micrometer secties en kleurt u de secties met hematine en eoin voor histologische beoordeling. Het totale aantal cellen in het bronchoalveolaire lavage vocht van muizen die zijn blootgesteld aan een aerosol die alleen met drager is gegenereerd, is typisch rond of onder de 200.000 cellen. De cellen bestaan uit 95 tot 100% mononucleaire cellen met slechts enkele lymfocyten en geen neutrofielen.
Muizen uitgedaagd met een milligram per milliliter geaerosoliseerde LPS. Tonen echter een verhoogd totaal aantal cellen in het bronchoalveolaire lavage vocht, typisch meer dan 500.000 cellen na zes uur met celinfiltraat dat hoog blijft na 24 uur, en met een celprofiel verschoven naar een overwicht van neutrofielen. Een soortgelijk ontstekingscellijfrent en pulmonaire neutrofilie wordt ook waargenomen met vernevelen van vijf milligram per milliliter LPS.
Neutrofielen werden waargenomen in de epitheliale submucosa evenals in de ruimtes rond de geleidende luchtwegen en bloedvaten na zes en 24 uur van LPS-uitdaging, maar niet bij controle. Met zoutoplossing behandelde muizen. Het totale eiwitgehalte in het bronchoalveolaire lavage v
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om neutrophiele pulmonale inflammatie op te wekken via verneveling van geaerosoleerde lipopolysacharide (LPS), ter modellering van acute longschade. Daarnaast worden de basischirurgische technieken voor longisolatie, tracheale intubatie en bronchoalveolaire lavage beschreven.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Longontsteking
- Acuut longletsel
Achtergrond
- Geaërosoliseerd LPS wordt gebruikt om een model te creëren voor het bestuderen van neutrofiele ontsteking.
- Bronchoalveolaire lavage maakt het mogelijk om ontstekingscellen te verzamelen.
- Inzicht in de rekrutering van neutrofielen is cruciaal voor het bestuderen van longziekten.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele technieken voor LPS-toediening.
Doel van de studie
- Om consistente neutrofielie van de luchtwegen te genereren in een gecontroleerde omgeving.
- Om de rekrutering van neutrofielen naar de longen te beoordelen.
- Om bestaande methoden voor het opwekken van longontsteking te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Laden van LPS gesuspendeerd in fysiologisch zout in een vernevelaar.
- Blootstellen van muizen aan verneveld LPS in een blootstellingskamer.
- Verzamelen van bronchoalveolaire lavage voor celenumeratie.
- Fixeren van longweefsel voor immunohistochemische analyse.
Belangrijkste resultaten
- Effectieve rekrutering van neutrofielen aangetoond met behulp van geaërosoleerde LPS.
- Een betrouwbare methode geboden voor het beoordelen van longontsteking.
- Voordelen aangetoond in distributie en gebruiksgemak in vergelijking met intratracheale methoden.
- Gedetailleerde analyse van ontstekingsreacties in longweefsel mogelijk gemaakt.
Conclusies
- De methode met geaërosoliseerde LPS is een waardevol instrument voor het bestuderen van pulmonale ontsteking.
- Deze techniek maakt reproduceerbare resultaten mogelijk in onderzoeksomgevingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om therapeutische interventies te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt een reproduceerbare inductie van pulmonale neutrofielie mogelijk, een belangrijk pathologisch kenmerk bij acuut longletsel en inflammatoire longziekten. Door een gestandaardiseerd, kostenefficiënt aerosol-toedieningssysteem te bieden, ondersteunt het de validatie van targets en het mechanistisch beperken van risico's in vroege ontdekkingsprogramma's die gericht zijn op neutrofiel-gemedieerde longpathologie. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door kwantificeerbare inflammatoire read-outs te leveren die relevant zijn voor therapeutische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar mechanismen van neutrofielrekrutering en chemokinepaden zoals CXCL1 en CXCL2 in een gecontroleerde inflammatoire setting.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd model voor het evalueren van target-interactie en padmodulatie bij door neutrofielen gedreven longontsteking.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare resultaten van bronchoalveolaire lavage, waaronder totale en differentiële celaantallen en totale proteïneniveaus voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van reproduceerbare inflammatoire eindpunten voor het screenen van verbindingen die de influx of activatie van neutrofielen moduleren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert ziekterelateerde neutrofiele ontsteking zoals waargenomen bij acute longschade bij mensen, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door een consistente evaluatie van ontstekingsremmende of neutrofiel-modulerende verbindingen over verschillende studies mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinisch efficiecy-onderzoek, in het bijzonder voor programma's die gericht zijn op pulmonale ontsteking en neutrofiel-gemedieerde weefselschade.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van neutrofiele chemoattractant-paden en modulatie van de inflammatoire cascade in het longparenchym.
- Screening: Levert gestandaardiseerde neutrofiele inflammatie voor betrouwbare screening van verbindingen en targetvalidatie in longziektemodellen.
- Analytica: Biedt kwantitatieve resultaten van bronchoalveolaire lavage (celtellingen, proteïneniveaus, neutrofielenpercentage) om inflammatoire responsen over verschillende experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Modelleert mensrelevant neutrofiel pulmonaal ontsteking, wat preklinische continuïteit mogelijk maakt voor acuut longletsel en gerelateerde indicaties.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een kosteneffectief platform dat minimale training vereist voor herhaaldelijk gebruik in meerdere projecten die longontsteking of gastheer-pathogeen interacties bestuderen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door de variabiliteit in de inductie van neutrofiele ontsteking te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde aerosoltoediening en minimale eisen aan technische expertise.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de ontdekkingspipeline mechanistisch relevante, kwantificeerbare inflammatoire fenotypes te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van consistente gegevens over neutrofielrekrutering en chemokine-expressie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basisbeoefening in aerosolgeneratie, het hanteren van muizen en de techniek voor bronchoalveolaire lavage.
- is afhankelijk van toegang tot een vernevelaar, een persluchtbron, een blootstellingskamer van plexiglas en een veiligheidskast voor het hanteren van LPS.
- Necessiteert standaardisatie van de LPS-concentratie, de blootstellingsduur en de conditionering na blootstelling tussen laboratoria voor vergelijkbaarheid tussen studies.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het systeem voor het toedienen van andere vernevelde agentia, zoals virale of bacteriële pathogenen.
- Beperkt tot niet-GMP verkennend onderzoek; niet geschikt voor gereguleerde toxicologie of de productie van klinisch materiaal zonder aanvullende validatie.
