Name: Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer een methode voor het genereren van pulmonale neutrofilie met behulp van geaerosoliseerd lipopolysaccharide in muizen. Deze techniek maakt betrouwbare analyse van neutrofiele ontstekingsreacties in longweefsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Zweden), Benita Dahlberg en Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Zweden), evenals Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Canada) bedanken voor bekwame hulp en deskundig advies.

Het dier studies werden goedgekeurd door de Noordelijke Stockholm dierenwelzijn ethische commissie. De experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zweedse wetgeving. 1. Het genereren van een LPS Aerosol <ol><li> Los 0,5 g gezuiverd P. aeruginosa LPS in 50 ml steriele zoutoplossing onder zacht schudden en controleer of ontbinding. Verdun 1 ml LPS opgelost in 9 ml steriele zoutoplossing tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. Beschermen tegen licht met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Ontdooi oplosbaar LPS in het donker bij kamertemperatuur en direct goed mengen voor gebruik. </li><li> In een geventileerde niveau II biohazard kap, plaatst u een rode inlaat in een vernevelaar, en sluit de vernevelaar aan onder druk staande lucht in de ruimte via de slang van de fabrikant (beoordeling regeling presentatie van de experimentele apparaten in figuur 1). LET OP: geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een half gezicht stuk herbruikbare respiratof met roetfilters, bril, handschoenen en beschermende kleding moet worden gebruikt in de loop van de blootstelling. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Schematische weergave van de experimentele toestellen voor het opwekken van een aërosol De inlaat van de vernevelaar aangesloten op een luchttoevoer. De uitlaat van de vernevelaar wordt eerst verbonden met een stromingsmeter via een 15,9 mm buis en een luchtfilter en luchttoevoer wordt op 5,0 l / m bij 2 kbar druk. De uitlaat is verbonden naast een plexiglas doos voorzien van dekseltjes en 5 mm gaten om drukopbouw te voorkomen. <ol start="4"><li> Verbind de uitlaat van de vernevelaar met een massa debietmeter via een luchtfilter. Sluit de massa flowmeter op een elektrische voeding. </li><li> Stel de luchttoevoer naar 5 l / min, met de druk nog op een 1,0-2,0 bar. </li><li> Verwijder de massa flowmeter enKoppel de luchttoevoer. </li><li> Verbind de uitlaat van de vernevelaar een 15.9 mm buis, die vertakt en verbindt twee plexiglas dozen met de afmetingen: 150 x 163 x 205 mm, voorzien van afneembare deksels. Elke doos zou een 5 mm gat in de zijde tegenover de inlaat, om drukopbouw te voorkomen. </li><li> Plaats maximaal 5 muizen in elke plexiglas doos en sluit de deksels. </li><li> Open de vernevelaar en vul de insert met minstens 4 ml LPS opgelost in steriele zoutoplossing of voertuig alleen (steriele zoutoplossing; het volume mag niet groter zijn dan 8 ml). Opnieuw Sluit de inlaat van de luchttoevoer. </li><li> Laat de aerosol te stromen in de gesloten plexiglas dozen voor 10 min. Permanent toezicht op de dieren. Zorg ervoor dat de luchttoevoer blijft stevig op de inlaat van de vernevelaar. </li><li> Koppel de luchttoevoer. Bij gesloten deksel, laat de dieren in de plexiglas dozen gedurende 2 min. </li><li> Open de deksels en zorgen voor de aerosol te verspreiden, en de terugkeer van de dieren naar thij kooien. Als de dieren lijken nat, leg de kooien op een verwarming pad ingesteld op laag vuur, om onderkoeling te voorkomen. </li><li> Toezicht houden op de dieren onafgebroken gedurende de eerste 30 minuten, en daarna om de 2 uur voor de eerste 6 uur. De dieren moeten normale ademhalingspatroon en activiteit vertonen tijdens en na de verneveling procedure. </li></ol> 2. Bronchoalveolaire lavage (BAL) <ol><li> Aan de experimentele eindpunt, diep verdoven van de dieren met isofluraan van kracht, zoals aanbevolen door het veterinaire personeel van uw instelling. Knijp de achterpoot te controleren op een terugtrekking reflex om voldoende diepte van de anesthesie te garanderen aan een grote operatie uit te voeren. Spray beneden de vacht van de dieren met 70% ethanol. </li><li> Open de buik met een schaar en verbreken de aorta aan het dier exsanguinate. Leg een stukje weefsel over de buik om te genieten van het bloed. </li><li> Follwing euthanasie, gebruik dan een enkele anterior-posterior snit van de schaar omde thorax bloot. Til de ribbenkast van de voorste punt van het borstbeen en het gebruik van de schaar om het membraan op de meest ventrale punt doorboren, zonder te snijden in een long kwab. Open de ribbenkast door het maken van twee sneden in de anterior-posterior richting (vergadering onder de kaak). </li><li> Trek voorzichtig uit elkaar de ribbenkast behulp van een tang, en snijd de luchtpijp onder het strottenhoofd. </li><li> Til de luchtpijp met de tang en verwijder de longen door het snijden van de ligamenten aansluiten van de lobben van de borstholte, en zachtjes te trekken door de vet- en hartweefsel. </li><li> Plaats een polyethyleen buis (inwendige diameter: 0,58 mm; buitendiameter: 0,965 mm) in de luchtpijp en zet de buis met een koord van zijden draad. </li><li> Bind de multilobe (de vier lobben van de rechter long) met zijden draad. </li><li> Plaats een 23 gauge naald in de polyethyleen buis en injecteer langzaam 250 ul van ijskoude steriele PBS in de enkele kwab met een spuit van 1 ml. </li><li> Tikt u voorzichtig de longen30 keer en het verzamelen van de vloeistof door de spuit. Herhaal de procedure met 200 ul PBS (ongeveer 300 ul PBS zal worden verhaald op de enkele kwab van de totale geïnjecteerde volume van 450 pi). </li><li> Houd de bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) op ijs, of sommen de BAL cellen onmiddellijk. Tel de cellen met een heamocytometer, met Turk oplossing om de cellen 11 te kleuren. Bereken het totale aantal cellen door het aantal cellen te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van de kleuroplossing en het volume binnen de getelde gebied van de heamocytometer. </li><li> Bereid differentiële cel tellingen van cytocentrifuged cellen zoals elders 11 beschreven. </li></ol> 3. formalinefixatie van longweefsel voor histologische Assessment <ol><li> Verwijder de multilobe en snap-vries op droog ijs. Bewaren bij -80 ° C. </li><li> Monteer een 60 ml spuit met de zuiger verwijderd op een metalen statief. Vul de spuit met 10% formaline voorde hoogte van 20 cm boven het laboratorium bankje, wat neerkomt op 20 cm van de constante druk. </li><li> Sluit de 23 gauge naald bevestigd aan de luchtpijp naar de injectiespuit 60 ml via een kunststof buis met een klep om de stroom van formaline regelen. </li><li> Insufflate de long kwab met formaline gedurende 5 min. Koppel de naald en verwijder deze samen met de polyethyleen buis van de luchtpijp, terwijl trekken aan de zijden draad aan de luchtpijp te sluiten en te behouden de druk in de longen. </li><li> Dompel de long kwab in formaline en vast te stellen voor 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Was de vaste weefsel driemaal gedurende tenminste 20 minuten met 70% ethanol en drogen xyleen door de volgende behandeling (1 uur elk): <ul><li> 3x 70% ethanol </li><li> 3x 95% ethanol </li><li> 3x 100% ethanol </li><li> 3x xyleen </li><li> 1x (vloeibare) paraffine </li></ul></li><li> Insluiten uitgedroogd weefsel in paraffine, snijd in 4-5 micrometer secties, en vlek met hematoxyline en eosine om voor histologische evaluatie.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
<li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li>
<li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li>
<li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmaceutical+sciences%22%5BJournal%5D)">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
<li>Roos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial-C%2FEBPbeta+contributes+to+LPS-induced+inflammation+and+its+suppression+by+formoterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).</li>
<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

Abraham Roos heeft een docent vergoeding van Boehringer Ingelheim, reisbeurzen van AstraZeneca R &amp; D en een onderzoeksbeurs van AstraZeneca R &amp; D ontvangen. Magnus Nord is een full-time medewerker van AstraZeneca R &amp; D en heeft onderzoekssubsidies ontvangen van AstraZeneca R &amp; D. Johan Grunewald en Tove Berg zijn co-onderzoekers op een niet-verwante onderzoeksproject gefinancierd door AstraZeneca R &amp; D.

Aerosolized LPS genereert een ontstekingsreactie in de luchtwegen, gekenmerkt door neutrofielen in epitheel submucosa, ruimten rond de geleidende luchtwegen, alsmede de alveolaire ruimten. Dit, samen met de verhoogde totale eiwitgehalte in BALF, indicatief plasmalekkage, vertegenwoordiger van de pathologie van acute longbeschadiging. Als LPS induceert een steriele ontsteking, de reactie is onafhankelijk van de adaptieve immuunrespons, en er zijn beperkingen voor de relevantie voor bacteriële infecties. De techniek kan e...

Lipopolysaccharide (LPS) is een celwand component van Gram-negatieve bacteriën 1. Uitdaging aan LPS is een goed gedocumenteerde model van acute longbeschadiging, een syndroom gekenmerkt door acute neutrofiele ontsteking en oedeem 2. Bovendien, pulmonaire neutrofiel is een kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD) 3 en LPS uitdaging bij mensen werd gebruikt om het model COPD exacerbaties 4. Zo, experimentele modellen van LPS blootstelling zijn klinisch relevante en waardevolle instrumenten voor de menselijke pathologie te begrijpen. Doel van de pulmonaire toediening van aërosol LPS hier beschreven om een ​​neutrofiele ontstekingsreactie in de geleidende en luchtwegen, zonder systemische betrokkenheid genereren. Verscheidene technieken van LPS uitdaging zijn eerder beschreven. Intra-veneuze injectie van LPS is de meest gebruikte toedieningsweg. Hoewel deze techniek is gemakkelijk te bereiken, tHij primaire schade aan het endotheel, met secundaire vernietiging van de longepitheel volgende neutrofiel migratie naar de longen. Intra-veneuze toediening induceert ook systemische inflammatie 2, waarbij het ​​ziektebeeld bemoeilijken in diermodellen. Systemische ontsteking in tegenstelling niet waargenomen met intratracheale toediening. Deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist anesthetica en aanzienlijke training 5, 6. Bovendien pulmonaire depositie door deze wijze van toediening is afhankelijk van de ademhaling 7. Aldus wordt pulmonaire depositie beïnvloed door de diepte van anesthesie nodig voor de intra- tracheale toediening en differentiële depositie in de luchtwegen kan worden waargenomen. Daarentegen pulmonaire toediening met aërosol LPS vereist minimale training, en kan gemakkelijk worden bereikt op een groot aantal dieren met weinig of geen variatie tussen individuen 5, 8.Een recente studie bevestigt dat aerosolafgifte superieur is aan de intratracheaal inzake depositie die relevanter doses LPS induceren neutrofiele ontsteking met dit model 8. Eerdere studies hebben aangetoond dat uitdaging aërosol Pseudomonas aeruginosa LPS genereert een sterke ontstekingsreactie in de luchtwegen lumen longparenchym, waaronder de alveolaire ruimten 9, 10. De ontsteking wordt gekenmerkt door een overwegend neutrofielen en aanwezigheid van longoedeem, en kan dus worden gebruikt om pathogenese van acute longbeschadiging te pakken en krijgen verdere kennis van de mechanismen die bijdragen aan ziekte pathologie.

<table><tbody><tr><td>Gezuiverd &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Schadelijk. Aanbevolen zuivering. LPS gezuiverd uit andere bacteriën kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Pari LC sprint star nebulizer</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>TSI mass flowmeter 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>Alternatief product van de leverancier kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Saint-Gobain 15,9 mm Tygon slang</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>Aanbevolen merk.</td></tr><tr><td>Plexiglas boxen met afneembare deksels</td><td>Custom built</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (een gat van 2 mm aan de zijkant).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3M Half Facepiece Reusable Respirator</td><td>3M</td><td>7503</td><td>Aanbevolen merk.</td></tr><tr><td>3M Advanced Particulate Filters (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>Aanbevolen merk.</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>Voorkeurschaar kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>Voorkeurspincet kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Intramedic PE50 polyethyleenslang</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Aanbevolen merk.</td></tr><tr><td>Ethicon 2-0 Perma-hand zijden draad</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Aanbevolen merk.</td></tr><tr><td>26 &amp;frac12; gauge naald</td><td></td><td></td><td>Alternatieve leveranciers zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>1 ml BD slip-tip spuit, niet steriel</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>Alternatieve leveranciers zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>60 ml BD Luer-Lok spuit, niet steriel, polypropyleen</td><td>BD</td><td>301035</td><td>Alternatieve leveranciers zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>Fluka Hematoxiline-Eosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>Alternatieve leveranciers zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>T&amp;uuml;rk-oplossing</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Tafelcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Alternatieve fabrikanten zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>Cytospin 4 cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Alternatieve centrifuge kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>Alternatieve kleuringskits zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>Formalineoplossing, neutraal gebufferd, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Alternatieve leveranciers zijn beschikbaar.</td></tr></tbody></table>

een methode voor het genereren van pulmonale neutrofilie behulp aerosolized lipopolysaccharide

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is een ernstige ziekte die wordt gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, met beperkte behandelingsmogelijkheden en een hoge mortaliteit. Experimentele modellen van ALI zijn sleutel in het verbeteren van ons begrip van de pathogenese van de ziekte. Lipopolysaccharide (LPS) afkomstig van grampositieve bacteriën induceert neutrofiele ontsteking in de luchtwegen en longen parenchym muizen. Efficiënte pulmonaire afgifte van verbindingen zoals LPS is echter moeilijk te realiseren. In de hier beschreven aanpak wordt pulmonaire toediening bij muizen bereikt door uitdaging om vernevelde Pseudomonas aeruginosa LPS. Opgelost LPS werd verstoven door een vernevelaar aangesloten op perslucht. Muizen werden blootgesteld aan een continue stroom van LPS aerosol in een plexiglas doos gedurende 10 minuten, gevolgd door 2 minuten conditioneren nadat de aerosol werd beëindigd. Tracheale intubatie en daaropvolgende bronchoalveolaire lavage, gevolgd door formaline perfusie werd vervolgens uitgevoerd, die het mogelijk maakt karakterisering van de steriele pulmonary ontsteking. Aerosolized LPS genereert een longontsteking gekenmerkt door alveolaire neutrofilie, gedetecteerd in bronchoalveolaire lavage en door histologische evaluatie. Deze techniek kan worden ingesteld tegen een kleine prijs met weinig apparatuur, en vereist een minimale training en expertise. Het belichtingssysteem kan dus routinematig worden uitgevoerd bij elk laboratorium, met het potentieel om ons begrip van longpathologie verbeteren.

Uitdaging om vernevelde P. aeruginosa LPS levert meestal een duidelijke ontstekingsreactie lumen van de luchtwegen en alveolaire ruimte, gekenmerkt door een overwegend neutrofielen zowel vroege als late tijdstippen. Aerosolized LPS induceert pulmonale neutrofilie C57BL / 6BY en BALB / c-muizen werden blootgesteld aan vernevelde P. aeruginosa LPS of voertuig alleen en neutrofielen werden in BALF opgesomd. Het totale celaantal in BALF van C57BL / 6BY...

We beschrijven een werkwijze voor het induceren neutrofiele longontsteking door uitdaging om vernevelde lipopolysacharide door verneveling, te modelleren acute longbeschadiging. Daarnaast worden fundamentele chirurgische technieken long isolatie, tracheale intubatie en bronchoalveolaire lavage beschreven.

Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Het algemene doel van deze procedure is om consistente en reproduceerbare neutrofielie van de luchtwegen te genereren door blootstelling aan geaerosoleerd LPS. Dit wordt bereikt door eerst LPS, gesuspendeerd in zoutoplossing, in een vernevelaar te laden die is verbonden met een blootstellingskamer. Vervolgens worden muizen blootgesteld aan het geaerosoleerde LPS, waarna een bronchoalveolaire lavage wordt verzameld en de ontstekingscellen in de lavage worden geteld.Ten slotte wordt het longweefsel gefixeerd in formaline voor insluiting, coupesnijden en immunohistochemische analyse. Uiteindelijk kunnen de totale en differentiële celgetallen van de bronchoalveolaire lavage worden gebruikt om de rekrutering van neutrofielen naar de longen te beoordelen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intratracheale toediening van LPS, zijn de gelijkmatige verspreiding van geaerosoleerd LPS door de longen, het gemak van uitvoering en de minimale training die vereist is voor een succesvolle toepassing. Om een LPS-aerosol te genereren, met gebruik van passende PBM en in een geventileerde biohazard-kast van niveau twee, begint u met het plaatsen van

a-method-for-generating-pulmonary-neutrophilia-using-aerosolized

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

This video describes the procedure for generating an air pouch in the subcutaneous tissue of mice and collecting inflammatory exudates in response to lipopolysaccharide administration in vivo. This video also covers the analysis of the neutrophil infiltration in the air pouch.

An Air Pouch Mouse Model for Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Exudate Collection

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Het huidige werk illustreert het gemak van het gebruik van sublinguale immunotherapie om de aangeboren immuunrespons in de longen te versterken en bescherming te bieden tegen acute pneumokokkenpneumonie bij muizen.

Sublinguale immunotherapie als een alternatief voor bescherming tegen acute luchtwegeninfecties Induce

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Muizen blootgesteld aan intraperitoneaal LPS afscheiden exosomes in Broncho-alveolaire lavage (BAL) vloeistof die zijn ingepakt met miRNAs. Met behulp van een systeem co cultuur tonen we dat exosomes vrijgegeven in de BAL vloeistof expressie van strakke junction eiwitten in bronchiale epitheliale cellen verstoren en verhogen van expressie van pro-ontsteking cytokinen die long letsel accentueren.

Bronchoalveolar Lavage Exosomes Lipopolysaccharide-geïnduceerde septische long letsel

Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap procedure om acute longschade in muizen induceren door directe intratracheal lipopolysaccharide instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage vloeistof, en longweefsel. Minimale invasieve, eenvoudige handling, goede reproduceerbaarheid, en titratie van de ziekte ernst zijn voordelen van deze aanpak.

Inducerende acute Long blessure bij muizen door directe Intratracheal lipopolysaccharide instillatie

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.

Niet-invasieve intratracheale lipopolysaccharide-instillatie bij muizen

In deze studie is aangetoond dat een niet-invasieve endotracheale installatietechniek ALI bij ratten ontwikkelt met behulp van een basislaryngoscoop om een precieze LPS-afgifte aan de longen te garanderen. De LPS wordt toegediend via een endotracheale buis met behulp van een laryngoscoop. De omvang van het longletsel wordt op meerdere tijdstippen beoordeeld.

Niet-invasieve endotracheale toediening van lipopolysaccharide om acute longschade bij knaagdieren te induceren

Leer een methode voor het genereren van pulmonale neutrofilie met behulp van geaerosoliseerd lipopolysaccharide in muizen. Deze techniek maakt betrouwbare analyse van neutrofiele ontstekingsreacties in longweefsel mogelijk.

Een methode voor het genereren van Pulmonale neutrofilie behulp Aerosolized Lipopolysaccharide

Meer video's verkennen