Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording
29 maart 2014
GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.
Presynaptische inhibitie is een van de krachtigste inhiberende mechanismen in het ruggenmerg. Pathologische veranderingen in de presynaptische inhibitie zijn van belang bij verschillende ziektepatronen. Voorbeelden hiervan zijn neuropathische en inflammatoire pijn, evenals abnormale centrale pijnverwerking.
Dit is van belang bij letsel aan het ruggenmerg en bij aandoeningen van het centrale zenuwstelsel met motorische hyperexciteerbaarheid. Wanneer diermodellen voor deze aandoeningen worden onderzocht, biedt kennis over de sterkte van de presynaptische inhibitie daarom waardevolle informatie. Wij presenteren hier een methode om de presynaptische inhibitie in een muismodel te beoordelen.
In vivo presynaptische inhibitie wordt gemedieerd door depolarisatie van primaire afferenten, die wordt geïnduceerd door GABAerge axo-axonale synapsen op sensorische presynaptische vezels. GABA$_A$-receptoractiviteit leidt tot een toename van de chlorideconductantie, wat vervolgens primaire afferente depolarisatie teweegbrengt vanwege de lokale ionenconcentratieverdeling. Deze depolarisatie blokkeert de propagatie van actiepotentialen naar de axonale terminals en vermindert hun sterkte, wat leidt tot een afname van de calciuminstroom en een reductie van de transmittervrijgave.
Zo kunnen de exciterende postsynaptische potentialen in monosynaptisch exciterende motorneuronen worden geremd zonder het postsynaptische membraanpotentiaal en de exciteerbaarheid van de motorneuronen te veranderen. Het volumegeleidde potentiaal van deze primaire antidromische depolarisatie geeft een directe maat voor de presynaptische inhibitie in het ruggenmerg; deze potentialen kunnen worden gemeten vanuit de dorsale wortels van het ruggenmerg na stimulatie en worden dorsale wortelpotentialen genoemd. De meting van dorsale wortelpotentialen is goed vastgesteld en is veelvuldig toegepast bij katten, ratten en kikkers, maar bij muizen zijn opnames bijna uitsluitend uitgevoerd in ex vivo geïsoleerde ruggenmergpreparaten. Hier beschrijven we een methode om deze wortelpotentialen in vivo op te nemen bij geanestheseerde muizen, wat een directe meting van de presynaptische inhibitie in het intacte organisme mogelijk maakt.
Voor de in vivo registratie van DRP bij muizen is de volgende apparatuur nodig. Standaard chirurgische instrumenten, een stereomicroscoop en drie handmatige manipulatoren voor het respectievelijk positioneren van de stimulatie-elektrode, de registratie-elektrode en de referentie-elektrode. Daarnaast zijn een muizenframe en een verwarmingsmat nodig om de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de stimulatie en registratie te regelen, evenals een stimulator.
Een standaardversterker en een gegevensverzamelingssysteem zijn nodig om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Tijdens de opname van de DRP zijn op maat gemaakte sectie-elektroden nodig; voor de vervaardiging hiervan worden conventionele glazen buisjes uitgetrokken met een standaard pipetpuller.
Breek de punt van de elektrode af met een diamantvijl om de opening van de punt te verbreden. Polijst de punt met een standaard laboratoriumbrander om de punt glad te maken. Voordat u met de preparatie begint, anestheseer het dier met een IP-injectie van ketamine en fixeer de kop van de muis in het stereotactisch frame.
Test vervolgens de diepte van de anesthesie door in de achterste PO van de muis te knijpen. Begin de preparatie pas wanneer er geen terugtrekreflex van de PO zichtbaar is; de diepte van de anesthesie moet tijdens de procedure herhaaldelijk worden gecontroleerd. Dien herhaalde injecties van ketamine toe in de achterste quadricepsspier.
Verleng de anesthesie en bewaak de lichaamstemperatuur van het dier met de rectale probe. Voor de preparatie van de dorsale kolom: open de huid langs de dorsale middellijn.
Los de huid van het onderliggende weefsel om de wervel van het omringende bindweefsel te scheiden. Maak twee incisies aan beide zijden van de wervelkolom en verbreed de sneden door het weefsel met het scalpel opzij te duwen. Verwijder vervolgens de S-doornuitsteeksels met een kleine botnijper.
Begin bij de lumbale niveaus. Ga door naar de middelste thoracale niveaus om uitdroging van deze operatiewond te voorkomen. Plaats kleine stukjes gaas rond de wond en bevochtig deze met 0,9% natriumchloride.
Begin vervolgens met de preparatie van het ruggenmerg, startend bij de lumbale regio. Duw de punt van de botpen voorzichtig in de ruimte tussen twee aangrenzende wervels. Besteed bijzondere aandacht aan het zo veel mogelijk beperken van de druk die op het ruggenmerg wordt uitgeoefend.
Ga naar de thoracale niveaus en bevochtig het ruggenmerg met kunstmatig cerebrospinaal vocht. Herhaal dit bij alle volgende stappen. Open de durometer voorzichtig met een naald van 30 gauge.
Maak vervolgens twee aangrenzende ipsilaterale wortels los en scheid deze van de wervelkolom. Snijd de wortels vervolgens zo distaal mogelijk door. Tijdens de procedure.
Voorkom overmatig trekken aan de wortels, omdat dit uiteindelijk een succesvolle registratie van DRP in de weg zal staan. Nadat de referentie-elektrode dicht bij het ruggenmerg is geplaatst, wordt de punt van één sectie-elektrode in directe nabijheid van het proximale uiteinde van één dorsale wortel bewogen. Positioneer vervolgens de dorsale wortel over de tipopening van de zuigelektrode.
Zuig vervolgens de dorsale wortel in de elektrode door een korte negatieve druk uit te oefenen via een spuit die met de elektrode is verbonden. Vul de elektrode daarna met A CSF terwijl een lage continue negatieve druk wordt toegepast, totdat de oplossing zowel de dorsale wortel als de zilverdraad-chloride draad binnen de elektrode omringt. Til vervolgens de punt van de elektrode op van het ruggenmerg, zodat er geen vloeistofbrug ontstaat die de elektrode kortsluit.
Herhaal de stappen voor de tweede ipsilaterale aangrenzende wortel. Zodra beide elektroden zijn geplaatst, start de registratie van de DRP door één route te stimuleren terwijl er van de andere wordt geregistreerd; verhoog de stimulusspanning tot supramaximale niveaus. Typische registraties van dorsale wortelpotentialen zien eruit zoals degene die in het linkerpaneel wordt getoond.
Een kort stimuleringsartefact wordt gevolgd door een korte positieve afbuiging en een langdurige negatieve afbuiging. De laatste afbuiging is het eigenlijke dorsale wortelpotentiaal. De amplitude hiervan kan worden berekend ten opzichte van de basislijn die direct voorafgaand aan de stimulusregistratie is vastgelegd.
Verschillende sporen van één paar wortels als artefacten door ademhalingsbewegingen en/of EKG-artefacten kunnen het geregistreerde DRP verstoren. Na een succesvolle registratie is het mogelijk om de stimulatie- en registratieplaats te wisselen en een tweede registratie uit te voeren. De gepresenteerde registratiemethode.
Het meten van wortelpotentialen in vivo maakt de beoordeling van primaire afferente antipolarisatie bij het intacte dier mogelijk, vooral in combinatie met genetisch gemodificeerde muizen. Dit kan een krachtig instrument zijn om de mechanismen die ten grondslag liggen aan spinale inhibitie te onderzoeken. Spinale integratie is cruciaal voor de motorische functie en multimodale sensorische perceptie.
Deze methode is nuttig bij onderzoek naar pijn, ruggemergletsel, perifeer zenuwletsel en ontsteking. De in vivo registratie van DRP stelt onderzoekers in staat om interacties tussen supraspinale activiteit en pad te analyseren. Dit is niet mogelijk in geïsoleerde ruggemergpreparaten die gewoonlijk worden gebruikt om DRP bij muizen te meten.
In principe is het mogelijk om tijdens de registratie medicatie toe te dienen aan het ruggenmerg. Lokale toediening via aanvullende pipetten kan de controle over de lokale drugconcentratie verbeteren en versnellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt GABAerge presynaptische inhibitie in het ruggenmerg, een cruciaal mechanisme voor de integratie van motorische en sensorische signalen. De gedemonstreerde methode omvat in vivo registratie van dorsale wortelpotentialen (DRP) bij muizen, wat inzicht biedt in presynaptische inhibitie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Ruggenmergonderzoek
Achtergrond
- Presynaptische inhibitie is een belangrijk inhiberend mechanisme in het ruggenmerg.
- Pathologische veranderingen in deze inhibitie zijn gekoppeld aan diverse ziekten.
- Inzicht in presynaptische inhibitie is essentieel voor het bestuderen van ruggenmergletsels en aandoeningen van het centraal zenuwstelsel.
- Diermodellen helpen bij het beoordelen van de sterkte van de presynaptische inhibitie.
Doel van de studie
- Een methode presenteren voor het beoordelen van presynaptische inhibitie bij muizen.
- Inzichten verschaffen in de rol van presynaptische inhibitie bij pijnmechanismen.
- Het begrip van de netwerkintegratie in het ruggenmerg verbeteren.
Gebruikte methoden
- In vivo registratie van dorsale wortelpotentialen (DRP).
- Gebruik van muismodellen voor het bestuderen van presynaptische inhibitie.
- Elektrofysiologische technieken om de inhibitiesterkte te meten.
- Analyse van de integratie van motorische en sensorische signalen.
Belangrijkste resultaten
- Een betrouwbare methode gedemonstreerd voor het in vivo meten van DRP.
- Bewijs geleverd voor de rol van presynaptische inhibitie bij de functie van het ruggenmerg.
- De belangrijkheid van dit mechanisme bij diverse pijntoestanden benadrukt.
- Bijgedragen aan het begrip van de integratie van sensorische en motorische signalen.
Conclusies
- Presynaptische inhibitie is cruciaal voor de functie van het netwerk in het ruggenmerg.
- De gepresenteerde methode kan bijdragen aan toekomstig onderzoek naar pijn en spinale aandoeningen.
- Inzicht in dit mechanisme kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Directe in vivo meting van spinale presynaptische inhibitie via registratie van het dorsal root potentiaal (DRP) in muizen maakt nauwkeurige analyse van GABAerge modulatie in intacte neurale circuits mogelijk. Deze mogelijkheid is essentieel voor het mitigeren van risico's bij mechanistische hypothesen in modellen voor pijn en motorische hyperexcitabiliteit, wat de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinisch onderzoek ondersteunt. De compatibiliteit van deze methode met transgene muismodellen vergroot de waarde ervan voor de validatie van ziekterelateerde targets en mechanistische studies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe kwantificering van GABAerge presynaptische inhibitie in ziekte-relevante neurale pathways mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoanalyse voor targets bij pijn- en motorische aandoeningen door functionele inhibitie in vivo te meten.
- Faciliteert hypothese-gestuurde validatie van spinale inhibitiemechanismen in genetisch gemodificeerde modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerde elektrofysiologische readout voor de ontwikkeling van functionele assays in neurale circuits.
- Maakt reproduceerbare meting van de DRP-amplitude mogelijk als kwantitatieve output voor screening van verbindingen of genetisch materiaal.
- Ondersteunt de standaardisatie van in vivo neurale assays voor vergelijkbaarheid tussen studies.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Komt overeen met ziekterelateerde modellen voor neuropathische pijn, ontsteking en motorische hyperexcitabiliteit.
- Maakt beoordeling van supraspinale en perifere interacties in intacte organismen mogelijk, wat de translationele voorspellende waarde verhoogt.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van targets en interventies op basis van in vivo functionele gegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinische validatie, waarbij mechanistische studies worden verbonden met translationeel onderzoek naar pijn- en motorische aandoeningen.
- Discovery Biology: Biedt directe functionele read-outs voor hypothesetoetsing van inhiberende spinale mechanismen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare DRP-metingen die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van DRP-amplitudes over verschillende experimentele condities en genotypen mogelijk.
- Translationaal Onderzoek: Behoudt de fysiologische relevantie door supraspinale en perifere connectiviteit in vivo te preserveren.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan diverse transgene modellen en ziektecontexten voor brede R&D-toepasbaarheid.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie en mechanistische studies van spinale inhibitie.
- Operationele waarde: Standardiseert in vivo elektrofysiologische assays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen door functioneel bewijs te leveren in ziekterelevante systemen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en interventies mogelijk op basis van in vivo mechanistische gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in in vivo elektrofysiologie en ruggenmergoperaties bij muizen.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder zuigelektroden en versterkers voor de registratie van DRP.
- Vereist strikte standaardisatie van anesthesie-, chirurgische en registratieprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse transgene modellen en ziektemodellen met passende procedurele aanpassingen.
- Potentiële beperkingen omvatten de technische complexiteit en gevoeligheid voor fysiologische artefacten.
