Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe
September 3rd, 2014
We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de vervormingsmogelijkheid van verschillende celtypen te onderzoeken met behulp van een eenvoudige op microfluïdica gebaseerde test. Dit wordt bereikt door een poly dimethyl suboxaan of PDMS microfluïdisch apparaat te fabriceren om de tijdschaal van celtransit door een reeks micrometerschalige vernauwingen te onderzoeken. Vervolgens wordt drukgestuurde stroming gebruikt om cellen door hun microfluïdische kanalen te drijven, wat het mogelijk maakt om de vervorming en tijdsafhankelijke ontspanning van individuele cellen te meten. Vervolgens wordt het geautomatiseerde beeldanalyseprogramma uitgevoerd om de video's te verwerken en een histogram van de transittijdgegevens te verkrijgen.
De resultaten tonen aan dat verschillende celtypen verschillen in vervormingsmogelijkheid op basis van hun transittijd door een reeks vernauwingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals atoomkrachtmicroscopie of micropipet aspiratie is dat microfluïdische apparaten met succes kunnen werken met hoge doorvoercapaciteiten. Terwijl andere microfluïdische apparaten ook kunnen worden gebruikt om de vervormbaarheid van cellen te meten.
We ontwerpen ons apparaat zo dat cellen door opeenvolgende vernauwingen passeren, een geometrie die gebruikelijk is in fysiologische contexten zoals het pulmonaire capillaire bed. Om te beginnen, ontwerp de microfluïdische apparaat door de breedte van de vernauwingsarraykanalen te selecteren op ongeveer 30 tot 50%van de gemiddelde celdiameter en de kanaalhoogte minimaal 50%van de celdiameter te zijn. Neem een filter op bij de ingangspoorten om puin te verwijderen en celclusters te disgregeren.
Voordat u met het experiment begint, maakt u de apparaatmaster met behulp van standaardtechnieken voor litografische microbewerking. Controleer de hoogte van de patroonfuncties met behulp van een profilometer. Repareer vervolgens de luchtbron voor drukgestuurde stroming met behulp van een tank met perslucht en een reeks luchtregelaars en fittingen.
Stel eerst een luchttoevoertank en handmatige regelaar in. Stel vervolgens een elektronisch geregeld drukregelaar in lijn met de handmatige regelaar in. Gebruik de eenvoudige code die in LabVIEW is geschreven om de gewenste druk in te voeren.
De elektro-pneumatische omzetter gebruikt een interne feedbacklus om de uitlaatdruk van de klep aan te passen om overeen te komen met de opgegeven druk over het microfluïdische apparaat. Stel een geperste kamer in om de stroming van de celsuspensie aan te drijven door een celsuspensiekamer samen te stellen uit een standaard flowcytometerbuis en een bewerkte dop die een drukdichte afdichting op de buis creëert. De dop van de drukkamer bevat twee openingen, een inlaat die aansluit op de tank met perslucht en een uitlaat waardoor cellen van de geperste kamer in het apparaat stromen.
Stel vervolgens een omgekeerde microscoop in die is uitgerust met een camera met een acquisitiesnelheid van minimaal 100 frames per seconde. Om beelden van de cellen die door de vernauwingsarray stromen vast te leggen, bereid dan een stockoplossing van oppervlakteactieve stof in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS voor, aangezien het toevoegen van een kleine hoeveelheid oppervlakteactieve stof aan de celmediumoplossing zal helpen om celhechting aan de PDMS-wanden te minimaliseren. Om de PDMS-blok met microfluïdische kanalen te fabriceren, voegt u één gram verhardingsmiddel toe aan 10 gram PDMS-basis en meng goed.
Giet het mengsel over het apparaat. Ontgas in een klokpot met toegepaste vacuüm totdat de opgevangen bubbels verdwijnen, of ongeveer 10 tot 20 minuten. Na deze tijd kunnen er nog steeds luchtbellen zijn op de AIR PDMS-interface, wat normaal is.
Deze zullen doorgaans verdwijnen tijdens het bakken. Bak vervolgens het ontgaste apparaat gedurende vier uur op 65 graden Celsius nadat het apparaat is afgekoeld. Verwijder de microfluïdische apparaten uit de mastervorm.
Begin met voorzichtig het losmaken van een hoek van het apparaat. Langzaam en voorzichtig pellen in plaats van het optillen van de PD DMS-blok recht omhoog vermindert de stress op zowel de PDMS als de master Snijd individuele microfluïdische apparaten uit de PDMS-blok met een scheermes en verwijder het apparaat uit de master Maak gaten in het PDMS-apparaat om verbindingspoorten te maken voor toegang tussen slangen en microkanalen. Maak gaten van de kanaalzijde tot aan de buitenzijde van het apparaat met behulp van een biopsie-punch.
Spoel het PDMS-apparaat af met isopropanol om stof en stukken PDMS te verwijderen. Zorg ervoor dat de geponste gaten vrij zijn van puin door een gelijkmatige stroom pure isopropanol vanuit een drukfles door de gaten te richten. Droog af met gefilterde lucht.
Reinig het glazen substraat door met methanol te spoelen. Droog vervolgens af met gefilterde lucht en plaats het op een 200 graden Celsius hotplate gedurende vijf tot tien minuten om ervoor te zorgen dat het glas volledig schoon en droog is voordat het plasmabehandeling wordt uitgevoerd. Zoals beschreven in het protocol in de tekst, inspecteert u het microfluïdische apparaat onder een microscoop.
Zorg ervoor dat de kanalen niet ingezakt of gebroken zijn en dat zowel de inlaat- als uitlaatgaten rechtstreeks verbonden zijn met de kanaalkanalen door een objectief met laag vermogen te gebruiken. Plaats de celsuspensie in een flowcytometerbuis en sluit deze aan op de drukdop voordat u de slang op het microfluïdische apparaat aansluit, pas de druk aan op ongeveer 14 tot 21 kilopascals en spoel totdat de celsuspensie uit de punt van de slang komt. Plaats vervolgens het apparaat op een vlakke ondergrond om de slang in de inlaat van het apparaat te steken.
Omdat de glazen dekglas die aan de onderkant van het PDMS-apparaat is gebonden, kwetsbaar is. Steek de punt van de slang met de celsuspensie in de apparaatinlaat. Steek vervolgens een stuk slang in de uitlaatpoort en routeer deze in een lege buis voor afvalinzameling, zoals een lege Falcon-buis die op de zijkant
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de vervormbaarheid van verschillende celtypen met behulp van een microfluïdica-gebaseerde assay. De assay meet de tijdschaal voor cellen om door een reeks micron-schaalvernauwingen te transiteren, wat inzicht biedt in celgedrag onder door druk aangedreven stroming.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microfluïdica
- Biomechaniek
Achtergrond
- Celvervormbaarheid is cruciaal voor verschillende fysiologische processen.
- Bestaande technieken voor het meten van celvervormbaarheid hebben beperkingen in doorvoer.
- Microfluïdische apparaten bieden een hoogdoorvoeralternatief voor dergelijke assays.
- Deze studie maakt gebruik van PDMS microfluïdische apparaten om de meetnauwkeurigheid te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om de vervormbaarheid van verschillende celtypen te beoordelen.
- Om de transittijden van cellen door vernauwingen te meten.
- Om de prestaties van microfluïdische assays te vergelijken met traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Fabricage van PDMS microfluïdische apparaten.
- Door druk aangedreven stroming om cellen door kanalen te drijven.
- Geautomatiseerde beeldanalyse voor het verwerken van videogegevens.
- Histogramanalyse van transittijdgegevens.
Belangrijkste resultaten
- Verschillende celtypen vertonen verschillende niveaus van vervormbaarheid.
- Transittijden correleren met celtype en vervormbaarheid.
- De microfluïdische assay toont hoge doorvoercapaciteiten.
- Deze methode presteert beter dan traditionele technieken zoals atoomkrachtmicroscopie.
Conclusies
- De microfluïdica-gebaseerde assay is effectief voor het meten van celvervormbaarheid.
- Resultaten wijzen op significante verschillen in celgedrag op basis van type.
- Deze aanpak kan ons begrip van celmechanica in verschillende contexten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic technique enables high-throughput assessment of cell deformability, a key biophysical property linked to cell function and disease state. By quantifying transit times through micron-scale constrictions, it provides mechanistic insights into cytoskeletal dynamics and membrane mechanics. The method supports early discovery workflows by offering a scalable, quantitative readout for phenotypic screening and target validation in hematologic and immuno-oncology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking cytoskeletal or molecular targets to functional deformability phenotypes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through rapid, label-free screening of compound effects on cell mechanics.
- Predictive Value: Generates quantitative, reproducible data that inform target confidence and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-content datasets on single-cell mechanical responses under controlled flow conditions.
- Operational Value: Enables assay readiness with automated image analysis, reducing manual processing time and increasing throughput to ~100 cells per hour.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cell lines and experimental conditions due to modular PDMS device design and pressure-driven flow control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular perturbations to functional biomechanical outputs, supporting translational biomarker discovery in leukemia and neutrophil differentiation models.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing a consistent, quantitative readout of cell state changes.
- Risk Mitigation: Aids in identifying mechanistically distinct cell subpopulations that may influence drug response or resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, particularly in mechanobiology-focused programs. It complements genomic and proteomic approaches by adding a functional, biomechanical layer to cell characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological perturbations alter cell transit dynamics through constrictions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative transit time data that enable comparison across conditions and compound libraries.
- Analytics: Generates histogram-based readouts of transit times that allow statistical comparison of cell populations and detection of subphenotypes.
- Translational Research: Aligns with biomarker development efforts by correlating deformability shifts with differentiation states, as seen in HL-60 to neutrophil-like transitions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, adaptable platform applicable to diverse cell types and research contexts without major reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between molecular targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated analysis and controlled microfluidic environments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, functional readouts that reduce reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their impact on biomechanical hallmarks of disease-relevant cell states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and pressure-driven flow systems.
- Depends on access to high-speed imaging systems (≥100 fps) and automated image analysis pipelines.
- Necessitates standardization of cell preparation, surfactant use, and pressure calibration across users and labs.
- Involves optimization of constriction dimensions relative to target cell size for accurate deformation profiling.
- Limited by the need for single-cell suspensions and compatibility with adherent or fragile cell types without prior adaptation.
