Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

Het algemene doel van het volgende experiment is om de vervormingsmogelijkheid van verschillende celtypen te onderzoeken met behulp van een eenvoudige op microfluïdica gebaseerde test. Dit wordt bereikt door een poly dimethyl suboxaan of PDMS microfluïdisch apparaat te fabriceren om de tijdschaal van celtransit door een reeks micrometerschalige vernauwingen te onderzoeken. Vervolgens wordt drukgestuurde stroming gebruikt om cellen door hun microfluïdische kanalen te drijven, wat het mogelijk maakt om de vervorming en tijdsafhankelijke ontspanning van individuele cellen te meten. Vervolgens wordt het geautomatiseerde beeldanalyseprogramma uitgevoerd om de video's te verwerken en een histogram van de transittijdgegevens te verkrijgen.

De resultaten tonen aan dat verschillende celtypen verschillen in vervormingsmogelijkheid op basis van hun transittijd door een reeks vernauwingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals atoomkrachtmicroscopie of micropipet aspiratie is dat microfluïdische apparaten met succes kunnen werken met hoge doorvoercapaciteiten. Terwijl andere microfluïdische apparaten ook kunnen worden gebruikt om de vervormbaarheid van cellen te meten.

We ontwerpen ons apparaat zo dat cellen door opeenvolgende vernauwingen passeren, een geometrie die gebruikelijk is in fysiologische contexten zoals het pulmonaire capillaire bed. Om te beginnen, ontwerp de microfluïdische apparaat door de breedte van de vernauwingsarraykanalen te selecteren op ongeveer 30 tot 50%van de gemiddelde celdiameter en de kanaalhoogte minimaal 50%van de celdiameter te zijn. Neem een filter op bij de ingangspoorten om puin te verwijderen en celclusters te disgregeren.

Voordat u met het experiment begint, maakt u de apparaatmaster met behulp van standaardtechnieken voor litografische microbewerking. Controleer de hoogte van de patroonfuncties met behulp van een profilometer. Repareer vervolgens de luchtbron voor drukgestuurde stroming met behulp van een tank met perslucht en een reeks luchtregelaars en fittingen.

Stel eerst een luchttoevoertank en handmatige regelaar in. Stel vervolgens een elektronisch geregeld drukregelaar in lijn met de handmatige regelaar in. Gebruik de eenvoudige code die in LabVIEW is geschreven om de gewenste druk in te voeren.

De elektro-pneumatische omzetter gebruikt een interne feedbacklus om de uitlaatdruk van de klep aan te passen om overeen te komen met de opgegeven druk over het microfluïdische apparaat. Stel een geperste kamer in om de stroming van de celsuspensie aan te drijven door een celsuspensiekamer samen te stellen uit een standaard flowcytometerbuis en een bewerkte dop die een drukdichte afdichting op de buis creëert. De dop van de drukkamer bevat twee openingen, een inlaat die aansluit op de tank met perslucht en een uitlaat waardoor cellen van de geperste kamer in het apparaat stromen.

Stel vervolgens een omgekeerde microscoop in die is uitgerust met een camera met een acquisitiesnelheid van minimaal 100 frames per seconde. Om beelden van de cellen die door de vernauwingsarray stromen vast te leggen, bereid dan een stockoplossing van oppervlakteactieve stof in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS voor, aangezien het toevoegen van een kleine hoeveelheid oppervlakteactieve stof aan de celmediumoplossing zal helpen om celhechting aan de PDMS-wanden te minimaliseren. Om de PDMS-blok met microfluïdische kanalen te fabriceren, voegt u één gram verhardingsmiddel toe aan 10 gram PDMS-basis en meng goed.

Giet het mengsel over het apparaat. Ontgas in een klokpot met toegepaste vacuüm totdat de opgevangen bubbels verdwijnen, of ongeveer 10 tot 20 minuten. Na deze tijd kunnen er nog steeds luchtbellen zijn op de AIR PDMS-interface, wat normaal is.

Deze zullen doorgaans verdwijnen tijdens het bakken. Bak vervolgens het ontgaste apparaat gedurende vier uur op 65 graden Celsius nadat het apparaat is afgekoeld. Verwijder de microfluïdische apparaten uit de mastervorm.

Begin met voorzichtig het losmaken van een hoek van het apparaat. Langzaam en voorzichtig pellen in plaats van het optillen van de PD DMS-blok recht omhoog vermindert de stress op zowel de PDMS als de master Snijd individuele microfluïdische apparaten uit de PDMS-blok met een scheermes en verwijder het apparaat uit de master Maak gaten in het PDMS-apparaat om verbindingspoorten te maken voor toegang tussen slangen en microkanalen. Maak gaten van de kanaalzijde tot aan de buitenzijde van het apparaat met behulp van een biopsie-punch.

Spoel het PDMS-apparaat af met isopropanol om stof en stukken PDMS te verwijderen. Zorg ervoor dat de geponste gaten vrij zijn van puin door een gelijkmatige stroom pure isopropanol vanuit een drukfles door de gaten te richten. Droog af met gefilterde lucht.

Reinig het glazen substraat door met methanol te spoelen. Droog vervolgens af met gefilterde lucht en plaats het op een 200 graden Celsius hotplate gedurende vijf tot tien minuten om ervoor te zorgen dat het glas volledig schoon en droog is voordat het plasmabehandeling wordt uitgevoerd. Zoals beschreven in het protocol in de tekst, inspecteert u het microfluïdische apparaat onder een microscoop.

Zorg ervoor dat de kanalen niet ingezakt of gebroken zijn en dat zowel de inlaat- als uitlaatgaten rechtstreeks verbonden zijn met de kanaalkanalen door een objectief met laag vermogen te gebruiken. Plaats de celsuspensie in een flowcytometerbuis en sluit deze aan op de drukdop voordat u de slang op het microfluïdische apparaat aansluit, pas de druk aan op ongeveer 14 tot 21 kilopascals en spoel totdat de celsuspensie uit de punt van de slang komt. Plaats vervolgens het apparaat op een vlakke ondergrond om de slang in de inlaat van het apparaat te steken.

Omdat de glazen dekglas die aan de onderkant van het PDMS-apparaat is gebonden, kwetsbaar is. Steek de punt van de slang met de celsuspensie in de apparaatinlaat. Steek vervolgens een stuk slang in de uitlaatpoort en routeer deze in een lege buis voor afvalinzameling, zoals een lege Falcon-buis die op de zijkant