Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging
16 april 2014
Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.
Het algemene doel van deze procedure is om endosomen nauwkeurig in driedimensionale ruimte te beeldvormen over tijd of in vier dimensies. Dit wordt bereikt door eerst slangenspieren te dissekeren en het weefsel in de beeldvormingsschaal te rangschikken. De tweede stap is om het weefsel te kleuren met vitale kleurstoffen om endosomevorming te stimuleren.
Vervolgens wordt de voorbereiding in vier dimensies beeldvormd voor een of meer neuromusculaire knooppunten. De laatste stap is zorgvuldige gegevensanalyse om het gedrag van macro-endosomen te karakteriseren. Uiteindelijk kan de aanwezigheid en beweging van endosomen in de tijd binnen de presynaptische ruimte worden aangetoond door middel van vierdimensionale fluorescentiebeeldvorming.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de slangenbuikspier slechts een enkele laag vezels dik is, wat zorgt voor hoogwaardige beelden met behulp van standaard epi-fluorescentiemicroscopie. Weefselpreparaten van de ringslang worden in dit protocol gebruikt. Reptielenweefsel moet bij lage temperaturen worden bewaard, zodat het langer fysiologisch blijft en met minder bacteriële besmetting. Voor lysosomale vitale kleurstoffers wordt de kleurstof verdund tot 1 op 5000 in koude reptielen Ringer-oplossing.
Voor een eindconcentratie van 0,2 micromolair, voegt u de kleurstof toe aan het weefsel en incubeert u het gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Na 15 minuten, wast u het weefsel meerdere keren met koude ringer voor alle FM 1 43-kleuring. Monteer de monster vooraf in een beeldvormingsschaal met magnetische pinnen voorafgaand aan de kleuring.
Voor het doel van deze video wordt alleen FM 1 43-kleuring met kaliumchloride-stimulatie gedemonstreerd. De kleurstof, verdund tot 1 op 500 in hoge kaliumchloride-ringer, wordt toegevoegd aan het weefsel om een eindconcentratie van zeven micromolair te verkrijgen, en vervolgens wordt het weefsel gedurende maximaal 30 tot 60 seconden bij vier graden Celsius geïncubeerd. Vervolgens wordt het snel drie keer gewassen met koude ringer gedurende ongeveer een minuut per spoeling.
Alle weefsels moeten zo snel mogelijk worden beeldvormd na het kleuren en wassen met koude ringer-oplossing. Als een omgekeerd microscoop wordt gebruikt, gebruik dan een beeldvormingskamer waarvan de bodem een dunne ronde dekglas bevat. Doorgaans zou de beeldvormingskamer een dunne roestvrijstalen bodem moeten hebben met een diameter van 25 millimeter.
Gebruik een glazen dekglas met een dikte van nummer één in het midden om de voorbereiding voor beeldvorming te configureren. Orienteer het met behulp van magnetische pinnen zodat de spier zo goed mogelijk in het midden van de beeldvormingsschaal staat en zo vlak mogelijk ligt. Bedek de voorbereiding met een kleine hoeveelheid ringer-oplossing.
Plaats de schaal en plaats deze zo dicht mogelijk bij het centrum van de tafel. Kies een geschikt objectief om de hoogst mogelijke 3D-resolutie te verkrijgen. Voor alle experimenten in deze demonstratie wordt een 63 x waterobjectief gebruikt.
Open om deze procedure te beginnen het beeldvormingsvenster in Slide Book 5.0. Hierin zijn verschillende menu's opgenomen in tabbladen. Kies het 63 x waterobjectief met behulp van het tweede tabblad Z. Stel het Z-stapelinterval in.
In dit voorbeeld wordt een Z-stap van 1,5 micron gebruikt voor live-beeldvorming. Selecteer de time-lapse beeldsnelheid. Een optimale snelheid is die welke net voldoende is om veranderingen in de tijd soepel op te lossen, zoals bewegingsinteracties of fusiegebeurtenissen.
Bijvoorbeeld, 10 tijdstippen met intervallen van 32ste voor een totale tijdsinterval van vijf minuten. Selecteer vervolgens de totale scherptediepte terwijl de terminal live handmatig wordt gefocust naar de bovenkant van het interessegebied, en ga dan een beetje erboven. Selecteer bovenste stelsel.
Focus langzaam door het monster tot alles uit focus is. Nogmaals, het aantal vlakken en de totale reiswaarden die worden weergegeven, geven de geselecteerde scherptediepte in het opnamevenster aan. Selecteer de gebruikte bovenste en onderste posities radioknop om de zojuist geselecteerde parameters over te brengen Voor beeldacquisitie, begint u met beeldacquisitie.
Voltooi alle live-beeldvorming voor een specifieke voorbereiding. Bewaar alle ruwe gegevensbestanden, terwijl digitale opslag meestal geen probleem is. De verwerkingstijd is aanzienlijk, zelfs met snelle pc's of werkstations.
Om deze reden, knip beelden bij in een gebied van belang en zorg ervoor dat het hele gebied van belang in het bijgesneden venster blijft gedurende de hele tijd. Grof D kan beeldakkumulaties omvatten met behulp van geschikte software en de juiste puntspreidingsfunctie, bevestig dat de resolutie is verbeterd en dat er geen artefacten zijn gegenereerd door het deconvolutiealgoritme. Gebruik een interpolatiealgoritme om de Z-as uit te breiden.
De schijnbare resolutie, een uitbreiding van zes keer van een werkelijke 1,5 micron beeldafstand tot een schijnbare 0,25 micron afstand, wordt voorgesteld. Voer contrasthelderheid, ruisfiltering, fotobleken en andere typische beeldverwerkingsaanpassingen uit. Indien gewenst.
Beeldmanipulatiestandaarden dicteren dat voor de meeste wetenschappelijke werkzaamheden het passend is dat dezelfde correcties worden toegepast op alle beelden, zowel binnen een stapel als op verschillende tijdstippen. De consequentie van een specifieke aanpassing moet worden beoordeeld tussen alle beelden. Experimenteer met verschillende filter- en beeldverbeteringstechnieken.
Bijvoorbeeld, lelos en filtering is nuttig om het contrast van kleine structuren boven de achtergrond te verhogen. De helderheid van pixels in het centrum van een lopend venster wordt verbeterd, terwijl de helderheid van omliggende gebieden wordt verminderd. Merk op dat sommige filtermethoden niet goed werken in combinatie.
Pas driftcorrectie toe als er sprake is van aanzienlijke beweging van de voorbereiding in de loop van de tijd
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van vierdimensionale beeldvorming om de dynamiek van endosomen in levende zenuwuiteinden van gewervelden te onderzoeken. De beweging en interacties van deze endosomen worden in drie dimensies gekarakteriseerd, waardoor belangrijke gebeurtenissen zoals endosoomsfusie en exocytose kunnen worden waargenomen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Endosomen spelen een cruciale rol bij cellulair transport en signalering.
- Het begrijpen van de dynamiek van endosomen is essentieel voor inzicht in de synaptische functie.
- Vierdimensionale beeldvorming biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van levende cellulaire processen.
- Deze techniek maakt real-time observatie van het endosomale gedrag mogelijk.
Doel van de studie
- Om endosomen nauwkeurig in drie dimensies over een tijdsverloop in beeld te brengen.
- Om het gedrag van macro-endosomen in presynaptische regio's te karakteriseren.
- Om de beweging van endosomen binnen zenuwuiteinden aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Dissectie van slangspieren voor weefselpreparatie.
- Kleuring van weefsel met vitale kleurstoffen om endosoomvorming te bevorderen.
- Vierdimensionale beeldvorming van neuromusculaire juncties.
- Data-analyse om het gedrag van endosomen in de loop van de tijd te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vierdimensionale beeldvorming van endosomen.
- Karakterisering van de beweging en interacties van endosomen.
- Bevestiging van gebeurtenissen zoals endosoomfusie en exocytose.
- Inzichten in de dynamiek van endosomen in presynaptische ruimtes.
Conclusies
- Vierdimensionale fluorescentie-beeldvorming is effectief voor het bestuderen van endosomen.
- De techniek onthult cruciale informatie over het gedrag van endosomen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van synaptische mechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Vierdimensionale fluorescentiebeeldvorming maakt directe visualisatie van endosomale dynamiek in levende zenuwuiteinden mogelijk, wat mechanistische inzichten verschaft in presynaptische transportroutes die relevant zijn voor de afgifte van neurotransmitters. Deze benadering ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen door real-time observatie van het gedrag van endosomen mogelijk te maken, inclusief fusie- en exocytosegebeurtenissen, die cruciaal zijn voor de synaptische functie en plasticiteit. De techniek verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door moleculaire perturbaties te koppelen aan functionele uitkomsten in een fysiologisch relevante preparatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot endosomaal transport in neuronale signaleringsroutes.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de beweging van macroendosomen naar het plasmamembraan en hun verdwijning te visualiseren, wat wijst op exocytose.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt visualisatie mogelijk van vermeende fusie tussen macroendosomen en zure endosomen via colocalisatie in drie orthogonale projecties, wat bijdraagt aan mechanistische modellen van endosoomrijping.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve 4D-datasets die meting van endosoomgrootte, snelheid en ruimtelijke distributie over tijd mogelijk maken zonder verlies van de integriteit van het brandvlak.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van geautomatiseerde acquisitie van z-stacks met gedefinieerde intervallen (400–1.500 nm) en time-lapse framerates om de doorvoer te maximaliseren en fototoxiciteit te minimaliseren.
- Operationele waarde: Past gestandaardiseerde beeldverwerking toe, waaronder deconvolution, driftcorrectie en contrastverbetering, om reproduceerbaarheid over tijdspunten en experimentele condities te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van presynaptische endosoomdynamiek in motorische zenuwuiteinden, die cholinerge neurotransmissie modelleren.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door correlatie van endosoomgedrag met presynaptische markers mogelijk te maken via downstream immunohistochemie.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door echte fusie te onderscheiden van ruimtelijke associatie via 3D-colocalisatieanalyse, waardoor fout-positieve interpretaties in live-cell imaging worden verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking, ondersteunt het testen van hypothesen bij targetvalidatie en maakt assay-gereedheid mogelijk voor compound screening in neurowetenschappelijke programma's die gericht zijn op de synaptische functie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door het visualiseren van endosoomdynamiek in reactie op stimulatie (bijv. hoge kaliumchloride) en labeling met vitale kleurstoffen (FM 1-43 voor macro-endosomen, lysosomale kleurstof voor zure endosomen).
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via geautomatiseerde z-stack acquisitie en gedefinieerde beeldparameters (63x waterobjectief, 1.5 µm z-stap, 10 tijdspunten over 5 minuten).
- Analytics: Genereert kwantitatieve resultaten, waaronder 3D-volumeweergaven, snelheidsmetingen en colocalisatie-analyse in orthogonale projecties om het gedrag van endosomen onder verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Legt een connectie met preklinische continuïteit door vervolg-immunohistochemie mogelijk te maken om endosomen te colocaliseren met presynaptische markers na live-imaging.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform voor het bestuderen van endosomaal transport in diverse neuronale modellen, aanpasbaar aan verschillende vitale kleurstoffen en stimulatieparadigma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in hypothesen over endosomaal transport te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door geautomatiseerde acquisitie, gedefinieerde z-intervallen en gestandaardiseerde post-processing workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen in de vroege discovery-fase door direct visueel bewijs van endosoomfusie en exocytose te leveren, waardoor de afhankelijkheid van indirecte assays wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets die betrokken zijn bij synaptische blaasjescycli en neurotransmitter-afgiftemechanismen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, kleuring met vitale kleurstoffen (bijv. FM 1-43, lysosomale kleurstoffen) en fluorescentiemicroscopie.
- Necessiteert een omgekeerde microscoop met een dunne kamerbodem van roestvrij staal, 25 mm diameter, en een dekglas nummer 1.5 voor optimale optische sectiering.
- Vereist standaardisatie van kleuringsprotocollen (bijv. verdunning van de kleurstof 1:500 in high potassium chloride ringers, incubatie 30–60 seconden bij 4°C) en wasstappen om consistente endosoomlabeling te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende modelsystemen, aangezien de preparatie van de neuromusculaire junctie van de streepnestslang is geselecteerd vanwege de dikte van een enkele vezel en de fysiologische stabiliteit bij lage temperaturen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals het onvermogen om bij lichtresolutie absoluut onderscheid te maken tussen fusie en nauwe ruimtelijke associatie vanwege de endosoomgrootte nabij de diffractielimiet, wat complementaire elektronenmicroscopie voor validatie noodzakelijk maakt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Staining the Preparation with Supravital Dyes
2:30
Configuring the Preparation for Imaging
3:31
Setting Parameters for 4D Imaging
4:52
Data Analysis
6:54
Results: 4D Live Imaging Reveals Dynamic Behavior of Macroendosomes and Acidic Endosomes in Nerve Terminals
10:23
Conclusion
