Name: Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Verken vierdimensionale fluorescentiebeeldvorming om endosoomdynamiek in levende zenuwuiteinden te bestuderen. Deze methode gebruikt slangspierweefsel en vitale kleurstoffen om endosoombeweging en fusie in presynaptische ruimtes te visualiseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health Grant NS-024572 (RSW).

1. Vlekken op de voorbereiding met Supravital Kleurstoffen <ol><li> Voor de kousenbandslang dissectie protocol zie Stewart et al.. 5 en Teng et al.. 6 Reptilian weefsel overblijft fysiologische voor langere tijd, en met minder bacteriële besmetting, bij bewaring bij lage temperaturen (zie hieronder). Zoogdierweefsel wordt gewoonlijk gehandhaafd bij kamertemperatuur of hoger. </li><li> Voor lysosomale vitale kleurstof vlekken, los de kleurstof in koude reptielen Ringers-oplossing 1:5000 (0,2 uM). Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Was enkele malen met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk. </li><li> Voor FM1-43 kleuring met behulp van KCl stimulatie, verdunnen de kleurstof in high-KCl Ringers 1:500 (7 pm). Incubeer bij 4 ° C gedurende 30-60 seconden maximaal. Was snel drie keer met koud Ringers, ~ 1 min / spoelen. Beeld zo snel mogelijk. </li><li> Voor FM1-43 kleuring met behulp van hypertone (sucrose) stimulatie, verdunnen de kleurstof in 0,5 M sucrose Ringers als hierboven. Incubeer bij 4 &amp; #176, C gedurende 2-5 minuten. Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk. </li><li> Voor FM1-43 kleuring via elektrische stimulering, zie Teng et al.. 6 kort wordt de bereiding geplaatst op een schotel met fysiologische zoutoplossing en de kleurstof. De zenuw wordt gestimuleerd met een voorgeprogrammeerde trein van 200 psec rechthoekige pulsen (~ 7 V, 30 Hz, 18 psec). Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk. </li></ol> 2. Configureer de Preparation for Imaging <ol><li> Richt de bereiding zodat structuren plaats zo dicht mogelijk bij het microscoopobjectief. </li><li> Als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt, maken gebruik van een kamer waarvan de bodem is voorzien van een dunne ronde dekglas. Normaal gesproken moet de beeldvorming kamer een dunne roestvrij stalen bodem met een diameter van 25 mm # 1 dikte glazen afdekplaat slip in het midden hebben. Als een rechtopstaande microscoop wordt gebruikt, wordt een onderste dekglaasje niet vereist maar is handigom beeldvorming te kunnen met doorvallend licht (bijv. differentieel interferentie contrast, DIC) met het model te oriënteren en te lokaliseren objecten van belang. </li><li> Kies een geschikte doelstelling om de hoogst mogelijke resolutie 3D te verkrijgen. Er zijn afwegingen tussen numerieke apertuur (NA), werkafstand, vergroting, en het type lens (droog, water-en olie-immersie). Voor dunne preparaten zoals weefsel culturen, olie doelstellingen zijn het beste. Met behulp van een microscoop rechtop, drijven een dekglas op het waterbad, en gebruik immersie olie tussen de bovenkant van het deksel slip en de doelstelling. </li><li> Als deconvolutie software wordt gebruikt, kan de verkoper vooraf bepaalde puntspreidingsfuncties (PSF&#39;s) voor bepaalde doelen. Indien dergelijke informatie wordt verstrekt, of als een niet-ondersteunde doel wordt gekozen, bepalen de PSF door beeldvorming fluorescerende microdots of soortgelijke buigingsbegrensd objecten 7,8. </li></ol> 3. Bepaal de gewenste scherptediepte en Aantal ImaGES Gewenste per Time-lapse Frame <ol><li> Selecteer de totale diepte van het veld, zodat het verplaatsen of interactie structuren van belang niet verdwijnen of uit te gaan van de focus als ze in de z-richting te verplaatsen. De z-veld moet iets groter zijn dan de verticale afmeting van de cel of proces wordt afgebeeld. Voor gewervelde motorklemmen, 15-20 micrometer is typisch. </li><li> Bereken de z-as stap nodig voor elke toename van de focus. Resolutie langs de z-as varieert afhankelijk van eigenschappen van het doel; het is ongeveer een vierde van het xy-vlak resolutie. Als een confocale beeldvorming of deconvolutie software wordt gebruikt, is z-as resolutie verbeterd. Verbeter de uiteindelijke resolutie van opzettelijke oversampling in de z-richting 5, maar zie ook stap 3.3 hieronder. Een typische stapgrootte is in het gebied van 400-1,500 nm voor 40-100X doelstellingen. Licht moet worden geblindeerd uit elk beeld z-stap tussen. </li><li> Selecteer het aantal beelden per z-stack, namelijk de gewenste scherptediepte verdeeldde stapgrootte. Tijd om een ​​typisch z-stack compleet is 1-10 sec. Snel bewegende objecten (100 nm / sec) kan verschijnen wazig in een 3D-beeld stapel omdat elk beeldvlak komt overeen met een iets ander tijdstip. Ook, elke extra afbeelding bijdraagt ​​aan photobleaching en mogelijke fototoxiciteit (zie Discussie). Als beide situaties betrekking heeft, kies dan een grotere z-stap naar minder beelden per stack te verzamelen. Compenseer later met behulp van beeld interpolatie software (stap 6.3 hieronder). </li></ol> 4. Selecteer de Time-lapse Frame Rate Kies proefondervindelijk een tarief dat is net voldoende om vlot met de tijd verandert, zoals beweging, interacties of fusie gebeurtenissen 9 lossen. Onder bemonstering kan bewegende voorwerpen (steekproeffouten) produceren, terwijl oversampling onnodig verhoogt blootstelling aan licht. Verzamel ofwel een enkele lange sequentie of meerdere herhaalde sequenties van hetzelfde preparaat, elk met een betrekkelijk kleine totale tijdsinterval ( <em&gt; bijv. 10 keer punten x 30 sec interval = 5 min). Indien mogelijk, bekijk de voorbereiding met doorlopende epifluorescentie verlichting tot ruwweg schatting beweging snelheden, waaronder drift van de gehele voorbereiding indien aanwezig. 5. Voltooi alle Live-Imaging voor een preparaat Reptilian voorbereidingen doorgaans robuuste blijven ~ 1-2 uur, langer indien gekoeld. 6. Analyseren Volgens gewenste toepassing <ol><li> Bewaar alle ruwe data bestanden. Hoewel digitale opslag is meestal geen probleem, verwerkingstijd significant zelfs bij snelle computers of werkstations. Om deze reden, bijsnijden in een regio van belang [ROI]. Verzekeren dat de hele regio van belang is in de bijgesneden venster tijdens het hele verloop. </li><li> Deconvolutie beeld stapels met behulp van de juiste software en de juiste puntspreidingsfunctie. Bevestigen die resolutie wordt verbeterd en dat er geen artefact is gegenereerd door dedeconvolutie algoritme. Figuur 3 toont bijvoorbeeld afbeeldingen. </li><li> Gebruik een interpolatie algoritme om z-as schijnbare resolutie uit te breiden. Een 6X uitbreiding van een werkelijke beeld 1,5 urn vliegtuig scheiding een schijnbare 0,25 micrometer scheiding wordt gesuggereerd. U kunt ook een combinatie van oversampling (stap 3.2) en interpolatie. </li><li> Voer contrast, helderheid, geluid filteren, photobleaching en andere typische beeldverwerking aanpassingen indien gewenst. Beeldmanipulatie normen dicteren dat voor de meeste wetenschappelijk werk, is het aangewezen dat dezelfde correcties worden toegepast op alle beelden, zowel binnen een stapel en op verschillende tijdstippen. Het gevolg van een bijzondere aanpassing worden beoordeeld onder alle beelden 9. </li><li> Selecteer een bepaalde weergavemodus voor de export van gegevens. De meest eenvoudige display stereo video aan met rood-groen of rood-blauw anaglyphen (voorbeelden in figuur 3), stereo paren, of afwisselend links / right oog frames met shutter-bril. Anaglyphen zijn beperkt tot een kleur. Verbeter schijnbare beelddiepte desgewenst tot z-as visuele resolutie te verbeteren. </li><li> Experimenteren met diverse filter-en beeldverbetering technieken. Bijvoorbeeld, Laplace filtering nuttig om contrast van kleine structuren boven de achtergrond toenemen. De helderheid van pixels in het midden van een actief venster wordt verbeterd terwijl de helderheid van de omgeving wordt verminderd. Merk op dat sommige filtering methoden niet goed werken in combinatie. </li><li> Solliciteer drift correctie als er aanzienlijke beweging van de voorbereiding in de tijd. Een dergelijke beweging is gebruikelijk in levende spier, zelfs met drugs toegevoegd aan actiepotentialen en synaptische potentialen onderdrukken. Een pixel registratie algoritme (bijv.. Imaris, Adobe After Effects, TurboReg plugin voor ImageJ) lijnt time-lapse beelden en kan verminderen, maar meestal niet volledig uit te sluiten, zoals beweging. </li></ol>

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li>
<li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li>
<li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late%22+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li>
<li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li>
<li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+images+are+data%3A+and+should+be+treated+as+such%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).</li>
<li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li>
<li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+active+zones%3A+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li>
<li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+TTT+%22Microscopy%3A+Science%2C+Technology%2C+Applications+and+Education%22">Microscopy: Science, Technology, Applications and Education</a>. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).</li>
<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De meest kritische aspect van 4D beeldvorming is beheer van de duur en intensiteit van blootstelling aan licht. Fotobleken vermindert het signaal-ruisverhouding en kan problematisch of niet, afhankelijk van verschillende factoren, waaronder keuze van fluoroforen zijn. Niet-specifieke schade aan levend weefsel (fototoxiciteit) is gerelateerd aan fotobleken, en kan soms worden geïdentificeerd met fluorescerende probes daartoe ingerichte 2,12 of door onderzoek van de morfologie helderveld met geschikte optica, z...

Time-lapse beeldvorming van levend weefsel biedt visuele toegang tot dynamische structuur-functie relaties die niet kunnen worden gewaardeerd in vaste of leven voorbereidingen afgebeeld op een enkel punt in de tijd. Vaak echter het nadeel van toegang tot temporele informatie een afname van optische resolutie. Hoge numerieke apertuur olie-immersie doelstellingen zijn onpraktisch in levend weefsel vanwege hun smalle bandbreedte van focus, waardoor het water onderdompeling of droog doelstellingen als de enige alternatieven. Bovendien kan de verhoogde resolutie geboden door confocale optica niet worden gebruikt in bepaalde levende preparaten vanwege fototoxiciteit van de relatief hoge niveaus van verlichting vereist 1,2. Tot slot, terwijl een aantal real-time of time-lapse-optische technieken beschikbaar die bieden verbeterde resolutie, wordt hun toepasbaarheid beperkt tot preparaten structuren van belang kan worden gepositioneerd binnen een paar honderd nanometer van de doelstelling 1. De werkwijze beschrevenmaakt gebruik van relatief goedkope apparatuur, is veelzijdig, maar biedt een betere resolutie vergelijking met de meer algemeen gebruikte time-lapse technieken. Het is bedoeld voor gebruik in elk laboratorium en beeldvormingsapparatuur. De werkwijze gebruikt conventionele epifluorescentie microscopie, gecombineerd met een gevoelige digitale camera en hardware waarmee snel reeksen afbeeldingen ophalen op iets verschillende beeldvlakken (z-stacks). Elke z-stack wordt digitaal deconvolved de resolutie te verhogen. Een kenmerk van 3D time-lapse (4D) beeldvorming is nauwkeurig volgen van bewegende organellen of andere structuren. Wanneer goed ingesteld, hoeft afgebeeld structuren niet uit te gaan van de focus en beweging in drie richtingen kan worden waargenomen en gekwantificeerd. Dus het is onmogelijk voor een gebrandschilderd structuur te verdwijnen over een of meer time-lapse frames alleen door drijven boven of onder een smalle focal plane. De methode dient ook als een gevoelig instrument voor de beoordeling van de interacties en mogelijke funing van kleine structuren. Conventionele epifluorescentie of confocale beelden van de structuren in de buurt van de diffractie limiet (een paar honderd nm) niet bevestigen fusie ook al samengevoegd beelden tonen overlap van hun respectievelijke labels 3. Fusie wordt voorgesteld, maar blijft het mogelijk dat de objecten horizontaal of verticaal zijn gescheiden door een afstand die onder de diffractie limiet. Drie of vier-dimensionale beeldvorming, daarentegen, maakt het bekijken van de objecten in elke van de drie orthogonale richtingen. Het uiterlijk van de fusie in alle drie weergaven verhoogt het niveau van zekerheid. En, in sommige levende preparaten, gericht of Brownse beweging van vermoedelijk gesmolten voorwerpen bewijst eens te meer wanneer beide labels gaan samen in de tijd. Natuurlijk, toen in de buurt van de diffractie limiet van het niveau van zekerheid in het onderscheiden structuren van de achtergrond, of waaruit blijkt dat zij twee kleurstoffen (fusie) bevatten, is niet absoluut. Eventueel gespecialiseerde technieken zoals fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET)4, zijn meer geschikt.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>Finale conc: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>Finale conc: 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>Finale conc: 0,2 mM</td></tr><tr><td>Reptilian Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>High KCl Reptilian Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>High Sucrose Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td>0,5 M (17,1 g/50 ml)</td></tr><tr><td>Axioplan 200 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>175W Xenon arc lamp</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; emission filterwheel switcher</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Sensicam CCD camera</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvolutie; Drift correctie; 3D en 4D data presentatie</td><td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>Drift correctie; 3D en 4D data presentatie</td><td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Drift correctie</td><td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>Meerdere plugins beschikbaar; Stereo paar constructie</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>Stereo paar constructie</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

visualisatie van endosoom dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale fluorescentie imaging

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Vier-dimensionale (4D) lichte afdruk is gebruikt om het gedrag van kleine structuren te bestuderen binnen motorische zenuwuiteinden van de dunne transversus abdominis van de kousenband slang. Ruwe data omvat time-lapse sequenties van 3D z-stacks. Elke stapel bevat 4-20 beelden die met epifluorescentie optiek bij focale vliegtuigen gescheiden door 400-1,500 nm. Stappen in de overname van het beeld stacks, zoals aanpassing van de focus, schakelen van excitatiegolflengten, en de werking van de digitale camera, zijn geautomatiseerde zo veel mogelijk op de foto te maximaliseren en minimaliseren van weefselschade door blootstelling aan licht. Na verwerving wordt een reeks afbeeldingsstapels deconvolved ruimtelijke resolutie te verbeteren, omgezet in het gewenste 3D-formaat, en gebruikt om een ​​4D &quot;film&quot; die geschikt is voor verschillende computergestuurde analyse, afhankelijk van de gevraagde experimentele gegevens. Een toepassing is studie van het dynamisch gedrag van twee klassen van endosomes gevonden in zenuwuiteinden-macroendosomes (MES)en zure endosomen (AE) die afmetingen (200-800 nm voor beide) op of nabij de diffractie limiet. Toegang tot de 3D-informatie op elk tijdstip biedt een aantal voordelen ten opzichte van conventionele time-lapse imaging. In het bijzonder kunnen de grootte en de snelheid van beweging van structuren gekwantificeerd tijd zonder verlies van scherpstelling. Voorbeelden van gegevens van 4D beeldvorming blijkt dat ME&#39;s benaderen de plasmamembraan en verdwijnen, wat suggereert dat ze in plaats van zijn exocytosed gewoon verticaal verplaatsen uit de buurt van een enkel vlak van focus. Ook geopenbaard is putatieve fusie van MES en AEs door visualisatie van overlap tussen de twee kleurstof bevattende structuren gezien in elk drie orthogonale projecties.

De getoonde gegevens zijn van slang neuromusculaire terminals (zie lage en hoge uitzicht vergroting in figuur 3, de endocytische kleurstof (FM1-43) opname creëert een waas die elk bouton vult) en, in het bijzonder, macroendosomes (MES) en zure endosomes (AE) binnen deze terminals 5. ME&#39;s zijn gemaakt door bulk endocytose tijdens neurale activiteit 10 en hun aantal daalt exponentieel met de tijd na de activiteiten heeft gestaakt 6. Gebruik van 4D live-imaging was om t...

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Het algemene doel van deze procedure is om endosomen nauwkeurig in een driedimensionale ruimte over een bepaalde tijd, ofwel in vier dimensies, in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door eerst slangspieren te dissekeren en het weefsel in de imaging-schaal te plaatsen. De tweede stap is om het weefsel te kleuren met vitale kleurstoffen om de vorming van endosomen te stimuleren.Vervolgens wordt het preparaat in vier dimensies afgebeeld voor één of meer neuromusculaire juncties. De laatste stap is een zorgvuldige data-analyse om het gedrag van macro-endosomen te karakteriseren. Uiteindelijk kan de aanwezigheid en beweging van endosomen over tijd binnen de presynaptische ruimte worden aangetoond door middel van vierdimensionale fluorescentie-imaging.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de buikspier van de slang slechts één vezel dik is, waardoor er met standaard epifluorescentiemicroscopie beelden van hoge kwaliteit kunnen worden gegenereerd. In dit protocol worden weefselpreparaten van de koogasalaam gebruikt. Reptielweefsel moet op lage temperaturen worden bewaard, zodat het gedurende langere tijd fysiologisch blijft en er minder bacteriële contaminatie optreedt. Voor

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van...

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Boyer, N. P. et. al., Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the fluorescence photoactivation method to analyze neurofilament transport in myelinated axons of peripheral nerves. By tracking photoactivated green fluorophore-tagged neurofilaments, the technique provides insights into axonal transport in neurodegenerative diseases.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons 

Source: Zhilyakov, N. V. et. al., Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the imaging technique of recording fast calcium transients at nerve endings using confocal microscopy. By stimulating the nerve and capturing fluorescence changes from calcium-binding dyes, it visualizes dynamic calcium influx and clearance at the nerve ending, offering precise insights into...

Imaging Fast Calcium Transients in Mouse Nerve Endings Using Confocal Microscopy

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Verken vierdimensionale fluorescentiebeeldvorming om endosoomdynamiek in levende zenuwuiteinden te bestuderen. Deze methode gebruikt slangspierweefsel en vitale kleurstoffen om endosoombeweging en fusie in presynaptische ruimtes te visualiseren.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Meer video's verkennen