Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis
21 mei 2014
Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.
Het algemene doel van deze procedure is om een volledige doorsnijding van het ruggenmerg bij zebravislarven te waarborgen via een relatief hoog-doorvoer en reproduceerbare methode, terwijl de overlevingskans wordt gemaximaliseerd. Dit wordt bereikt door eerst volwassen vissen van het juiste genotype te paren en waar nodig te screenen. De tweede stap is het opkweken van de embryo's tot vijf dagen na de bevruchting.
Voer vervolgens de transectie uit met een micro-injectiepipet met een schuine opening. Ten slotte krijgen de gewonde vissen de kans om te herstellen in met antibiotica behandeld medium tot het einde van het experiment. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de respons van neurale progenitorcellen op het letsel aan te tonen.
De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die zijn ontwikkeld door de laboratoria van Becker en Fetcher, zijn onder meer een groter aantal dieren voor onderzoek, een kortere hersteltijd en het gebruik van genetische instrumenten die anders niet beschikbaar zijn in de volwassen zebravis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van regeneratie, zoals de respons van neurale progenitorcellen op letsel. Begin de voorbereidingen met het maken van operatieplaten met behulp van Petri-schalen van 60 millimeter en een Sylgard 180 4 silicone elastomer kit.
Volg de instructies van de fabrikant. Vul de schaaltjes voor maximaal de helft en laat ze polymeriseren. Bewaar de schaaltjes vervolgens afgedekt bij kamertemperatuur.
Vervaardig vervolgens micropipetten door dunwandige borosilicaat capillaire buisjes te verhitten en uit te trekken in een micropipet-puller, met gebruik van dezelfde instellingen als bij het maken van micro-injectienaalden onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een pincet om de punt van de micropipet af te breken tot een diameter van ongeveer 200 microns. Slijp vervolgens de gebroken rand af met een microslijper, in eerste instantie onder een hoek van 35 graden, gevolgd door een tweede afschuining van 25 graden zodra het slijpgeluid stopt.
Controleer onder een dissectiemicroscoop of de punt scherp en glad is. Het gebruik van een punt die te breed is, leidt vaak tot een hoger sterftecijfer door de verhoogde kans op beschadiging van de aorta dorsalis. Terwijl een punt die te smal is, eerder van de huid af glijdt in plaats van het weefsel te snijden. Bewaar de correct afgeschuinde micropipetten zeven dagen vóór de operatie in een Petrischaal op een kleine hoeveelheid klei.
Richt paringstanks in met mannelijke en vrouwelijke spr. vissen. Verzamel de bevruchte embryo's de volgende ochtend, drie uur nadat het licht is aangegaan, om een maximale opbrengst te garanderen.
Indien er een transgene reporterlijn met gemengde genotypen wordt gebruikt, plaats dan 100 embryo's per plaat en incubeer de platen bij 28.5 °C. Indien er een reporterlijn wordt gebruikt, screen dan de embryo's op fluorescentie-expressie 48 uur na fertilisatie.
Laat de fluorescerende embryo's rijpen bij 28,5 °C tot de larven vijf dagen na bevruchting oud zijn. Bereid de operatieplaat voor door het celbeschermingsmateriaal te bedekken met E2, 10 mg/L gentamicinesulfaat en trica. Bereid daarnaast een herstelbakje voor door 25 mL E2 en gentamicinesulfaat toe te voegen aan een Petri-schaal van 100 mm.
De volgende stap is het voorbereiden van een scalpelhouder door drie wattenstaafjes met tape aan elkaar te bevestigen. Dit vormt een driehoekig instrument met drie groeven. Monteer vervolgens de voorbereide micropipet op de wattenstaafjes door deze met tape in een van de groeven te bevestigen om het scalpel te voltooien; leg de micropipet opzij tot deze nodig is.
Begin de operatie door telkens één plaat met 25 larven te anesthetiseren. Met trica zijn de vissen voldoende geanestheseerd wanneer ze geen aanrakingsreactie meer vertonen. Breng de larven over naar een operatieplaat en plaats de plaat onder een dissectiemicroscoop.
Draai bij maximale vergroting één larve zodanig dat deze op zijn zij ligt met de rugzijde het dichtst bij de hand die het scalpel vasthoudt. Positioneer de pincet zodanig dat deze op de celbeschermer rust. Plaats het glazen scalpel in een hoek over de breedte van de larve, waarbij het scalpel wordt gestut tegen een van de armen van de pincet.
Maak een incisie in de dorsolaterale zijde van de larven op het niveau van de anale porie. Zorg ervoor dat u niet voorbij de ventrale rand van het ruggenmerg snijdt. Draai vervolgens met het scalpel om het ruggenmerg door te snijden.
De benodigde draaiing is meestal veel minder dan 90 graden. Herhaal de transectie van het ruggenmerg bij de resterende larven. Zodra de chirurgie aan de batch larven is voltooid, gebruik dan een posterieure pipet en een pipetpomp om de gewonde dieren over te brengen naar de herstelplaat.
Om de anesthesie te laten uitwerken, dient u ervoor te zorgen dat u bij de overdracht eerst de kop of de staart van de larve vastpakt. Vermijd het buigen van de larven nadat de anesthesie is uitgewerkt om spanning op de letselplaats te voorkomen. Breng de gewonde larven over van de herstelplaat naar de 100 millimeter platen gevuld met 25 milliliters E2 en gentamicinesulfaat, met een dichtheid van 25 larven per plaat.
Plaats ze vervolgens in een incubator op 28,5 °C terwijl de wond geneest. Controleer de platen dagelijks en verwijder alle zieke of dode dieren.
Vervang het medium niet totdat de coops van de zoetwaterprotozoa in het medium zichtbaar zijn. Verplaats de vissen niet naar een nieuwe plaat bij het vervangen van het medium. Verwijder in plaats daarvan zoveel mogelijk medium en vul dezelfde plaat aan met nieuw medium.
Herhaal de mediumverversing indien nodig om de populatie coops te verminderen. Voed de larven dagelijks met een kleine hoeveelheid poedervoer voor vislarven. Hier wordt een zebravis getoond één dag na een volledige transectie van het ruggenmerg.
Na het letsel wordt GFP in alle neuronen tot expressie gebracht, en de gele pijl geeft de plaats van het letsel aan. Hier wordt een zebravis met een volledig doorgesneden ruggenmerg getoond drie dagen na het letsel. Deze gefixeerde, met UCD gelabelde zebravis vertoont een volledig doorgesneden ruggenmerg.
De gele pijl geeft opnieuw de plaats van het letsel aan. In tegenstelling hiermee is er een aaneengesloten gebied van neuronale labeling langs de ventrale rand van het ruggenmerg. In deze gefixeerde zebravissen, drie dagen na het letsel, duidt dit op een onvolledige transectie.
Zodra de techniek onder de knie is, kunnen er met deze methode 300 larven per uur worden verwerkt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor ruggenmergtransectie bij zebravislarven, waarbij gebruik wordt gemaakt van hun transparantie en snelle herstel. Na de transectie wordt sensorisch herstel waargenomen vanaf 2 dagen na het letsel, waarbij C-buigbewegingen worden genoteerd tegen 3 dagen na het letsel.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve biologie
- Zebravismodellen
Achtergrond
- Ruggenmergletsels vormen een aanzienlijke uitdaging bij het herstel.
- Zebravisjes zijn een waardevol model voor het bestuderen van regeneratie van het ruggenmerg.
- Zebravislarven bieden voordelen vanwege hun transparantie en snelle genezing.
- Inzicht in herstelmechanismen kan therapeutische strategieën informeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een reproduceerbare methode voor dwarsdoorsnijding van het ruggenmerg bij zebravishlarven.
- Het beoordelen van het hersteltijdspad en de mechanismen na letsel.
- Het gebruik van immunofluorescentiemicroscopie om neurale reacties te evalueren.
Gebruikte methoden
- Paring van volwassen zebravisjes met het gewenste genotype.
- Screening en opkweek van embryo's tot vijf dagen na fertilisatie.
- Transectie uitgevoerd met een schuine micro-injectiepipet.
- Herstel van de gewonde vissen in met antibiotica behandeld medium.
Belangrijkste resultaten
- Functioneel herstel wordt waargenomen zes weken na het letsel.
- Sensorisch herstel begint 2 dagen na het letsel.
- C-bend beweging wordt opgemerkt tegen 3 dagen na het letsel.
- Immunofluorescentiemicroscopie onthult de respons van neurale progenitorcellen.
Conclusies
- De methode maakt een effectieve doorsnijding van het ruggenmerg mogelijk bij zebravislarven.
- Snel herstel biedt inzichten in de regeneratie van het ruggenmerg.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van neurale herstelmechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Larvale zebravissen maken een snelle, high-throughput beoordeling van ruggenmergregeneratie mogelijk en bieden een complementair model voor volwassen systemen voor mechanische risicoreductie in een vroeg stadium. De methode ondersteunt doelvalidatie door binnen enkele dagen kwantificeerbare functionele en sensorische herstelmetingen te leveren, waardoor de preklinische evaluatie van neurorestauratieve kandidaten wordt versneld. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen in target-engagement en padmodulatie voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoeken van therapeutische hypothesen met betrekking tot axonale hergroei en de initiatie van neurogenese mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare metrieken voor transectie en herstel voor een consistente beoordeling van target engagement.
- Voorspellende waarde: Vroege sensorische en motorische read-outs ondersteunen functionele targetvalidatie en het verminderen van risico's in het traject.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde letselmodellen die geschikt zijn voor compound-screening en dosis-responsanalyse.
- Kwantitatieve resultaten: Maakt meting mogelijk van het begin van sensorisch herstel (2 dpi), C-buigbeweging (3 dpi) en het hervatten van het zwemmen (5 dpi) als functionele eindpunten.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de verwerking van maximaal 300 larven per uur, wat screeningscampagnes met een gemiddelde doorvoer faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevantie: Modelleert geconserveerde regeneratiemechanismen die relevant zijn voor de pathofysiologie van letsel aan het menselijk ruggenmerg.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie via gedeelde read-outs van de neurale progenitorrespons.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt vroege go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de kinetiek van het functionele herstel, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een gewervde modelorganisme te bieden voor targetvalidatie en mechanistische screening voorafgaand aan de lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van neuroregeneratieve targets via observeerbare tijdlijnen van sensorisch en motorisch herstel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare fenotypes voor het evalueren van effecten van verbindingen op regeneratie.
- Analyses: Immunofluorescentiemicroscopie maakt objectieve kwantificering van proliferatie en migratie van neurale progenitorcellen als mechanistische biomarkers mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen bij larven met volwassen zebravismodellen en zoogdiermodellen via geconserveerde regeneratiepaden.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve validatie van targets over meerdere neuroregeneratieve programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie door directe observatie van regeneratiedynamiek.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde transectie- en herstelprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege functionele beoordeling van doelwitten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroregeneratieve kandidaten op basis van herstelkinetiek.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravissen, microchirurgie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van de preparatie van micro-injectiepipetten en de infrastructuur voor gedragsobservatie.
- Vereist gestandaardiseerde anesthesie- en herstelprotocollen tussen teams.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten de genetische achtergrond en de compatibiliteit van transgene reporters.
- Praktische beperkingen omvatten de beperkte grootte van de larven en de noodzaak van een precieze dorsolaterale transectietechniek.
