Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Het algemene doel van deze procedure is om het inslikken van presynaptische input door microglia te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de fluorescente voorwaartse tracers in de ogen te injecteren om presynaptische input van retinale ganglioncellen in de laterale genante kern te labelen. De tweede stap is het disseceren, fixeren en gelijkmaken van de hersenen.

Vervolgens worden de hersenen gesneden. De laatste stap is om de hersensecties op een deksellip te monteren voor beeldvorming en analyse. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om het inslikken van presynaptische input door microglia te beoordelen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals hoe fagocytische bodems bijdragen aan plasticiteit en remodellering van synaptische circuits. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de remodellering van synaptische circuits in een gezonde hersenen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de remodellering van synaptische circuits tijdens zenuwstelselziekten. De procedure wordt gedemonstreerd door Chris Heller, een technicus, en Emily Laman, een afstudeerstudent uit het Stevens Laboratory.

Begin deze procedure door een muis te anesthetiseren met 4%ISO fluor in een plexiglas inductiekamer. Zorg er na een tot drie minuten voor dat een geschikt anesthesiegehalte is bereikt door in de staart te knijpen. Plaats vervolgens de muis op zijn zij onder de stereomicroscoop en plaats de neuskoker, die drie tot vier procent ISO-fluor over de snuit afgeeft.

Gebruik een paar kleine veerschaar om het ooglid open te snijden en de huid naar achteren te trekken. Voor neonaten is soms een andere loodrechte snede op de ooghoek noodzakelijk. Wees voorzichtig bij het snijden van de ooghoek, want daar zit een bloedvat.

Gebruik een steriele 30,5-gauge naald om een klein gaatje te prikken aan de zijkant van het oog waar de sclera begint. Zorg ervoor dat u de lens niet beschadigt door de naald net ver genoeg in te brengen zodat de snijrand in het oog gaat. Laat het glasvocht door het gaatje stromen en gebruik een steriele, gesneden en getippelde applicator om de vloeistof te absorberen.

Zodra het glasvocht uit het gaatje is gestopt, steek je langzaam een stompe naald in die aan een Hamilton-spuit is bevestigd, die vooraf is geladen met een voorwaartse gradetracing. Breng verf in het gaatje aan en injecteer de verf langzaam in het oog. Meestal wordt cholera toxine beta-subeenheid geconjugeerd aan Alexa 5 94, 6 47 of 4 88 gebruikt voor de voorwaartse grade.

Laat trace R GC inputs Laat de naald een paar seconden in het gaatje zitten en verwijder hem dan langzaam. Gebruik een dop met katoen om overtollig vocht te absorberen en te voorkomen dat de verf weglekt. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid antibioticumzalf aan op het oog.

Als het oog chirurgisch is geopend. Plaats de oogleden voorzichtig weer op hun plaats na de injectie. Laat de muis onder een verwarmingslamp of op een verwarmingskussen totdat hij begint te herstellen van de anesthesie.

Breng de muis terug naar een schone thuiscamer en controleer of hij volledig is ontwaakt voordat u hem terugbrengt naar de kolonie. Ongeveer 24 uur na de injectie, offer de muis en ontleed de hersenen. Fixeer de hersenen in een Falcon-buis gevuld met 4%PFA overnacht bij vier graden Celsius de volgende dag.

Spoel de hersenen drie keer in PBS door eerst de hersenen en PFA in een lege weiboot te gieten. Gebruik vervolgens een spatel om de hersenen over te brengen naar een andere weiboot gevuld met PBS. Was de hersenen nog twee keer in PBS voordat u ze overbrengt naar een Falcon-buis gevuld met 30% sucroseoplossing. Laat het op vier graden Celsius in sucrose totdat het naar de bodem van de buis zinkt.

Verwijder vervolgens alle delen van de hersenen die niet nodig zijn met een scheermesje. Vries de hersenen in op een stuk aluminiumfolie boven droog ijs. Ondertussen vriest u de microtoom-schijf in en vult u elk putje van een 24-putjesplaat met een halve milliliter 0,1 molair PP om de bevroren hersenen op de vriesschijf te monteren.

Breng een kleine hoeveelheid OCT aan op de schijf. Zodra de OCT begint te bevriezen, legt u de hersenen erin. De kant van de hersenen die gesneden moet worden, moet naar boven wijzen.

Bedek vervolgens de hersenen en OCT met zeer fijn gemalen droog ijs. Laat het droog ijs ongeveer 30 seconden op de hersenen liggen. Gebruik vervolgens een grote verfkwast om het droog ijs te verwijderen.

Begin met het snijden van de plakken op een dikte van 40 micron. Gebruik vervolgens een kleine, vochtige verfkwast om de secties die het gebied van belang bevatten, van de mes te verwijderen en deze over te brengen naar de 24-putjesplaat met 0,1 molair pb. Zodra de secties zijn verzameld, visualiseert u de voorwaartse grade-labeling onder een fluorescente dissectiemicroscoop en kiest u secties die het gebied van belang bevatten om de secties op een dia te monteren.

Breng eerst een kleine pool van 0,1 molair PB aan op een geladen microscoop. Draag vervolgens de weefselsecties over naar de pool van pb. Gebruik vervolgens de verfkwast om de weefsels te oriënteren en te verspreiden.

Gebruik een Kim-doek om XSPB weg te vegen en zorg ervoor dat u niet te veel van de sectie wegveegt. Laat ze volledig aan de lucht drogen. Breng vervolgens een kleine druppel montagemiddel aan op elke sectie en monteer een dekglas erop.

Verzegeld de randen van de dia met nagellak. Bewaar de dia bij min 20 graden Celsius tot de weergave van de beeldvorming. Hier is een schematische weergave van de strategie voor voorwaartse gradetracing.

De RGC-inputs van het linker- en rechteroog worden achtervolgd met CTB 6 47 en CTB 5 94, respectievelijk. De door microglia gemedieerde inslikking van inputs wordt vervolgens beoordeeld. Hier is een representatief, beeld met lage vergroting van muis DLGN op postnatale dag vijf na het traceren van linker