Name: Modelleren Spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) bij muizen na nefrectomie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer een orthotopisch model van spontaan gemetastaseerd niercelcarcinoom bij muizen na nefrectomie. Deze methode maakt gestandaardiseerde evaluatie van experimentele therapeutica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor het laboratorium van Dr Robert S. Kerbel (Universiteit van Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) voor technische hulp en expertise in de ontwikkeling van deze procedure. Wij zouden ook graag Dr Sandra Sexton en het Roswell Park Cancer Institute Ministerie van Laboratory Animal Resources bedanken. Dit werk werd ondersteund door een award van het Roswell Park Alliance Foundation (tot JMLE).

1. Orthotope Kidney tumorimplantatie <ol><li> Celkweek <ol><li> Vóór orthotope implantatie groeien muis Renca LUC cellen als een monolaag tot 75% confluentie. </li><li> Na behandeling met trypsine en opnieuw suspenderen in 5% FBS bevattende media, centrifuge cellen bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 min, het herhalen 3 keer wassen in PBS. Resuspendeer vervolgens de cellen in serum-vrij medium tot een concentratie van 5 x 10 4 Renca LUC / 5 ul serumvrij medium. Opmerking: Afhankelijk van de variant of cellijn gebruikt kunnen cellen worden gesuspendeerd in een 01:01 verhouding van matrigel en serum vrije media om zeer agressieve muis celgroei en de verspreiding te vertragen na implantatie. </li></ol></li><li> Chirurgie en celimplantatie Opmerking: Alle dierstudies daarin beschreven, waaronder het onderhoud en de bepaling van de experimentele eindpunten, werden uitgevoerd volgens een Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) pROTOCOL goedgekeurd door Roswell Park Cancer Institute. <ol><li> Verdoven een Balb / C muis met behulp van isofluraan (2-3%). Pinch voet en controleer reflex om voldoende verdoving zorgen. Solliciteer dierenarts zalf voor de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis in de rechter laterale decubitus en scheren linkerkant tussen voor-en achterpoten ledematen. Solliciteer alcohol en jodium langs dorsale lumbale gebied om aseptisch gebied voor te bereiden incisie. </li><li> Gebruik chirurgische schaar een 1 cm incisie initiëren langsrichting tussen de rib en het heupgewricht. Draai bindweefsel onder de huid met behulp van een stompe dissectie schaar. Gebruik chirurgische schaar een 0,5 cm incisie in langsrichting in de buikwand. Gebruik gebogen pincet voorzichtig naar beneden duwen rond open wond - dit zal de nier exterioriseren en zorgen voor zachte immobilisatie van orgaan voorafgaand aan de injectie. </li><li> Laad de Hamilton spuit met 5 pi de voorbereide celmengsel. Voor sub-capsulaire implantatiewachtingen kunnen twee implantatiemethoden worden gebruikt: <ol><li> Oppervlakkige: Parallel aan de lengterichting georiënteerde nier, insert naald onder de nier capsule (maar boven de parenchym) met de afgeschuinde rand omhoog. Zodra de naald is op zijn plaats, injecteren alle cellen tot kleine witte bubble vormen. Verwijder langzaam de naald uit de capsule en dep ze direct via injectie met een steriel wattenstokje om lekkage te absorberen en voorkomen verspreiding cel. </li><li> Intern: Met afgeschuinde rand op en vanaf de kant van de nieren tegenover uiteindelijke implantatie, steek de naald door het interieur van de nieren tot naald zichtbaar is (maar niet prikken) de sub-capsulaire ruimte. Injecteer alle cellen tot witte zeepbel vormen en wattenstaafje injectieplaats om lekkage te voorkomen. </li></ol></li><li> Voorzichtig terug de nieren de lichaamsholte. Sluit de buik lichaam muur met absorbeerbare 5-0 Vicryl hechtdraad. Eenmaal voltooid, trek de huid lagen samen en zet 2-3 wound clips. Zorg ervoor clips zijn stevig en gelijkmatig verdeeld tot geen wond blootstelling te garanderen. Vóór herstel beheren 500 ui 0,9% NaCl en 100 ui buprenorfine (0,01 mg / ml) subcutaan met een 25 G naald. Routinematig monitoren clip plaatsing en stabiliteit, en verwijder na 10 dagen. </li></ol></li></ol> 2. Nephrectomy / Primaire Tumor Removal <ol><li> Volg identiek protocol voor muis verdoving, immobilisatie, insnijding en blootstelling van de nieren, zoals beschreven in sectie 1.2.1 en 1.2.2 (boven). </li><li> Gebruik een tweede tang naar de nieren isoleren door voorzichtig verwijderen van de verbindende vetweefsel van het staarteinde en de bijnier van het craniale einde van de nier. Terwijl voorzichtig grijpen de nier, gebruiken absorbeerbare 5-0 Vicryl hechtdraad om een ​​dubbele knoop rond de urineleider, nierslagader, en ader te maken. Langzaam veilige en snijd boven de knoop om de nier te verwijderen. Indien enig teken onmiddellijk bloedverlies of er een risico onvoldoende greepvan hechtdraad op urineleider, slagader en ader, gebruik dan cauterizer plaats van een schaar boven knoop te snijden. </li><li> Zodra nier wordt verwijderd, zorgvuldig controleren op eventuele bloeden van de bond slagader en gebruiken cauterizer indien nodig. Sluit de buik lichaam muur met 5-0 Vicryl. Trek de huidlaag samen en plaats 2-3 wondklemmen volgende Dezelfde voorzorgsmaatregelen zoals beschreven in 1.2.4. Dier nauwlettend volgen dagelijks na de operatie voor tekenen van nood, bloeden, of beperkte mobiliteit. Volg de institutionele richtlijnen voor dierlijke veilig. </li></ol> 3. Monitoring metastatische progressie en lokalisatie bij Endpoint <ol><li> Gemetastaseerde ziekte kwantificering: Bioluminescent bewaking <ol><li> Zie methodologie eerder in JOVE beschreven voor het toezicht op het gebruik van metastase cellen getransfecteerd met luciferase en gekwantificeerd met behulp van de Xenogen IVIS imaging systeem 11,12. </li></ol></li><li> Visual necropsy gids voor een vergelijkende evaluatie van metastatische distributietie <ol><li> Sacrifice dieren volgens de institutionele richtlijnen met behulp van eindpunten, waaronder tekenen van nood, moeizame ademhaling, gewichtsverlies, enz. Opmerking: Zorgvuldige controle van de dieren is van cruciaal belang als spontane metastatische progressie zeer variabel en snel kan zijn. </li><li> Gebruik chirurgische schaar om een ​​incisie boven de plasbuis dat gaat door tot de borstholte om onderkaak initiëren. Gebruik stompe schaar om de huid te scheiden van de spieren van de buikwand. </li><li> Initiëren incisies langs armen en benen. Schil de huid weg. Nauwkeurig onderzoeken de huid fascia en buikwand voor knobbeltjes, dan de oppervlakkige lymfeklieren: lies, brachialis, oksel en oppervlakkige cervicale. </li><li> Maak een insnijding in de buikwand en snijd langs de linker en rechter zijkanten van het membraan. Met een horizontale snede verwijder het voorste gedeelte van de buikwand om de ingewanden te ontbloten. </li><li> Onderzoek de ongestoorde uiterlijk van de ingewanden fof grove opmerkelijke tumoren. Let ook op de inhoud van de maag en darmen; als ze leeg zijn, de muis mogelijk niet in staat om te eten geweest. Als de inhoud zijn donker, kan dit bewijs van hoofdletters / kleine gastro-intestinale bloeding geven. </li><li> Visueel score elk orgaan voor aanwezigheid tumor of afwezigheid, het toewijzen van een totale score voor elke muis groep (4 dieren per groep wordt gebruikt als voorbeeld in Figuur 1D-i). Opmerkingen: 1) Uitbreiding van de lymfeklieren hoeft niet te betekenen dat het een groei van de tumor; als het zeer groot, zeer stevig, en een witachtige kleur, is het waarschijnlijk een uitgezaaide knobbeltje. 2) Overmatige melkachtige of troebele vloeistof in de buik geeft ascites. Ascites kunnen omvatten vaste ophopingen op de abdominale organen, met name tussen de lobben van de lever en de maag. 3) naar organen zoals de longen, kunnen meerdere knobbeltjes aanwezig en geteld voor vergelijkingen tussen individuele dieren (zie 13 bijvoorbeeld). </li><li> Identificeer grove tumoren of afwijkingen van de individuele buikorganen: lever, milt, nieren en pancreas door zorgvuldig verwijderen en wassen met PBS uit een spuitfles. </li><li> Na het verwijderen van de buikorganen, inspecteren de abdominale lymfeklieren, met inbegrip van de lumbale, sacrale, nier-, en mesenteriale lymfeklieren. </li><li> Beoordelen diafragma voor bewijs van metastatische verspreiding. Opmerking: Uitgebreide uitgespreid op het membraan kan veroorzaken zijn contractiliteit verliezen, waardoor moeizame of verlies van ademhaling. </li><li> Verwijder membraan en maken twee zijdelingse insnijdingen in de borstholte, het verwijderen van het voorste deel naar de longen en het hart bloot. </li><li> Verwijder de longen en het hart door voorzichtig vast te pakken en het opheffen van de slokdarm en het snijden van de luchtpijp boven het hart. Beoordelen weefsels voor knobbeltjes. Knijp hart. Gebrek aan veerkrachtige consistentie kan tumor aanwezig te geven. </li><li> Gebruik chirurgische schaar om lineair doorsnijden schedel. Verwijder voorzichtig kleine stukjes schedel tot thij hele brein wordt blootgesteld. Kijk hele hersenen voor zichtbare knobbeltjes of afwijkingen verkleuringen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het doel van dit protocol is om klinisch relevante spontane gemetastaseerde ziekte te beoordelen met behulp van een syngeen tumor muismodel implantatie / resectie technieken beschrijven. Momenteel hebben de meerderheid van de preklinische studies die nieuwe experimentele therapieën niet inbegrepen studie van gemetastaseerde ziekte en slechts enkele recapituleren de stadia van de primaire tumorgroei, chirurgische resectie, en eventuele spontane metastatische verspreiding. Tot op heden, genetisch gemanipuleerde muis model...

De belangrijkste oorzaak van mortaliteit bij patiënten met niercelcarcinoom (RCC) is systemische gemetastaseerde ziekte die meestal optreedt na chirurgische verwijdering van een primaire tumor groeit in de nier. Maar heel weinig preklinische tumor modellen evalueren experimentele therapieën in muizen onder gemetastaseerde ziekte, en nog minder trouw recapituleren de klinische stadia van gelokaliseerde groei, chirurgie, en spontane micro-metastatische initiatie en progressie 1-3. Deze kloof in tests steeds belangrijker in de evaluatie van nieuwe therapieën soms opvallende anti-tumor effecten bij dierlijke modellen niet altijd vertaald soortgelijke succesvolle behandeling van patiënten 4 worden. Dergelijke verschillen in resultaten kunnen het gevolg zijn van differentiële drug efficacies tussen gelokaliseerde buitenbaarmoederlijke of orthotopic primaire tumor modellen en laat stadium gemetastaseerde ziekte 5-7. In het geval van RCC, hebben slechts een paar studies in dienst werd eennimal protocollen die spontane terugkerende ziekte die nabootst patiënten die typisch zijn tumor-dragende nieren hadden geheel of gedeeltelijk verwijderd 2,3 omvatten. De redenen voor dit gebrek in muismodel testen variëren. Ten eerste is er de hoge kosten en dier natuurlijke schommelingen van tumorcel selectie en metastatisch potentieel. Bijvoorbeeld, menselijke nier cellijnen neiging om zelden metastaseren, en moet worden gekozen over meerdere rondes van orthotopic primaire implantatie en metastatische selectie naar varianten die consequent verspreiden en vormen verre laesies ontlenen (zie beschrijving van een dergelijke humane cellijn afleiding 8-10) . Omgekeerd, muis cellen in immunocompetente modellen hebben de neiging om agressief te gedragen, en de lage cel aantallen moeten worden geïnjecteerd met matrigel onmiddellijke systemische verspreiding 3 verminderen. Ten tweede, technische problemen bij het uitvoeren van de juiste implantatie, chirurgische resectie (nefrectomie), en het bijhouden (en bepalen) spontane metastatic groei kan een uitdaging zijn en een aantal kritische variabelen moeten houden bij het gebruik van deze techniek (zie Overleg voor details). Het doel van dit protocol is om de essentiële stappen (evenals mogelijke valkuilen) van orthotopic implantatie, resectie (nefrectomie), en monitoring van spontane gemetastaseerde ziekte RCC beschrijven en een richtlijn voor gestandaardiseerde (en meer verspreid) bieden gebruiken onder wetenschappelijke laboratoria dat de werkzaamheid van experimentele therapeutiek beoordelen.

<table><tbody><tr><td>DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS without Calcium & Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>moet op ijs worden bewaard</td></tr><tr><td>Artifical tears-lubricant opthalmic ointment</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Pocket pro pet trimmer</td><td>Braintree scientific</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol swab</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Betadine solution swab</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"&nbsp;</td><td>Southpointe surgical</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long</td><td>Kent scientific</td><td>INS15915</td><td>twee hiervan nodig</td></tr><tr><td>10 &micro;l Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 45 degree, RN needle</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cotton tipped appicator</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>High temperature cautery kit</td><td>Kent scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>Reflex clip applier for 7 mm clips</td><td>Kent scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>Reflex clips, 7 mm, non-sterile</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>Removing forceps, 12 cm long</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine 0.01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8" needle</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe w/out needle</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Gold Bio technology</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

modelleren spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mrcc) bij muizen na nefrectomie

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Een van de belangrijkste uitdagingen voor een betere testen van nieuwe experimentele therapieën in niercelcarcinoom (RCC) is de ontwikkeling van modellen die trouw recapituleren progressie vroeg-en laat-stadium gemetastaseerde ziekte. Typische tumorimplantatie modellen maken gebruik van een buitenbaarmoederlijke of orthotopic primaire tumor implantatie, maar weinigen onder systemische spontane gemetastaseerde ziekte die de klinische setting nabootst. Dit protocol beschrijft de belangrijkste te ontwikkelen RCC ziekteprogressie stadia vergelijkbaar patiënten. Ten eerste gebruikt een zeer metastatische muizen tumor cellijn in syngene orthotope model tumorcel implantatie vertonen. Methoden omvatten oppervlakkige en inwendige implantatie in de sub-capsulaire ruimte met cellen gecombineerd met matrigel om lekkage en vroege verspreiding te voorkomen. Daarna worden procedures voor excisie van tumordragende nier (nefrectomie), met kritische pre-en post-operatieve zorg muis. Ten slotte beschrijft de stappen die nodig zijn om toezicht te houden en te beoordelenmicro-en macro-metastatische progressie van de ziekte, met inbegrip van bioluminescentie beeldvorming en geeft een gedetailleerde visuele necropsy gids voor systemische ziekte distributie scoren. Het doel van dit protocol beschrijving is om het wijdverbreide gebruik van klinisch relevante gemetastaseerd niercelcarcinoom modellen om de voorspellende waarde van toekomstige therapeutische testen verbeteren vergemakkelijken.

Figuur 1A toont een schematisch overzicht van de procedures beschreven in deze samenvatting protocol. Een aantal belangrijke factoren moeten worden overwogen voor elke stap. Bijvoorbeeld, in stap 1 toont twee methoden voor sub-capsulaire tumorcel implantatie in de nier. Tumorcellen kunnen worden ingeplant in het sub-capsulaire ruimte met een klein wit-bubble bevestiging van de gelokaliseerde plaatsing van cellen met lekkage voorkomen door het voorzichtig verwijderen van de naald en het zwabberen overtol...

Modellen van spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (RCC) ziekteprogressie kan worden gebruikt voor het evalueren behandelingen klinisch relevante omgeving. Dit protocol toont verschillende procedures voor orthotopic nier tumorcelimplantatie, goede nefrectomie, en ten slotte schetst een necropsy gids voor visuele en bioluminescente scoren van metastatische last en lokalisatie.

Modelleren Spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) bij muizen na nefrectomie

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van spontaan metastaserend renaalcelcarcinoom dat klinisch relevant is. Dit wordt bereikt door eerst reka Luke-cellen voor te bereiden voor implantatie. De tweede stap is het uitvoeren van een orthotope implantatie van niertumorcellen.Vervolgens, nadat de tumor is gegroeid, wordt de primaire tumor verwijderd door middel van een nefrectomie. De laatste stap is het monitoren van de progressie van spontane metastasering na de nefrectomie en het beoordelen van de ziekteverspreiding op verschillende locaties. Uiteindelijk maakt dit protocol het mogelijk om spontane metastaserende niercelcarcinomen te monitoren en biedt het een richtlijn voor de standaardisatie van de beoordeling van de effectiviteit van experimentele therapieën.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ectopische, vaak oppervlakkige of subcutane implantatiemethoden van tumorcellen, is dat het niercelcarcinoom of RCC nabootst zoals dit zich bij patiënten presenteert, inclusief het vermogen van tumorcellen om zich naar de rest van het lichaam te verspreiden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling van niercelcarcinoom, aangezien systemische metastatische ziekte werkelijk de primaire doodsoorzaak is bij patiënten. Muismodellen simuleren doorgaans geen spontane metastatische ziekte die soms kan volgen op een nefrectomie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in spontane metastatische RCC-ziekte, kan deze ook worden toegepast op andere kankertypes waarbij verwijdering van de primaire tumor gebruikelijk is en de belangrijkste doodsoorzaak een postchirurgische recidive van metastatische ziekte is. Dit omvat onder andere modellen voor borstkanker en melanoom.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met ten eerste de moeilijkheid om de nier te lokaliseren en ervoor te zorgen dat de tumorcellen na implantatie gelokaliseerd blijven en niet lekken. En ten tweede, dat de anesthesie efficiënt wordt uitgevoerd en herstel na de operatie mogelijk maakt. Kweek vóór orthotope implantatie met luciferase gelabelde Reca-cellen of Reca-Luke-cellen van muizen als monolaag tot 75% confluentie; centrifugeer de cellen na trypsinisatie en resuspensie in medium met 5% FBS, waarbij dit drie keer wordt herhaald met een wasstap in PBS, en resuspendeer de cellen vervolgens in serumvrij medium tot een concentratie van 5 × 10⁴ Reca-Luke per 5 µL serumvrij medium.Nadat een muis is genarceerd met 2 tot 3% isofluraan, knijpt u in een poot om te controleren of de narcose voldoende is. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen, plaats de muis in rechterzijdligging en scheer de linkerzijde tussen de voor- en achterpoten. Breng vervolgens alcohol en jodium aan op het dorsale lumbale gebied. Gebruik een chirurgische schaar om een huidincisie van één centimeter in longitudinale richting te maken tussen de laatste rib en het heupgewricht.Gebruik vervolgens botte dissectiescharen om het bindweefsel onder de huid los te maken. Maak daarna met een chirurgische schaar een incisie van 0,5 centimeter in longitudinale richting in de buikwand. Gebruik nu een gebogen pincet om voorzichtig rondom de open wond naar beneden te duwen.Hiermee wordt de nier geëxternaliseerd, wat een zachte immobilisatie van het orgaan mogelijk maakt voorafgaand aan de injectie. Vul een Hamilton-spuit met vijf microliter van het bereide celmengsel voor een oppervlakkige subcapsulaire implantatie. Houd de naald parallel aan de longitudinaal georiënteerde nier met de schuine zijde naar boven en voer de naald in onder het niersubcapsulair, maar boven het parenchym.Zodra de naald geplaatst is, worden alle cellen geïnjecteerd tot er een kleine witte bel ontstaat. Verwijder de naald langzaam uit het kapsel en gebruik onmiddellijk een steriele wattenstaaf om de injectieplaats te blokkeren voor een interne subcapsulaire implantatie. Begin aan de zijde van de nier die tegenover de gewenste implantatieplaats ligt.Houd de naald vast met de schuine zijde naar boven en naar binnen gericht. Steek deze door het binnenste van de nier totdat de naald zichtbaar is, maar zonder de subcapsulaire ruimte aan de overzijde te doorboren. Injecteer de cellen totdat er een witte bel ontstaat en dep de injectieplaats om lekkage te voorkomen.Plaats de nier voorzichtig terug in de lichaamsholte. Sluit de buikwand met absorbeerbare 5.0 Vicryl-hechtgaren. Wanneer dit voltooid is, houdt u de huidlaag bij elkaar en plaatst u twee tot drie wondklemmen vóór het herstel.Dien 500 µL 0,9% natriumchloride en 100 µL buprenorfine subcutaan toe. 26 tot 30 dagen na implantatie wordt het dier geanestheseerd en wordt de nier op dezelfde wijze als voorheen blootgelegd. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig het verbindende vetweefsel van het caudale uiteinde van de nier te verwijderen en verwijder de bijnierschors van het craniale uiteinde.Gebruik een pincet om de nier voorzichtig vast te pakken en schuif vervolgens een absorbeerbare 5.0 Vicryl-hechtdraad rond de ureter, de nierarterie en de niervene. Leg daarna langzaam een dubbele knoop nadat de draden met hemostaten zijn afgeklemd. Gebruik een schaar om boven de knoop door te knippen en verwijder de nier.Nadat de nier is verwijderd, moet zorgvuldig worden gecontroleerd op bloedingen vanuit de arterie en indien nodig moet er worden gecauteriseerd. Na het hechten van de abdominale lichaamswand met 5.0 Vicryl, worden wondclips gebruikt om de huid te sluiten. Controleer het dier dagelijks op tekenen van stress, bloedingen of beperkte mobiliteit.Nadat het dier is geëuthanaseerd, wordt er met een chirurgische schaar een incisie gemaakt die begint boven de urethra en doorloopt via de borstholte tot aan de onderkaak. Gebruik een schaar met stompe punten om de huid van de spieren van de bukwand te scheiden. Snijd vervolgens de huid langs de armen en benen en pel de huid langzaam weg.Onderzoek de huidfascia en de buikwand nauwgezet op noduli. Onderzoek vervolgens de oppervlakkige lymfeklieren. Maak een incisie in de buikwand en snijd langs de linker- en rechterzijkant omhoog tot aan het diafragma.Maak één horizontale snede. Verwijder het voorste gedeelte van de buikwand om de viscera bloot te leggen. Inspecteer het ongestoorde uiterlijk van de viscera op macroscopisch opvallende tumoren.Let ook de inhoud van de maag en darmen controleren op bewijzen van voedsel of bloedingen. Beoordeel elk orgaan visueel op de aanwezigheid of afwezigheid van tumoren aan de hand van een checklist van 22 locaties; de scores worden getabuleerd voor de dieren in een specifieke groep om de distributie van de ziekte te vergelijken. Verwijder nu voorzichtig de lever en was deze met PBS.Inspecteer het vervolgens op grove tumoren of abnormaliteiten en scoor deze zoals voorheen. Verwijder daarna de milt, de nier en de pancreas en scoor deze. Inspecteer vervolgens de abdominale lymfeklieren, waaronder de lumbosacrale, renale en mesenteriale lymfeklieren.Nadat het diafragma op tekenen van metastatische verspreiding is beoordeeld, wordt het diafragma verwijderd en worden er twee laterale incisies in de borgholte gemaakt. Verwijder het frontale gedeelte om de longen en het hart bloot te leggen, til de slokdarm voorzichtig op en knip de trachea boven het hart door. Beoordeel na verwijdering van de longen en het hart de weefsels op noduli. Gebruik vervolgens een pincet om het hart samen te knijpen.Een gebrek aan veerkrachtige consistentie kan wijzen op de aanwezigheid van een tumor. Gebruik tot slot een chirurgische schaar om in een rechte lijn door de schedel te knippen. Verwijder voorzichtig kleine stukjes schedel tot de gehele hersenen zijn blootgelegd.Een visueel scoresysteem werd gebruikt om de ziekte, de distributie en de ernst van de ziekte te beoordelen in vijf verschillende groepen dieren. Deze groepen vertoonden een verschillende mate en ernst van de ziekte. Een aanvullende meting, bestaande uit bioluminescentie-imaging direct na de opoffering, werd gebruikt om micro- en macrometastatische laesies kwantitatief te beoordelen.Zodra beide technieken onder de knie zijn, kan de implantatie, nefrectomie of necropsie in vijf tot 10 minuten per dier worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd. Om te onderzoeken of de behandelingsresponsen zouden verschillen tussen typen metastatische tumorcellen. Cellen van metastatisch niercelcarcinoom.Patiëntmateriaal wordt momenteel direct in dieren geïmplanteerd om de lokale en metastatische ziektegroei na ontwikkeling te beoordelen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van RCC om klinisch relevante ziekteprogressie en reacties op therapie te bestuderen. In het bijzonder wordt onderzocht of deze reacties verschillen afhankelijk van primaire gelokaliseerde ziekte of spontane metastatische groei.Vergeet niet dat het werken met kleine dieren die meerdere operaties ondergaan een strikte naleving van de institutionele richtlijnen voor dierprotocollen en steriele omstandigheden vereist. Het comfort en herstel van het dier zijn kritieke variabelen om deze procedure correct uit te voeren.

modeling-spontaneous-metastatic-renal-cell-carcinoma-mrcc-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Twee technieken kunnen worden gebruikt om dit model te stellen: injectie van een kankercel suspensie in de blindedarmkeutels muur of transplantatie van een stukje van subcutane tumor op de blindedarm. Dit model is handig voor het bestuderen van de natuurlijke progressie van colorectale kanker en testen van nieuwe therapeutische middelen tegen colorectale kanker.

Orthotope Muis Model van colorectale kanker

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

In this video, we develop an orthotopic mouse model of renal cell carcinoma. This model results in reproducible primary tumors in the injected kidney and metastatic tumors in the lung, allowing the evaluation of disease progression and treatment.

Generating Renal Cell Carcinoma Model: A Protocol to Develop Orthotopic RCC Murine Model by Intrarenal Implantation of Cancer Cells

Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Prostaatkanker is de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Een orthotopisch kankermodel biedt een nuttige benadering om de biologie van prostaatkanker te begrijpen en de werkzaamheid van therapeutische regimes te evalueren. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen die nodig zijn om een orthotopisch muismodel voor prostaatkanker te vestigen.

Pre-klinische Orthotope muizenmodel van Human prostaatkanker

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

We beschrijven in detail een klinisch relevante colorectale kanker Levermetastasen (CRLM) tumor model en de invloed van lever ischemie reperfusie (I/R) in tumorgroei en metastase. Dit model kan helpen om beter te begrijpen van de mechanismen onderliggende chirurgie-geïnduceerde bevordering van de lever metastatische groei.

Murine model van gemetastaseerde lever tumoren in de setting van ischemie reperfusie letsel

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

Leer een orthotopisch model van spontaan gemetastaseerd niercelcarcinoom bij muizen na nefrectomie. Deze methode maakt gestandaardiseerde evaluatie van experimentele therapeutica mogelijk.

Modelleren Spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) bij muizen na nefrectomie

Meer video's verkennen