Name: Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Leer isotherme titratiecalorimetrie om enzymatische ureumhydrolyse te karakteriseren met jack bean urease. Deze labelvrije methode bepaalt kinetische parameters kcat en Km betrouwbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De gespecialiseerde meststoffen Company (SFP) is erkend voor het verstrekken van de nodige fondsen voor deze studie.

1. Voorbereiden van monsters <ol><li> Bereid 2 ml enzym-oplossing en 0,5 ml substraat oplossing voor elke experimentele run. Verdun geconcentreerde voorraadoplossingen van enzym en substraat in bufferoplossingen met identieke samenstelling om de hitte van verdunnen en vermengen tijdens het substraat toevoeging minimaliseren. <ol><li> Kies de buffer omstandigheden die voldoende zijn om pH-verandering tijdens experiment te voorkomen. Bijvoorbeeld, 20 mM HEPES pH 7 is voldoende voor metingen bij neutrale pH. OPMERKING: Als proton exchange is betrokken, moet protonering enthalpie van de gebruikte buffers worden beschouwd, omdat ze invloed hebben op de gemeten AH van de reactie. Mogelijke specifieke effecten van de buffer of additieven moleculen op het systeem geanalyseerde moet rekening worden gehouden. Als organische oplosmiddelen (bijv. DMSO) zijn opgenomen in de enzymoplossing, voeg ze precies dezelfde concentratie in de substraatoplossing. </li><li> Voor de M1 experiment startenmet enzymconcentratie in het nM bereik (1 nM) en met een substraatconcentratie ten minste drie ordes van grootte hoger dan de enzymconcentratie en boven de KM. </li><li> Voor de M2 experiment beginnen met enzym-concentratie in de PM-nM bereik (bijv. 15 uur). Substraatconcentratie in de spuit in het mM bereik (400 mM). OPMERKING: In de enkele injectie M1 experiment moeten de concentraties voldoende zijn om de totale omzetting van het substraat in het product over de experimentele tijd te bereiken. Daarom is de concentratie van het enzym hangt af van het enzym rate: als enzymen met lage kcat worden bestudeerd, hogere concentraties enzym (tot 10 uM) worden gebruikt. Anderzijds moet enzymconcentraties in de M2 ​​experiment verzekeren dat de geïnjecteerde substraat slechts marginaal (minder dan 5%) verbruikt en dat de enzym reactie verloopt bij steady state. Daarom, hoe hoger deenzymefficiëntie, hoe lager de vereiste enzymconcentratie. Na afloop van het experiment moeten substraatconcentratie in de monstercel boven KM zijn. </li></ol></li><li> Controleer enzym en substraat concentraties voorzichtig met een geschikte analysemethode (bijvoorbeeld absorptie bij 280 nm, colorimetrische assays BCA 11. Dit is nodig om nauwkeurige en betrouwbare berekening van de thermodynamische en kinetische parameters te verkrijgen. </li><li> Meet de pH van de oplossingen en controleer of de pH mismatch van zowel het enzym en het substraat oplossingen is minimaal in de experimentele omstandigheden (± 0,05 pH-eenheden). </li></ol> 2. Het uitvoeren van het Experiment OPMERKING: Dezelfde procedure moet worden toegepast zowel voor M1 en M2 proef, die worden uitgevoerd na elkaar. <ol><li> Controleer of de monstercel en de injectiespuit worden gereinigd volgens de fabrikantinstructies. Vul het laden bijgeleverd met het instrument met gedestilleerd water, voorzichtig steek de naald in de steekproef cel, vul de cel en verwijder de vloeistof met behulp van dezelfde spuit. Met deze methode was de monstercel tweemaal met gedestilleerd water en twee keer met buffer. </li><li> Laad de monstercel met 2 ml enzymoplossing met het laden injectiespuit vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. Injecteer langzaam de oplossing in de cel totdat het lozingen uit de bovenkant van de cel stam. Maak een spurt van ca. 0,25 ml oplossing in de cel. Tweemaal herhalen. Deze stap verwijdert luchtbellen in het monster cel. </li><li> Plaats de naald van de laad-spuit op de richel tussen de cel stam en de cel-poort en verwijder de overtollige oplossing. </li><li> Start de VP-Viewer en vanaf de computer interface equilibreren de ITC instrument een temperatuur 3 ° C onder de gewenste experimentele temperatuur. Dit is nodig om te voorkomen lange equilibratieperioden voor het experiment vanwege de passieve instrumentele koelinrichting. </li><li> Vul de celverwijzing met gedestilleerd water met dezelfde procedure hierboven. Wanneer buffers met hoge ionische sterkte of hoge osmolaliteit in de monsteroplossing, dezelfde buffer als referentieoplossing. </li><li> Link een plastic spuit aan de vulopening van de injectiespuit, met een dunne siliconenslang. Vul de injectiespuit plaatsen van de naald in het water en het opstellen, totdat er water uit de bovenste vulling poort, wat aangeeft dat de injectiespuit vol is. Verplaats dan de spuit uit het water en stelt lucht, om de injectiespuit te legen. Met deze procedure was de injectiespuit met buffer en trekken lucht door het systeem. Plaats vervolgens de injectienaald in een smalle buis die 0,5 ml substraatoplossing, zorgvuldige wijze en volledig vullen van de injectiespuit, waardoor kleine hoeveelheid oplossing op de bodem van de buis. </li><li> Vancomputer interface, drukt u op &quot;Close fill port&quot;. Verwijder het silicium vulbuis. Druk op &quot;Purge en vullen&quot;-knop om de injectiespuit om eventuele luchtbellen te verjagen en om hen terug te verdrijven in de bulk oplossing. Tweemaal herhalen. </li><li> Beweeg de injectiespuit, vegen aan de zijkanten om eventuele druppels halen en de naald van de injectiespuit in de monstercel. </li><li> Op de computer, stel de juiste lopende parameters. De experimentele enzym en substraat concentraties worden vermeld. <ol><li> In de M1 experiment vastgesteld tenminste twee toevoegingen (5-30 pl) van substraat om de reproduceerbaarheid te controleren. Stel de afstand tussen elke injectie (bijv. 1000 sec) groot genoeg is opdat de warmte signaal terug naar de basislijn voor de volgende toevoeging. </li><li> In het M2 experiment ingesteld meerdere (bv. 15 x 5-10 pi) injecties. Stel het interval tussen de injecties (bijvoorbeeld 180 seconde) waardoor het systeem stabilize het thermisch vermogen van de nieuwe baseline na elke injectie. OPMERKING: De afstand tussen de injecties in de M2 ​​experiment moeten kort genoeg zijn om de omzetting van een aanzienlijke hoeveelheid substraat te voorkomen, waardoor de metingen onder stabiele omstandigheden worden uitgevoerd. </li><li> In het M2 experiment gebruikt kleine volumes (bijv. 2 pl) voor de eerste injectie, waarvan de corresponderende waarde in de gegevensanalyse weggegooid. Immers vaak weer artefacten vanwege de oorspronkelijke substraat diffusie door de spuit, en de aanwezigheid van luchtbellen in de naald. </li><li> Stel het referentievermogen, bij benadering niveau waarmee de basislijn voor de reactie worden geplaatst begint bij een waarde van 20. Definieer vervolgens de experimentele enzym en substraat concentraties en koos een naam voor het experiment. </li><li> Definieer de experimentele temperatuur, typisch bij 25 ° C. ITC maakt het werken een temperatuur tussen 2<html> ° C en 80 ° C. Het experiment is klaar voor hardlopen. Druk op &quot;Start&quot;-knop om het experiment te starten. </li></ol></li><li> Nadat het experiment klaar Reinig de monstercel en de injectiespuit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Herhaal het experiment ten minste een of twee keer om de reproduceerbaarheid van de gegevens te controleren. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Uit de analyse programma, klik op de &quot;Read data&quot; knop en navigeer naar de map waar de itc dossier van de uitgevoerde M2 ​​experiment. Ligt. Klik op het pijltje naar beneden scrollen van de &quot;Files of type&quot; en selecteer &quot;Enzyme Assay (het?)&quot;. Vervolgens klikt u op en open de itc-bestand van de M2-experiment.. </li><li> Haal de AH van de reactie van de integratie van de curve van de M1 experiment volgens vergelijking 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Klik op de &quot;Read data&quot; knop, en selecteer het bestand. Itc van de uitgevoerde M1 experiment. Met behulp van Origin, verdeel het spoor in verschillende delen die een piek en bespaar elke piek als een. Opj bestand. Open het bestand overeenkomt met de eerste piek als gevolg van basislijn afwijking in het thermogram van de injectie M1 experiment integreren en verdeel de verkregen gebied, uitgedrukt in μcal door het eindsubstraat concentratie in de monstercel, uitgedrukt in uM, en het celvolume uitgedrukt in liters, bepaling, volgens vergelijking 5, de AH van de reactie. </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor de tweede piek van de M1 experiment en het verkrijgen van een gemiddelde waarde voor de twee AH metingen. </li></ol></li><li> Bepaal dQ / dt van het M2 experiment meten van het verschil tussen de oorspronkelijke basislijn en de nieuwe basislijn na elke injectie. Zetten de eXperimental gegevens om reactiesnelheden volgens vergelijking 4, met behulp van de verkregen in de M1 experiment enthalpiewaarde en past de gegevens aan de Michaelis-Menten-vergelijking. <ol><li> Uit de analyse programma, klik op de &quot;Read data&quot; knop, en selecteer het bestand. Itc van de uitgevoerde M2 ​​experiment. Klik op het pijltje naar beneden scrollen van de &quot;Files of type&quot; en selecteer &quot;Enzyme Assay (het?)&quot;. </li><li> Het dialoogvenster Enzyme Assay wordt geopend, waardoor het selecteren van een van de vier modellen. Selecteer &quot;Methode 2 - alleen Substraat&quot; uit het raam. </li><li> In het venster AH, geven de waarde van AH verkregen in stap 4.2. </li><li> Klik op de &quot;Concentratie&quot; om de concentratie waarden te controleren om te worden gebruikt in de fitting procedure. Klik op de &quot;Gemiddelde tijd (P)&quot; knop. Het dialoogvenster wordt geopend waardoor de kans om te veranderen of accepteer de standaardwaarde. Deze waarde geeft de tijd voordat elke injection waar het instrument het gemiddelde stroomsignaal om de kracht te bepalen bij elke substraatconcentratie. Klik op OK om de standaard waarde te bevestigen. </li><li> Klik op de &quot;Zero Y-as&quot; knop. De cursor verandert in een kruis haar mogelijk maakt om dubbelklikken op een punt, te plaatsen op y = 0. Dubbelklik net voor de eerste injectie. </li><li> Klik op de knop Berekenen Rate. Rate wordt uitgezet tegen de substraatconcentratie, bepaald door het substraat toegevoegd tijdens de titratie van het monster celvolume (rekening houdend verdunning) te delen. Deze operatie geeft een typische Michaelis-Menten plot dat kan worden gemonteerd op K M en k kat verkrijgen. </li><li> Als sommige punten moeten worden geschrapt, selecteert u de knop &quot;Truncate gegevens&quot;. Verplaats de gegevens markers om de slechte datapunten en dubbelklik op een van de markers of druk op Enter te sluiten. </li><li> Gebruik de functie &quot;Fit to model&quot; om de curve te passen en teverkrijgen van de kinetische constanten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+the+biological+sciences%3A+things+are+heating+up%21+BioTechniques%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques.</a> 37, 885-887 (2004).</li>
<li>Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ni2%2B+binding+properties+of+Helicobacter+pylori+NikR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR.</a> Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).</li>
<li>Zambelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+Ni2%2B+binding+selectively+promotes+binding+of+Helicobacter+pylori+NikR+to+its+target+urease+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter.</a> J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Todd, M. J., Gomez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+determined+using+calorimetry%3A+a+general+assay+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity.</a> Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).</li>
<li>Bianconi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+of+enzyme-catalyzed+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions.</a> Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).</li>
<li>Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+enzyme+kinetics+via+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).</li>
<li>Michaelis, L., Menten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+kinetik+der+invertinwirkung%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Z%22%5BJournal%5D)">Die kinetik der invertinwirkung.</a> Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).</li>
<li>Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. , Cambridge University Press. 312-356 (2000).</li>
<li>Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiurli%2C+S+%22Nickel+and+its+surprising+impact+in+nature%22">Nickel and its surprising impact in nature</a>. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).</li>
<li>Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+Ni2%2B+in+urease%3A+sensing%2C+trafficking%2C+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis.</a> Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).</li>
<li>Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+urease+in+germination+of+nitrogen-limited+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds.</a> Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).</li>
<li>Follmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+role+and+structure+of+plant+ureases%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into the role and structure of plant ureases.</a> Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).</li>
<li>Sumner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+crystallization+of+the+enzyme+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The isolation and crystallization of the enzyme urease.</a> J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).</li>
<li>Krajewska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureases+I.+Functional%2C+catalytic+and+kinetic+properties%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cat.+B%22%5BJournal%5D)">Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review.</a> J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).</li>
<li>Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+borne+by+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The burden borne by urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).</li>
<li>Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-+and+pressure-dependent+stopped-flow+kinetic+studies+of+jack+bean+urease.+Implications+for+the+catalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).</li>
<li>Hausinger, R. P., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausinger%2C+RP+%22Handbook+of+Metalloproteins%22">Handbook of Metalloproteins</a>. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. , John Wiley & Sons. 867-879 (2001).</li>
<li>Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+quantities+for+the+ionization+reactions+of+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+Ref.+Data%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).</li>
<li>Baumann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+isothermal+titration+calorimetry+for+xylanase+kinetics+in+comparison+to+chemical-reducing-end+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays.</a> Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).</li>
<li>Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+enzymatic+activity+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+via+isothermal+titration+microcalorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).</li>
<li>Harmon, K. M., Niemann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competitive+inhibition+of+the+urease-catalyzed+hydrolysis+of+urea+by+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate.</a> J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).</li>
<li>Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+rationalization+of+urease+inhibition+by+phosphate%3A+novel+insights+into+the+enzyme+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).</li>
<li>Segel, I. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegel%2C+IH+%22Enzyme+kinetics%3A+behavior+and+analysis+of+rapid+equilibrium+and+steady-state+enzyme+systems%22">Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems</a>. , Wiley, NY. (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Betekenis van ITC om enzymatische activiteit te bestuderen met betrekking tot bestaande methoden Naast de klassieke toepassingen bindingsevenwichten bestuderen, isothermische titratie calorimetrie een betrouwbare en snelle methode om enzymatische reacties in oplossing karakteriseren met de reactiewarmte als een probe, zonder dat het systeem wijziging of labeling. De kinetische parameters kcat en Km worden gewoonlijk verkregen door een reeks tijdsverloop e...

Kwantitatieve bepaling van biochemische reacties geeft inzicht in de biologische processen die aan de basis van het leven. Calorimetry biedt een label-free methode om kwantitatief karakteriseren vrijwel elke chemische reactie in oplossing. Deze techniek meet de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd in de tijd, en dus een universeel detectiesysteem en een zeer gunstige methode om de hoeveelheid reagerende moleculen (bijvoorbeeld binding thermodynamica), alsmede de reactiesnelheid (dwz kinetiek) meten kwantificeren. Met name isothermische titratie calorimetrie (ITC) goedgekeurd als mogelijk om deze de thermodynamica van biomoleculaire evenwichten karakteriseren, waarbij eiwit-ligand, eiwit-eiwit, eiwit-metaalionen en eiwit-DNA-interacties 1-6. Bovendien is het vermogen van ITC kinetische informatie maakt het een zeer krachtig systeem enzym katalyse meten, hoewel het potentieel van deze toepassing nogonderschat 7-9. De Michaelis-Menten-vergelijking 10 is een kwantitatieve beschrijving van enzymatische reacties, omdat het een relatie tussen de reactiesnelheid en de substraatconcentratie, afhankelijk van twee kinetische parameters: de Michaelis-constante (KM) en de katalytische snelheidsconstante (kcat) . De kcat / M-verhouding wordt aangeduid als de katalytische efficiëntie van een enzym. In de praktijk bepalen van K M en k kat voor een specifieke reactie geeft een volledige beschrijving van de katalyse. Bij een kenmerkende enzymatische reactie (figuur 1), een substraat (S) samenwerkt met het enzym (E) die het enzym-substraat (ES) complex, dat vervolgens in de overgangstoestand is geactiveerd (ES *). Deze wordt omgezet in het enzym-product (EP) complex dat uiteindelijk dissocieert. Deze staps worden beschreven door de volgende reactie. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) waarin k 1 is de snelheidsconstante voor de vorming van het ES-complex, k -1 is de snelheidsconstante voor de dissociatie van het ES-complex, terwijl kcat de snelheidsconstante of katalytische omzettingsgetal. Volgens de Michaelis-Menten-vergelijking 10, kan de snelheid van de reactie als volgt berekend: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) waarbij K = M (k -1 + k cat) / k 1 en k cat = v max / [E] met v max wordt de maximale snelheid bereikt wanneer alle enzym gebonden aan het substraat. De isothermische titratie calorimeter is het instrument in deze studie om de enzymatische hydrolyse van ureum karakteriseren. Dit instrument bestaat uit een adiabatische schild met twee gemunt-vormige cellen (Figuur 1). Deze zijn verbonden met de buitenzijde met smalle toegang buizen. De monstercel (ca. 1,4 ml) wordt geladen met de enzymoplossing, terwijl de referentiecel algemeen gevuld met water of met het oplosmiddel dat voor de analyse. Een roterende spuit met een lange naald en een roer paddle bevestigd, en doorgaans ca.. 0,3 ml substraatoplossing, is gemonteerd op de monstercel. Een thermo-elektrische apparaat meet het verschil in temperatuur tussen het monster en de referentie-cel en, met behulp van een &quot;cel feedback netwerk&quot;, stelt zij dit verschil op nul door het optellen of aftrekken van warmte. Tijdens het experiment, wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing op een constante gewenste temperatuur. Wanneer de nlzymatic reactie plaats, de hoeveelheid vrijkomende warmte of geabsorbeerd is evenredig met het aantal substraat moleculen die worden omgezet in product moleculen. Daarnaast wordt de snelheid van warmtestroom direct gerelateerd aan de snelheid van de reactie. De meetgegevens, die als afwijking van de verwarmingskabel uit nulmeting (figuur 1), vertegenwoordigen de thermische (μcal / s) geleverd door het instrument op de monstercel, dat evenredig is met de warmtestroom zich in de monstercel na verloop van tijd. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Schematische weergave van isothermische titratie calorimeter enzymatische reacties bestuderen. Een enzymatische reactie die optreedt bij titratie van het substraat (in de injectiespuit) in de enzymoplossing (in de monstercel) resulteert in een verandering van de thermal macht vrijgegeven door de calorimeter, die nodig zijn om het verschil in temperatuur tussen het monster cel en de celverwijzing constant te houden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> Kortom, de warmteverandering (Q) is evenredig met de molaire enthalpie van de reactie (AH) en het aantal molen product verkregen (n), die op zijn beurt wordt gegeven door het totale maal de concentratie: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) De productvorming in tijd (dP / dt), die overeenkomt met de reactiesnelheid kunnen dus worden gerelateerd aan de hoeveelheid warmte die via gelijktijdig (dQ / dt) door de relatie: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Volgens deze vergelijking om een Michaelis-Menten vinden plot dient te meten i) de totale molaire enthalpie AH, en ii) de warmtestroom dQ / dt bij verschillende substraatconcentraties. Gewoonlijk wordt dit in twee verschillende experimenten: in het eerste experiment (methode 1, M1), wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing en de warmte voor volledige omzetting van het substraat wordt gemeten; in de tweede proef (Methode 2, M2), zijn meerdere injecties substraat uitgevoerd en de snelheid van de warmteproductie gemeten bij verschillende substraatconcentraties. Deze twee sets gegevens zijn voldoende om de kinetische parameters K M en k kat ontlenen. In dit artikel wordt een algemeen protocol om de kinetische parameters voor enzymatische reacties uitgevoerd met behulp van ICT te bepalen beschreven. We pasten de methode om ureum hydrolyse door Canavalia ensiformis ureumse, als referentiesysteem. De goede overeenkomst tussen de zo verkregen resultaten en de gegevens in de literatuur toont de betrouwbaarheid van deze benadering.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>oplossen in water en pH aanpassen met NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>oplossen in water en pH aanpassen met HCl</td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaat</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>oplossen in water</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>oplossen in water</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U4128</td><td>oplossen in water bij 40 &deg;C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis ureum (type C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>oplossen in 20 mM HEPES pH 7 en bewaard bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>VP-ITC op Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td>SYS13901</td><td>instrument&nbsp;</td></tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 op Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td><td>data-acquisitiesoftware geleverd met het instrument</td></tr></tbody></table>

hot biologische katalyse: isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermische titratie calorimetrie (ITC) is een goed beschreven techniek die meet de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd tijdens een chemische reactie, te gebruiken als een intrinsieke probe vrijwel karakteriseren elk chemisch proces. Tegenwoordig wordt deze techniek op grote schaal toegepast op thermodynamische parameters van biomoleculaire bindingsevenwichten bepalen. Bovendien is ITC aangetoond kunnen rechtstreeks meten kinetiek en thermodynamische parameters (kcat, KM, AH) enzymatische reacties, hoewel deze toepassing nog onderbenut. Omdat warmte verandert spontaan optreden tijdens de enzymatische katalyse, heeft ITC geen wijziging of de etikettering van het systeem onder analyse nodig en kan in oplossing worden uitgevoerd. Bovendien moet de methode kleine hoeveelheid materiaal. Deze eigenschappen maken ITC een waardevolle, krachtig en uniek instrument om enzymkinetiek te bestuderen in verschillende toepassingen, zoals bijvoorbeeld geneesmiddelenonderzoek. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In dit werk een experimentele ITC-gebaseerde methode om kinetiek en thermodynamica van enzymatische reacties te kwantificeren wordt grondig beschreven. Deze methode wordt toegepast op kcat en Km bepalen van de enzymatische hydrolyse van ureum door Canavalia ensiformis (Jack Bean) urease. Berekening van intrinsieke molaire enthalpie (AH int) van de reactie wordt uitgevoerd. De aldus verkregen waarden zijn in overeenstemming met eerdere gegevens in de literatuur, waaruit de betrouwbaarheid van de methode.

Urease (EC 3.5.1.5; ureum amidohydrolase) is een multisubunit nikkel-bevattende enzym dat in Archea, bacteriën, eencellige eukaryoten en planten. Dit eiwit werkt in de laatste stap van organische stikstof mineralisatie, katalyseren de hydrolyse van ureum naar ammoniak en carbamaat, die spontaan afgebroken waarna een tweede molecuul van ammoniak en bicarbonaat (vergelijking 6) 12 geven. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq6.jpg" width="45...

Isothermische titratiecalorimetrie maatregelen warmtestroom vrijgelaten of geabsorbeerd in chemische reacties. Deze methode kan worden gebruikt voor enzym-katalyse kwantificeren. In deze paper, het protocol voor instrumentale setup, experiment loopt, en data-analyse wordt in het algemeen beschreven en toegepast op de karakterisering van enzymatische hydrolyse van ureum door jack bean urease.

Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Het volgende experiment beschrijft een betrouwbare, snelle en labelvrije methode die gebruikmaakt van isotherme titratiecalorimetrie om de thermodynamica en kinetiek van enzymatische reacties in oplossing kwantitatief te bepalen, waarbij de in de loop van de tijd afgegeven en geabsorbeerde warmte als interne probe dient. Dit wordt bereikt door de enzymatische reactie plaats te laten vinden in de monstercel van het instrument bij een constante temperatuur en de afwijking van het warmtespoor ten opzichte van de initiële basislijn te monitoren. In een eerste experiment, genaamd Methode één of M1, wordt het substraat in de enzymoplossing geïnjecteerd en wordt de warmte voor de volledige substraatomzetting gemeten, waardoor de totale molaire enthalpie van de reactie kan worden bepaald.In een tweede experiment, genaamd methode twee of M2, worden meerdere injecties van het substraat uitgevoerd, waardoor de snelheid van de warmteproductie in de loop van de tijd bij verschillende substraatconcentraties kan worden gemeten. De resultaten uit de twee calorimetrische experimenten maakten de bepaling van de kinetische parameters, kcat en km, mogelijk, uitgaande van een Michaelis-Menten enzymatis

hot-biological-catalysis-isothermal-titration-calorimetry-to

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.

Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Take serial dilutions of a bacterial culture and add aliquots into calorimetric vials containing growth medium.Load the sealed vials into the multi-well plate of an isothermal microcalorimeter to measure metabolic heat production.The device is held at a constant temperature to ensure the detected heat originates solely from bacterial metabolism.As bacteria metabolize nutrients and proliferate, they release heat that sensors detect in real time.In parallel, incubate identical vials in an...

Isothermal Microcalorimetry to Monitor Metabolic Activity in Bacteria

Kanalen voor het transport van watermoleculen in enzymen beïnvloeden actieve plaats solvatatie en katalyse. Hierin presenteren we een protocol voor de engineering van deze extra katalytische motieven op basis van in silico computermodellen en experimenten. Dit zal ons begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse verbeteren.

Ontrafelen Entropic Rate Versnelling geïnduceerd door Solvent Dynamiek in Membrane Enzymen

De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.

Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

In dit artikel worden gestandaardiseerde ecotoxicologische methoden gepresenteerd voor de evaluatie van biomarkers in neotropische anura-soorten. In het bijzonder beschrijft dit artikel verschillende methodologieën op verschillende schalen van ecotoxicologische evaluatie, zoals genetisch, cellulair-histologisch, biochemisch, morfologisch en individueel niveau.

Ecotoxicologische methodologieën om biomarkers op verschillende schalen te evalueren bij neotropische anura's

Dit artikel beschrijft de bereiding van goed geordende nikkel nanofoams via stroomloos metalen neerslaan op nanoporeuze templates verkregen van zelf-geassembleerde diblokcopolymeer gebaseerd supramoleculen.

Gyroid Nickel nanostructuren van diblokcopolymeer supramoleculen

Silica nanodeeltjes werden bereid met behulp van zuur-katalyse van een siloxaanvoorloper en door middel van door microgolven ondersteunde synthetische technieken, wat resulteerde in de gecontroleerde groei van nanomaterialen met een diameter variërend van 30-250 nm. De groeidynamiek kan worden gecontroleerd door de initiële concentratie aan siliciumzuur, de reactietijd en de reactietemperatuur te variëren.

Bereiding van silica nanodeeltjes door middel van microgolf-geassisteerde zuur-katalyse

Een nieuwe rekening voor de synthese van asymmetrische 1,2-diolen op basis van een retropinacol / cross-pinacol koppelingsmechanisme wordt beschreven. Door de katalytische uitvoering van deze reactie een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele cross-pinacol koppelingen bereikt.

Retropinacol / Cross-pinacol Koppeling Reacties - Een Catalytic Toegang tot 1,2-Unsymmetrical Diolen

Leer isotherme titratiecalorimetrie om enzymatische ureumhydrolyse te karakteriseren met jack bean urease. Deze labelvrije methode bepaalt kinetische parameters kcat en Km betrouwbaar.

Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Meer video's verkennen