Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount In Situ Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei
14 oktober 2014
Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.
Het algemene doel van deze procedure is om een complete wervelkolom, doorknipping en hersendissectie uit te voeren voor de studie van Axon-geleiding na verwonding. Dit wordt bereikt door eerst een lampre-wervelkolom door te knippen ter hoogte van de vijfde kieuw. Vervolgens wordt de hersenen gedissecteerd en vastgemaakt aan een syl-beschermer.
Na het fixeren van de hersenen kan deze worden opgeslagen in methanol of onmiddellijk worden gebruikt voor in situ hybridisatie, uiteindelijk veranderingen in de expressie van axonaal. Geleidingsreceptoren kunnen worden gezien in een regenererende wervelkolom na een ruggenmergblessure. Het voordeel van de techniek die we vandaag gaan demonstreren ten opzichte van meer conventionele paraffine-doorsneden of cryostaat-doorsneden, is dat het je in staat stelt om de hele hersenen te zien, inclusief neuronen die projecteren naar het ruggenmerg die groot en geïdentificeerd zijn.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Kathy Zang, een onderzoekswetenschapper in ons laboratorium. Van de stromen die Lake Michigan voeden, tot de zijrivieren tot de Delaware River in Pennsylvania, of stromen in Maine. Wilde type larvale zeelampers van de soort. Pet mize op Marus werden verkregen.
Larvae van vier tot zeven jaar oud zijn 10 tot 14 centimeter lang en groot genoeg voor de verwonding en dissectie. Houd ze in groepen van 52, honderd. In 50 gallon zoetwatertanks bij 16 graden Celsius.
De tank vereist een grindsubstraat van een inch zodat de lamprei kan lenen. Al het water dat aan de tank wordt toegevoegd, moet worden geconditioneerd met koolstoffilteren en beluchting gedurende minimaal 48 uur voordat het aan de tank wordt toegevoegd. Op voorwaarde dat de dieren binnen een jaar worden gebruikt, is er geen noodzaak om ze voor deze procedure te voeren. Houd vers bereide ringer-oplossing klaar.
Breng eerst een lamp naar een verzadigde waterige benzocaine-oplossing. Zodra het is verdoofd, breng het over naar een schaal half gevuld met sil-bescherming. Plaats de schaal op ijs en bedek de schaal met ijs.
Koude ringer. Bevestig het dier met drie insectenpinnen met een diameter van 0,15, een bij de snuit en twee bij de vijfde kieuw. Plaats het vervolgens onder een stereomicroscoop voor de operatie.
Begin met een schaaltje nummer 11 om een longitudinale insnijding te maken langs de dorsale middenlijn ter hoogte van de vijfde kieuw. Dit zal de wervelkolom onthullen terwijl deze insnijding wordt gemaakt. Gebruik twee haken gemaakt van insectenpinnen om de lichaamswanden vast te zetten met Castro reveal nummer acht, schaar.
Maak een loodrechte snede door de blootgestelde wervelkolom. Inspecteer de gesneden uiteinden van de wervelkolom om er zeker van te zijn dat de doorknipping compleet is. Gebruik vervolgens een pincet om de gesneden uiteinden opnieuw uit te lijnen en de wond te sluiten.
Breng de lampre lava over op een stuk filterpapier gedrenkt in ringer-oplossing. Verplaats de voorbereiding naar een ijsbed gedurende een uur zodat de wond na een uur kan drogen. Breng de lava over naar zijn eigen kleine tank met ijswater.
Laat het daar 24 uur genezen. Controleer na 24 uur op bewegingen cordaal naar de doorknipping. Als er bewegingen zijn, was de doorknipping onvolledig.
Als dat niet het geval is, dan was de doorknipping goed en kan het dier worden verplaatst naar een tank op kamertemperatuur voor herstel terwijl het dier herstelt. Ververs het water om de twee tot drie dagen. Zodra het doorgesneden dier voldoende is hersteld, verdoof het en bereid het voor op dissectie zoals eerder beschreven.
Om de hersenen te dissecteren, begin met een transversale insnijding tussen de neusgat en het pijnappelorgaan. Snijd vervolgens met Castro veal-schaar het weefsel rond de hersenen terwijl het dier wordt vastgezet. Met pincetten.
De witte ovale structuren aan weerszijden van de hersenstam zijn de otische capsules. Zodra de hersenen zijn blootgelegd, gebruik pincetten om de choroïdale plexus te verwijderen. Gebruik vervolgens de gemodificeerde pinhaken om het hoofd van het dier te spreiden en de hersenzenuwen bloot te leggen.
Snij vervolgens de wervelkolom dwars door met de schaar terwijl de wervelkolom met een pincet wordt vastgezet. Snijd de hersenzenuwen om de hersenen te dissecteren. Breng vervolgens de hersenen over naar een klein stuk siliconen en bevestig deze daar.
Gebruik een insectenpin in de wervelkolom en een pin door een van de reukbollen. Snijd vervolgens met de schaar de inter-reukbol commissure, de cerebrale beschermer commissure en de oex van de hersenstam langs de dorsale middenlijn. Zodra de commissuren en oex zijn gesneden, draai de A LR-platen lateraal en prik ze plat op de siliconen met een totaal van zeven insectenpinnen, twee in de reukbollen, twee in de randen van de gesneden, cerebrale beschermer commissure, twee in de verlengde oex, en een in de middenlijn van de wervelkolom.
Nu, met behulp van RNAs-vrije reagentia, fixeer de voorbereiding in 4% para formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende drie uur met zachte agitatie. De hersenen kunnen vervolgens worden geanalyseerd door in situ hybridisatie met behulp van de beschreven methode. Expressie van neogen in transcripten werd geïdentificeerd in het ruggenmerg, projecterende neuronen van controle, dieren en bij dieren. Twee weken na de lesie, hier gezien, is een representatieve ongewonde controle.
Na de complete wervelkolomdoorknipping waren er veranderingen in de expressie van de neogen-receptor. Na twee weken werd de neogen-receptor in de niet-controle voorkeursmatig tot expressie gebracht in slechte regeneratoren zoals de M1 I een I twee I vier, of MTH-neuronen. De ontwikkeling van deze techniek heeft de weg geëffend voor ons vermogen om expressie van geleidingsreceptoren, receptoren voor chondroïtinesulfaat, protio, glycanen en activering van castbases allemaal in dezelfde hersenen te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert technieken voor het uitvoeren van volledige dwarsdoorsneden van het ruggenmerg en dissecties van de hersenen bij zeemuurnen. Het belicht het herstel van de voortbeweging na letsel aan het ruggenmerg en de regeneratiecapaciteiten van specifieke neuronen die naar het ruggenmerg projecteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Regeneratieve biologie
- Letselrespons
Achtergrond
- Zeelampreys kunnen hun voortbeweging herstellen na een volledige dwarslaesie.
- Sommige neuronen die naar het ruggenmerg projecteren, vertonen goede regeneratieve eigenschappen.
- Inzicht in axongeleiding na letsel is cruciaal voor kennis over regeneratie van het ruggenmerg.
- Deze studie maakt gebruik van in situ hybridisatietechnieken voor de analyse.
Doel van de studie
- Om axonale geleidingsmechanismen na letsel aan het ruggenmerg te onderzoeken.
- Om technieken voor transectie van het ruggenmerg en dissectie van de hersenen te illustreren.
- Om veranderingen in de expressie van axonale geleidingsreceptoren te analyseren.
Gebruikte methoden
- Volledige doorsnijding van het ruggenmerg op het niveau van de vijfde kieuw.
- Dissectie van de hersenen en fixatie voor analyse.
- Bewaring van hersenmonsters in methanol of direct gebruik voor in situ hybridisatie.
- Whole-mount preparatie om grote geïdentificeerde neuronen te visualiseren die naar het ruggenmerg projecteren.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoon herstel van de voortbeweging bij lampreys na letsel.
- Verschillen geïdentificeerd in de regeneratiecapaciteiten tussen neuronen met projecties naar het ruggenmerg.
- Veranderingen aangetoond in de expressie van axonale geleidingsreceptoren in regenererende wervels.
- Voordelen van wholemount-technieken ten opzichte van traditionele snijmethoden benadrukt.
Conclusies
- De gepresenteerde technieken bieden waardevolle inzichten in de regeneratie van het ruggenmerg.
- Inzicht in neuronenregeneratie kan toekomstige therapeutische strategieën informeren.
- Whole-mount preparaten maken een uitgebreide analyse van neuronale verbindingen mogelijk.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt mechanistische risicoanalyse van targets voor axonale regeneratie mogelijk door een ziekterevante systeem te bieden voor het bestuderen van intrinsieke neuronale reacties op letsel aan het ruggenmerg. De wholemount-preparatie ondersteunt targetvalidatie via directe visualisatie van grote, identificeerbare neuronen die naar het ruggenmerg projecteren, wat vergelijkende genexpressieanalyse tussen goede en slechte regeneratoren faciliteert. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door moleculaire fenotypes te koppelen aan functionele regeneratie-uitkomsten in een vertebrate CNS-model.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genexpressieprofielen tussen functioneel verschillende neuronpopulaties te vergelijken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om specifieke neuronale subtypen te isoleren en te analyseren die betrokken zijn bij het falen of het slagen van regeneratie.
- Strategische waarde: Ondersteunt de prioritering van targets door moleculaire signaturen te identificeren die geassocieerd zijn met regeneratief vermogen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op kwantitatieve beoordeling van veranderingen in de expressie van axonale geleidingsreceptoren na letsel.
- Operationele waarde: Standaardiseert de wholemount-preparatie van het centraal zenuwstelsel voor consistente in situ hybridisatie-uitlezingen over verschillende experimentele condities.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare screening van geleidingsreceptoren, chondroïtinsulfaatreceptoren en aanverwante targets mogelijk binnen één enkel platform.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Stelt ziekterelevantie vast door de dynamiek van letsel en regeneratie van het centraal zenuwstelsel bij vertebraten te modelleren in de zeelamprey.
- Operationele waarde: Garandeert translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via een consistente wholemount-preparatie.
- Strategische waarde: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door mechanische risicoreductie van axonale begeleidingspaden mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot lead-identificatie door moleculaire readouts te leveren die informatie bieden voor strategieën voor padmodulatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe vergelijking van genexpressie in geïdentificeerde regenererende versus niet-regenererende neuronen mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde wholemount-preparatie die compatibel is met multiplex in situ hybridisatie voor axonale geleidingsreceptoren.
- Analytics: Genereert kwantitatieve ruimtelijke read-outs van veranderingen in receptorexpressie, waardoor teams moleculaire verschuivingen kunnen correleren met fenotypische regeneratie-uitkomsten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via een werveldiers CNS-letselmodel dat functioneel herstel en proximale axonregeneratie vertoont.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van meerdere geleidingsreceptorfamilies (bijv. Neogen, chondroïtine-sulfaat, proteoglycanen) in dezelfde neuronale context.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in axonale regeneratiepaden te verminderen via directe neuronale resolutie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van neuronale dissectie en fixatie voor downstream moleculaire analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig biomarkerbewijs van target-engagement in regeneratie-competente neuronen te leveren.
- Impact op portfolio: Informeert de risicogestuurde prioritering van axongeleidingsdoelen op basis van expressiedynamiek in gevalideerde neuronale populaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken voor ruggenmergtransectie en hersensectie bij larvale zeelampongeen.
- Afhankelijk van toegang tot stereomicroscopie, insectenspeldjes, siliconen substraten en RNase-vrije reagentia voor wholemount-preparatie en fixatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van anesthesie-, herstel- en fixatieprotocollen om een consistente weefselkwaliteit te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het overdragen van protocollen tussen ontwikkelingsstadia of soorten vanwege variaties in de anatomie en grootte van het CZS.
- Beperkt door het genezingsvenster van 24 uur na letsel dat nodig is om volledige transectie te bevestigen voordat men overgaat tot herstel en dissectie.
