Zebravisvoortplanting en het hanteren van embryo's

Zebravisjes zijn een klein maar krachtig modelsysteem. Deze productieve vissen kunnen wekelijks honderden nakomelingen genereren en in hun hele leven vele duizenden. De snelle externe ontwikkeling en transparante lichamen maken de embryo's ideaal voor diverse toepassingen. Deze video behandelt de basisprincipes van het verzamelen en hanteren van embryo's, gevolgd door een beschrijving van huidige onderzoeksmethoden die gebruikmaken van zebravisembryo's.

Om embryo's te genereren, is het nuttig om wat te weten over het paringsgedrag van zebravisjes.

Zebravisjes planten zich seksueel voort, dus voor de fokkerij zijn zowel mannelijke als vrouwelijke vissen nodig. Mannetjes hebben een slanker lichaam met een licht rode gloed, terwijl vrouwtjes grotere, zilverkleurige buiken hebben die vol eitjes zitten.

Periodieke paring houdt de eitjes gezond, maar het produceren van al die eitjes kost veel energie; daarom moeten individuele vrouwtjes slechts één keer per week worden gepaard.

Ten slotte worden, net als bij veel andere dieren, de paringsgedragingen bij vissen gestuurd door zintuiglijke processen.

Olfactorische signalen van het mannetje helpen om het vrouwtje klaar te maken voor het paaien, terwijl een passende sfeerverlichting hen beiden activeert.

Nu we hebben geleerd hoe we mannelijke en vrouwelijke vissen kunnen identificeren, is het tijd om een kruising op te zetten.

Voor het fokken van zebravis gebruiken onderzoekers tanks die speciaal zijn ontworpen voor de paring. Fokkerijbakken hebben doorgaans een uitneembare inzet met gaten waardoor eitjes kunnen vallen. Deze functie beschermt de eitjes tegen het worden opgegeten door hongerige volwassen vissen.

Combineer om te beginnen de volwassen vissen gedurende de middag of avond in de fokkerijbakken. Om de volgende ochtend embryo's in een vroeg stadium te verzamelen, scheidt u de mannelijke en vrouwelijke vissen met een scheidingswand, zodat ze niet paren voordat u klaar bent om met het experiment te beginnen. Zorg ervoor dat de fokkerijbak met een deksel wordt afgesloten om te voorkomen dat de vissen eruit springen. Laat de vissen vervolgens gedurende de nacht aan elkaar wennen.

Nadat de vissen een nacht samen in een kweekbak hebben doorgebracht, zullen ze de volgende ochtend paren.

De eerste stap in de ochtend is het verwijderen van de scheidingswand tussen de mannelijke en vrouwelijke vis om het paaien te initiëren. Als er geen scheidingswand wordt gebruikt, zullen de vissen kort na het inschakelen van het licht eitjes leggen.

Terwijl de mannetjes de vrouwtjes door de bak najagen, stimuleren ze het paaien van de eitjes terwijl ze sperma in het water afgeven voor bevruchting. Wacht ongeveer 15 - 30 minuten na het verwijderen van de scheidingswand om de vissen de tijd te geven om te paren. Verwijder vervolgens de volwassen vissen uit de bak met een net of door de inzet van de bak op te tillen en de vissen in een andere bak te plaatsen.

Giet vervolgens het water en de embryo's door een theezeef van gaas om ze op te vangen. Was daarna de embryo's met behulp van "eiwater" van de zeef in een petrischaal. Het kan nodig zijn om embryo's tussen schalen over te brengen om een optimale dichtheid van 50 - 100 per schaal te bereiken. Om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling in een normaal tempo verloopt, worden de schalen in een incubator bij 28.5 °C geplaatst.

Zodra u de embryo's heeft, dient u ze met zorg te behandelen. Ze zijn essentieel voor uw experimenten! Laten we enkele aanwijzingen bespreken.

Om de embryo's gezond te houden, moet u ervoor zorgen dat het water in de petrischalen schoon is en vrij is van vuil. Dode embryo's worden opaak en moeten dagelijks worden verwijderd. Daarnaast kan methyleenblauw aan het water worden toegevoegd om schimmegroei te voorkomen.

Gebruik telkens wanneer u embryo's van de ene schaal naar de andere moet verplaatsen een transferpipet. Door de schaal te draaien, kunt u de embryo's in het midden van de plaat concentreren, waardoor het pipetteren eenvoudiger wordt.

Sommige protocollen vereisen enkele extra stappen voor het onderhoud van de embryo's. Gedurende de eerste drie levensdagen ontwikkelen zebravissen-embryo's zich in een chorion, wat de manipulatie van het embryo kan belemmeren. Het chorion kan worden verwijderd door behandeling met het proteolytische enzym pronase, of door het handmatig met een pincet te verwijderen. Daarnaast beginnen zebravissen na 24 uur pigment te ontwikkelen, zoals hier te zien is bij deze zebravislarve, wat microscopie kan bemoeilijken. Om dit probleem te omzeilen, voegen wetenschappers PTU toe aan het embryo-water, wat de productie van het pigment melanine remt.

Nu u weet hoe u zebravisembryo's verkrijgt en verzorgt, gaan we enkele manieren bekijken waarop onderzoekers deze gebruiken voor wetenschappelijke ontdekkingen.

De externe ontwikkeling van zebravisembryo's maakt genetische manipulatie mogelijk door micro-injectie van DNA, RNA of gene knockdown-reagentia. Deze methode leidt tot een uniforme distributie van het geïnjecteerde materiaal door het embryo en kan zichtbare fenotypes produceren die het resultaat zijn van overexpressie of verlies van een eiwit. Dezelfde techniek kan ook worden gebruikt om transgene vissen te maken waarin specifieke structuren worden gemarkeerd door de expressie van fluorescerende eiwitten.

Daarnaast maakt de geringe omvang van zebravisembryo's en -larven hen ideaal voor fenotypische chemische screening. Hierbij worden embryo's in 96-wellplaten geplaatst en vervolgens behandeld met bibliotheken van kleine moleculen door de chemicaliën aan het water toe te voegen. Later worden deze platen met vissen gescreend op morfologische defecten, zoals de abnormale ontwikkeling die hier wordt getoond.

Ten slotte maakt de transparantie van de zebravisembryo's hen zeer geschikt voor microscopie. Levende embryo's die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in specifieke celtypen kunnen worden gemonteerd en gevisualiseerd met confocale microscopie, waardoor onderzoekers celbewegingen in ontwikkelende weefsels over een bepaalde tijd kunnen bestuderen.

U heeft zojuist de JoVE-video over het fokken van zebravissen en het hanteren van embryo's bekeken. In deze video hebben we de basisprincipes van de paring, het inrichten van kweekbakken en het hanteren van embryo's besproken. We hebben ook enkele onderzoeksmethoden behandeld die gebruikmaken van dit krachtige kleine embryo. Bedankt voor het kijken!