Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Het algemene doel van deze procedure is om fosfolipide dubbellaagvesikels te genereren met meer controle over membraan, unla, molariteit, monodispersiteit en interne inhoud. Met behulp van CAD wordt een kamer vervaardigd uit acrylplaten en natuurlijk rubber. Een opgehangen lipide dubbellaag wordt geproduceerd door de kamer te laden met lipiden en oplossing.

Vervolgens wordt een inkjet gevuld met de oplossing die moet worden ingekapseld, ingesteld met het spuitapparaat. Zodra de juiste instellingen zijn vastgesteld, zullen gespoten vloeistofpulsaties fosfolipide dubbellaagvesikels produceren. Uiteindelijk levert microfluïdisch spuiten herhaalbare monodisperse dubbellaagvesikels op.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals elektroformatie, emulsie of druppelgeneratie, is een hoger niveau van controle over membraan, unilateraal molariteit, monodispersiteit en interne inhoud. De procedure zal worden gedemonstreerd door Johanna Harrow, een afgestudeerde student uit een laboratorium en wordt bijgestaan door Kara Patel, een bachelorstudent. Gebruik CAD-software om een vorm voor de kamer te tekenen die kan worden gemaakt van acryl met behulp van een lasersnijder, maak eerst gaten van een zestiende inch aan beide zijden van de geassembleerde acrylkamer. Dat zal afvloeien naar de oneindig gevormde put.

Snijd vervolgens een klein rechthoekje met een schaar uit een acrylplaat van 0,2 millimeter om als bodem van de oneindig gevormde put te dienen. Bevestig dit op zijn plaats met sneldrogende lijm, zorg ervoor dat er geen lijm in de kijkgebieden komt. De acrylplaat moet vloeiend zijn aan de wand van de kamer en vastzitten aan de bodem van de kamer.

Gebruik vervolgens sneldrogende lijm om een ​​dun stuk natuurlijk rubberblad over de geboorde gaten te lijmen. Druk ze op hun plaats met behulp van pincetten. Test alle gelijmde naden op lekken.

Er zouden er niet mogen zijn. Tot slot, gebruik een 23 gauge naald om gaten in het rubber te prikken door de geboorde gaten, de piëzo-inkjettip zal door deze gaten worden geïnserteerd. Stokfosfolipiden moeten worden opgelost in chloroform en worden bewaard bij min 20 graden Celsius.

D-P-H-P-C of DOPC. Lipiden worden gebruikt in deze demonstratie. Lipiden opgelost in chloroform worden overgebracht naar een glazen flacon terwijl de flacon schuin wordt gehouden, droog de lipiden voorzichtig onder argon of stikstofgas.

Plaats vervolgens de flacon met de dop licht los onder vacuüm gedurende een tot twee uur om resterend oplosmiddel te verwijderen. Een droogkast kan ook worden gebruikt voor deze stap. Solubliseer nu de lipiden in einddecking voor een uiteindelijke lipideconcentratie van 25 milligram per milliliter.

Vortex de oplossing. Sluit de dop kort af met param en soniceer vervolgens gedurende 15 minuten. Bewaar deze oplossing bij min 20 graden Celsius.

Bereid vervolgens een stamsucroseoplossing voor met een fysiologisch vergelijkbare osmolariteit. Dit is de spuitoplossing. Overweeg om een ​​druppel donkere voedselkleurstof of fluorescerende kralen aan de oplossing toe te voegen voor extra contrast of fluorescentie.

Laad de sucroseoplossing in een spuit van één milliliter om gevangen lucht te verwijderen. Knijp in de spuit zodat eventuele bellen naar de aasopening stijgen en kunnen worden verdreven. Bevestig vervolgens een 33 millimeter 0,22 micron filter aan de spuit en duw een druppel door het filter.

Schroef nu de vrouwelijke aasadapter van de inkjet los en druk deze op het uiteinde van het filter. Duw wat vloeistof naar buiten om eventuele gevangen lucht te verwijderen. Bevestig tot slot de spuit aan de bovenkant van de inkjetvloeistof.

Zou naar de inkjettip moeten reizen als de spuit correct is bevestigd. Monteer eerst de spuitassemblage op de microscoopstandaard en sluit de inkjetcontroller aan voor dit experiment. De standaard en spuit hebben onafhankelijke besturing nodig, waarbij zowel de standaard als de spuit in drie dimensies bewegen voor visualisatie.

Stel een hogesnelheidscamera in die in staat is tot minimaal 1000 frames per seconde. Stel het in om op afbeelding gebaseerde automatische activering te gebruiken om opnames te starten. Bevestig nu de kamer aan de standaard met tape en lijn de inkjettip zorgvuldig uit met het gat in het rubberen vel aan de zijkant van de kamer.

Pas eerst aan op ooghoogte en maak vervolgens fijne aanpassingen met behulp van de microscoop. Zodra ze zijn uitgelijnd, trekt u de spuit langs één dimensie terug om de oneindig gevormde te laden. Pas vervolgens een lichte druk toe op de plunjer, zodat zich een druppel op de mondstuk vormt.

Dit zorgt voor enige initiële tegendruk. De spuitparameters moeten worden ingesteld. Vervolgens worden specifieke waarden voor een trapeziumvormige bipolaire golf gepresenteerd op het scherm met toegepaste spanning en het aantal spuitpulsen per trigger dat de blaasjesgrootte regelt.

Laad nu de kamer met 25 tot 30 microliters van de lipideoplossing in einddecennium, waarbij het volledige oppervlak van de oneindig gevormde wordt bedekt. Voeg vervolgens 25 microliters glucoseoplossing toe aan de buitenste rand van het pijpje, langzaam en soepel, de glucose mag niet in de lipideoplossing mengen. Binnen 10 minuten zal zich een lipide dubbellaag vormen in het midden van de kamer.

Het opzetten van de dubbellaag is de meest kritische stap, omdat de dubbellaag onstabiel is en kan breken, afhankelijk van de voorbereiding. Wees geduldig. Het zal lukken als je de kamer een paar keer oefent met vullen.

Breng nu voorzichtig de inkjettip terug in de kamer wanneer de tip zich binnen 200 micron van de druppelinterface bevindt. Bilayer, start het spuitproces en neem de gegevens op met behulp van de inkjet die inzicht biedt in het proces van blaasjesgeneratie. Bijvoorbeeld, het variëren van de afstand tussen de inkjetmondstuk en lipide dubbellaag beïnvloedde de kracht die het membraan vervormt.Close.

De nabijheid van de dubbellaag concentreerde de straal en voorkwam dat het membraan energie rond