Name: Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer twee methoden om primaire humane endometriale stromale cellen te isoleren uit hysterectomie-exemplaren. Deze technieken gebruiken mechanische schraping of trypsine-vertering voor betrouwbare celkweek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de gezamenlijke inspanningen van dr. Thao Dang en de leden van haar lab voor het gebruik van hun beeldvorming en microscoop apparatuur. We danken ook de biorepository en Tissue Research Facility (BTRF) kern, Jeff Harper, en de bewoners aan de Universiteit van Virginia voor het verstrekken van ons met baarmoeder weefsel. Wij danken Karol Szlachta voor de hulp met schematisch overzicht.

Hysterectomie exemplaren gebruikt in dit manuscript werden verzameld in overeenstemming met een universiteit IRB goedgekeurde ethiek protocol genummerde IRB-HSR # 14424. 1. Sample Overname van Clinical Bron <ol><li> Verkrijgen overheid en het institutioneel bepaalde ethische richtlijnen en documentatie goedkeuring voordat u begint. </li><li> Voeren alle stappen in steriele omstandigheden. </li><li> Domein-patiënt afgeleide weefsel in medium (RPMI of DMEM / High Glucose) in een 50 ml buis bij 4 ° C indien het monster niet kan worden verwerkt in kweek onmiddellijk. Monsters kunnen in deze toestand worden bewaard gedurende maximaal 24 uur. </li><li> Was weefselmonster driemaal met 1X steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en de oplossing tussen wasbeurten ontdoen. </li></ol> 2. Voorbereiding van de primaire cellijnen met behulp van de schrapen Methode <ol><li> Voeg 4-10 ml groeimedium (RPMI of DMEM / hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycin) weefsel en voeg Fungizone (0,25 ug / ml eindconcentratie) gedurende 30 minuten. </li><li> Gooi de groeimedia. </li><li> Was weefsel tweemaal met 1X PBS. </li><li> Plaats het weefsel op een 6 cm celkweekplaat om onderscheid te maken tussen myometrium en endometrium lagen (zie de figuren 2A-2C voor een nadere beschrijving). Scheid het endometrium. </li><li> Met behulp van een scalpel of scheermesje, doorsnijden het weefsel in kleine stukjes, terwijl krabben op de 6 cm celkweekschaal. Deze krassen vergemakkelijken van de bevestiging van de nieuwe primaire endometriumcellen. Vergeleken met de trypsine werkwijze wordt meer weefsel nodig (zie figuur 2D een benadering). </li><li> Zachtjes, voeg 2 ml groeimedium om krassen gerecht (weefselfragmenten zichtbaar en ideaal geïmmobiliseerd van het krassen beweging zijn). </li><li> Breng de plaat (platen) over aan een celkweek incubator (37 ° C en 5% CO2). Wijs een plek voor primaire cellijnen, weg van OTHer celkweekschalen. Primaire kweken zijn gevoeliger voor infectie en verontreiniging. </li><li> Onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop dagelijks. Kleine populaties van cellen zou ontstaan ​​bij dag twee of drie van over de plakjes weefsel (zie figuur 3B). </li><li> Om culturen te behouden, was voorzichtig met 1X PBS en voeg verse groeimedia (2 ml) om de drie dagen. Wanneer proliferatie toeneemt, extra groeimedia (3-4 ml) kan worden toegevoegd aan de 6 cm kweek plaat (platen). Opmerking: Tijdens het wassen en media verandert, zal stukjes weefsel waarschijnlijk worden opgezogen. Dit heeft geen invloed op de groei van hechtende cellen. Het weefsel moet worden opgezogen door de volgende stap (2,10) nieuwe kolonies waarschijnlijk ontstaan ​​na een week. </li><li> Wanneer de 6 cm plaat is ongeveer 75-80% samenvloeiing (zie figuur 3B), doorgang met behulp van 0,05% trypsine. Primaire cellen kan niet onbeperkt worden gepasseerd - bevriezen beneden een plaat van cellen zodra twee of drie borden zijn maintained. Als er meer passages nodig zijn, volgen een immortalization protocol (beoordeeld in Ref 3). </li></ol> 3. Voorbereiding van de primaire cellijnen met behulp van de trypsine-methode <ol><li> Leg een klein stukje endometriumweefsel (zie Figuur 2D voor een benadering) in 2 ml van 0,25% trypsine aangevuld met Kanamycine (0,03 mg / ml uiteindelijke concentratie). </li><li> Incubeer weefsel bij 37 ° C op draaiplateau 30 minuten. </li><li> Kort vortex het weefsel. </li><li> Centrifugeer het monster bij 200-400 xg gedurende 2 minuten en gooi het supernatant. </li><li> Voeg verse trypsine en Kanamycin. </li><li> Incubeer het weefsel bij 37 ° C onder draaiing een uur. </li><li> Vortex het weefsel voor 5-10 sec. </li><li> 2 ml groeimedium (aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine) Aan trypsine gedeactiveerd. </li><li> Centrifugeer cellen bij 200-400 g gedurende 2-3 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 2 ml groeienth media om de gepelleteerde cellen. </li><li> Plaat op een 6 cm celkweekschaal. Het schrapen van de plaat zoals in stap 2.5 van voorbereiden Primaire cellijnen met behulp van de schrapen methode is niet nodig, maar bevordert de hechting en uitgroei van primaire culturen. </li><li> Monitor cellen onder een lichtmicroscoop dagelijks. Cellen zijn meestal zichtbaar onder een lichtmicroscoop na 24-48 uur (zie Figuur 3C). </li><li> De culturen behouden bewaken de cellen en media veranderen elke 2-3 dagen als in stap 2.9. </li><li> Om de passage van de cellen, gebruik 0,05% of 0,25% trypsine wanneer cellen te bereiken 75-80% confluentie (zie figuur 3C). </li></ol> 4. Opslaan extra weefsel voor analyse (Snap Invriezen en formalinefixatie) <ol><li> Tweemaal spoelen monster met 1X PBS. </li><li> Zuig zoveel vloeistof als mogelijk. </li><li> Voor Snap Bevriezing, plaatst endometriumweefsel monster in een 1,7 centrifugebuis (zie figuren 2F en 2G). Plaats de 1.7centrifugebuis in vloeibare stikstof gedurende 10 seconden of totdat blijkt dat het weefsel beneden bevroren. Opmerking: Zorg ervoor dat u rechtstreeks aan vloeibare stikstof bij de voorbereiding van de monsters. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot verdere verwerking of analyse. </li><li> Voor formalinefixatie, snijd een klein stukje van het endometrium weefsel (zie figuur 2H), en onder te dompelen in 10% gebufferde formaline zink. Na 24 uur, gooi formaline en voeg 70% ethanol weefselmonsters tot verdere verwerking. </li></ol> 5. Immunofluorescentie (IF) <ol><li> Cel fixatie <ol><li> Bereid cellen op een cultuur dia of plaat. </li><li> Voorzichtig, wassen cellen met 1X PBS. </li><li> Add voorgekoeld (4 ° C) methanol en aceton (gemengd bij een 1:1 verhouding) gedurende 5 minuten. </li><li> Lucht drogen de dia voordat u verder gaat. Dia kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1-2 weken indien nodig. </li></ol></li><li> Verwerking IF <ol><li> Hydrateren cellen met 1X PBS gedurende 10 minuten. Voor de voorllowing stappen 1-6 over tot alle wast en incubatie op een draaiend platform. </li><li> Vak met 1X PBS aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA) en 1% soortspecifieke serum (bron 2e antilichaam) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Incubeer in primaire antilichaam (zie aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaam verdunningen). Zie Materialen voor specifieke antilichamen. Verdun het primaire antilichaam in verse blokkerende buffer als in stap 5.2.2. Deze incubatie kan worden uitgevoerd ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was 3 maal met 1X PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer in het secundair antilichaam (zie aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaam verdunningen). Verdun het secundaire antilichaam in verse blokkerende buffer als in stap 5.2.2. Om fotoblekingsreactie voorkomen, is het belangrijk om deze en de volgende stappen uitvoeren in de afwezigheid van licht. </li><li> Was 3 maal met 1X PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Thoroughly dia drogen. </li><li> Voeg montage media en DAPI tegenkleuring oplossing. </li><li> Solliciteer dekglaasje en sluit de randen met behulp van kit (s). Dia&#39;s kunnen bij 4 ° C worden bewaard in het donker gedurende 2 weken. </li></ol></li></ol> 6. RNA-extractie <ol><li> Pellet 1 x 10 7 cellen door centrifugeren. Alle materialen en reagentia in dit protocol moet gratis worden RNAse. </li><li> Lyse cellen in 1 ml TRIZOL-reagens en incubeer de monsters gehomogeniseerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om dissociatie van nucleoproteïne complexen voltooien. </li><li> Voeg 200 ul chloroform per 1 ml TRIZOL. Schud krachtig met de hand gedurende 15 seconden en incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer bij maximale snelheid (15.000 x g) gedurende 15 min bij 4 ° C. Drie lagen resulteert. </li><li> Breng de bovenste waterige fase over in een schoon microcentrifugebuisje. Voeg 1 ui glycogeen de RNA opbrengst te verhogen; echter, deze stap is alleen nodig wanneer een kleinehoeveelheid RNA verwacht. </li><li> Voeg 0,5 ml isopropylalcohol aan de waterige laag en keren de monsters 3-5 keer. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Om opbrengst te verhogen, kunnen monsters -20 ° C of -80 ° C gedurende 30 minuten geplaatst. </li><li> Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Op dit punt zou een kleine pellet RNA zichtbaar. Verwijder het supernatant. </li><li> Was de RNA met 1 ml 75% ethanol. </li><li> Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 5 minuten en gooi het supernatant. Monsters kunnen weer aan anorganische verontreinigingen af ​​te wassen, maar deze stap is niet noodzakelijk. </li><li> In het kort, droog de RNA pellet tot RNA pellet droog is (duurt meestal 7-10 min). Opmerking: Een extra stap kan worden gebruikt om anorganische stof af en verminderen droogtijd. Na het teruggooien van het supernatant van de ethanol te wassen, spinnen monsters bij de maximale snelheid voor een extra minuut en zuig resterende vloeistof. Zorg dat er geen pellet zuigen. </li><li> Los RNA in RNase-free water, afhankelijk van de grootte van de RNA-pellet. Volumes variëren meestal 10-50 ul. </li><li> Incubeer monsters bij 55 ° C gedurende 10 min, en meet de concentratie van RNA. </li><li> WINKEL monsters bij -20 ° C tot verdere verwerking. </li></ol> 7. Reverse Transcriptie <ol><li> Het monster RNA (1-3 ug) tot een volume van 9 pl met H2O </li><li> Warmte RNA 70 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Een AMV master mix genereren, combineren de volgende reagentia: 5 pl dNTP (werkende concentratie van 50 uM), 5 pl N6 DNA oligo (bewerken concentratie van 80 uM), 5 ui 5X AMV buffer en 1 pl AMV . Deze master mix oplossing is ontworpen per een monster. </li><li> Voeg 16 ul van de master mix tot het verwarmde RNA. Het uiteindelijke reactie volume 25 pi reactie. </li><li> Gebruik de volgende PCR-omstandigheden voor omgekeerde transcriptie: (fase 1) 42 ° C gedurende 90 min, (Stage 2) 95 ° C gedurende 5 min, en (stadium 3) 4 ° C tot verdere verwerking. </li></ol> 8. Real Time PCR <ol><li> Voer PCR-reacties met de primers, annealing temperatuur, cyclus nummers en reagentia in tabel 1. Opmerking: Het is ideaal om instructies van de fabrikant volgen bij het ​​gebruik van PCR-reagentia (zie bedrijfs-en catalogusnummers in Materials). </li></ol> 9. In vitro decidualization Protocol (Derived from Ref 4 en 5) <ol><li> Plate endometriumcellen. </li><li> Groeien tot een confluentie van 75-85%. </li><li> Na cellen confluent, eenmaal wassen met 1X PBS. </li><li> Snel, add-hormoon vrije media (fenol vrij RPMI aangevuld met 5% houtskool strip FBS en 1% penicilline-streptomycine). </li><li> Na 24 uur, voeg hormoon vrij medium aangevuld met medroxyprogesteronacetaat (MPA) bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM en 8-bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-Cyclisch monofosfaat (cAMP) in een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM. </li><li> Na ten minste 48 uur, stop de reactie en bewaar de plaat (s) voor verdere verwerking. </li></ol>

<ol><li>Heller, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeller%2C+D+%22in+The+endometrium%3A+a+clinicopathologic+approach%22">in The endometrium: a clinicopathologic approach</a>. Heller, D. , 56-75 (1994).</li>
<li>Emera, D., Romero, R., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+menstruation%3A+a+new+model+for+genetic+assimilation%3A+explaining+molecular+origins+of+maternal+responses+to+fetal+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness.</a> Bioessays. 34, 26-35 (2011).</li>
<li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li>
<li>Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+SUMO+pathway+sensitizes+differentiating+human+endometrial+stromal+cells+to+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).</li>
<li>Salamonsen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+the+human+endometrium+and+uterine+fluid%3A+a+pathway+to+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery.</a> Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).</li>
<li>Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+human+endometrial+receptivity+from+transcriptomic+and+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data.</a> Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).</li>
<li>Chen, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+midproliferative+and+midsecretory+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium.</a> J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).</li>
<li>Talbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+human+endometrium+distinguishes+menstrual+cycle+phases+and+underlying+biological+processes+in+normo-ovulatory+women%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women.</a> Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).</li>
<li>Punyadeera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen-modulated+gene+expression+in+the+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.</a> Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).</li>
<li>Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle.</a> Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).</li>
<li>Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+long-term+culture+of+normal+human+endometrial+epithelium+and+stroma.+Expression+of+mRNAs+for+angiogenic+polypeptides+basally+and+on+oestrogen+and+progesterone+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges.</a> J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).</li>
<li>Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cells+from+term+human+decidua+closely+resemble+endometrial+stromal+cells%3A+induction+of+prolactin+and+insulin-like+growth+factor+binding+protein-1+expression%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression).</a> Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+and+progesterone+receptor+cross-talk+in+human+endometrium%3A+a+decidualizing+affair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair.</a> J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).</li>
<li>Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+endothelin+released+by+human+endometrial+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).</li>
<li>Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+identification+of+cultured+cells+from+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histochemical identification of cultured cells from human endometrium.</a> In Vitro. 20, 25-32 (1984).</li>
<li>Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+production+by+cultured+human+endometrial+stromal+cells%3A+identification+of+interstitial+collagenase%2C+gelatinase-A%2C+gelatinase-B%2C+and+stromelysin-1+and+their+differential+regulation+by+interleukin-1+alpha+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Sakai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+acetylation+in+ovarian+steroid-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).</li>
<li>Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+AMP+and+estrogen%2Fprogesterone+on+the+transcription+of+DNA+methyltransferases+during+the+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IGFBP-1+expression+by+cAMP+is+associated+with+histone+acetylation+status+of+the+promoter+region+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).</li>
<li>American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322">http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322</a> (2013).</li>
<li>Salker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+of+human+embryos%3A+impaired+decidualization+of+endometrium+disables+embryo-maternal+interactions+and+causes+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te openbaring.

Andere groepen hebben beschreven en aangepaste methodologie voor de bereiding van endometriale stromale culturen, waarvan de meeste gebruik collagenase 4,12,13,15-18. In dit manuscript hebben we methodologie en bewijsmateriaal voor twee vereenvoudigde primaire endometriale stromale kweekmethoden, die beide worden gebruikt door ons laboratorium om economische redenen en de gemakkelijke verkrijgbaarheid van trypsine en / of een scheermesje. Wanneer onze twee methoden vergelijken, zo...

De menselijke baarmoeder corpus bestaat uit drie lagen, de perimetrium (of serosa), het myometrium en het endometrium. Onderscheidende elk van deze lagen een belangrijke stap endometrium cellijnen vast. De perimetrium is de buitenste laag van de baarmoeder en samengesteld uit dunne, sereuze cellen. De myometrium is de dikke, middelste laag van de baarmoeder en bestaat uit gladde spiercellen. Het endometrium is geïdentificeerd als de binnenste laag van de baarmoeder en omvat epitheliale en stromale cel populaties. Het endometrium is verder onderverdeeld in de basalis laag waarvan stamcelpopulatie wordt verondersteld dat de functionalis laag herbevolking ongeveer elke 28 dagen 1. De functionalis laag van het menselijke endometrium ondergaat significante biochemische en morfologische veranderingen in respons op circulerende hormonen. Deze hormonen zijn afgeleid van de hypofyse en de eierstokken. Degecoördineerde productie en afgifte van hormonen resulteert in een voortplantingscyclus. De voortplantingscyclus is ontworpen om het endometrium te bereiden op mogelijke embryo implantatie gebeurtenissen. Bij mensen wordt de voortplantingscyclus bekend als &quot;de menstruele cyclus&quot; en onderverdeeld in drie fasen - proliferatieve, secretoire en menstruatie. De proliferatieve fase betreft de verspreiding van de functionalis endometrium laag terwijl de secretoire fase wordt gekenmerkt door functionalis rijping. Specifiek extracellulaire veranderingen, afscheidingen en celdifferentiatie signaal een mogelijke inplanting. Als implantatie niet geschieden vóór het einde van de secretoire fase wordt de functionalis baarmoederslijmvlies laag vergoten tijdens de menstruele fase. Het belang van de menstruatie en de gebeurtenissen die het vergieten van de functionalis laag triggeren zijn nog gedebatteerd. In mensen, is gesteld dat de menstruatie is het gevolg van een specifieke mid-secretoire fase differentiatie gebeurtenis bekendals &quot;spontane decidualization&quot; 2. In dit manuscript hebben we gedetailleerde methodologie voor zowel endometrium stromale celisolatie methoden, en gebruik een combinatie van immunofluorescentie en digitale beelden naar de werkzaamheid van deze benaderingen te tonen. Daarnaast we een algemeen in vitro model van spontane decidualization endometrium stromale cel isolatie bevestigen.

<table><tbody><tr><td>0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 of SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 micro Centrifuge Tube&nbsp;&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro;l, 20 &micro;l, 200 ml and 1,000 &micro;l Pipette&nbsp;&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Cell Culture Dish&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 well Chambers&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Acetate&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzyme/Buffer&nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Zinc Formalin&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal strip FBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip&nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Cyclic AMP (cAMP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High Glucose&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Goat -TRITC&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum&nbsp;</td><td>Jackson&rsquo;s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Cadherin Antibody&nbsp;&nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Probe&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Mouse - FITC&nbsp;</td><td>Jackson&rsquo;s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin&nbsp;&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone acetate (MPA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Methanol)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media (w/DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 Scraper&nbsp;&nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin&nbsp; Mouse mAB&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X&nbsp;&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Goat Anti body&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Primer(s)&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Phenol free)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody&nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

twee methoden voor het vaststellen van primaire humane endometriale stromal cellen uit hysterectomie exemplaren

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Vele inspanningen gedaan om te bepalen in vitro celkweek systemen. Deze systemen zijn ontworpen om een model van een groot aantal in vivo processen. Celkweek systemen die voortkomen uit menselijke endometrium monsters zijn geen uitzondering. Toepassingen variëren van normale cyclische fysiologische processen endometrium pathologieën zoals gynaecologische kankers, infectieziekten en voortplantingsfunctie. Hier bieden we twee methoden voor het vaststellen van primaire endometrium stromale cellen van chirurgisch weggesneden endometrium hysterectomie exemplaren. De eerste methode wordt aangeduid als &quot;het schrapen methode&quot; en omvat mechanische schrapen met chirurgische of scheermesjes, terwijl de tweede methode wordt aangeduid als &quot;de trypsine-methode. &#39;Deze laatste methode wordt de enzymatische activiteit van trypsine om de scheiding van de elementen en bevorderen cel uitgroei. We illustreren stap-voor-stap methode door middel van digitale beelden en microscopie. We hebben ook provide voorbeelden voor het valideren van endometrium stromale cellijnen via kwantitatieve real time polymerase kettingreactie (qPCR) en immunofluorescentie (IF).

Zoals benadrukt in de sectie Protocol, moet u alle methoden onder overheid, institutionele en ethische richtlijnen uit te voeren bij het ​​hanteren en het voorbereiden van menselijk weefsel. Inbegrepen in dit manuscript is een illustratie van de algemene werkschema van &quot;het schrapen methode&quot; (figuur 1A) en &quot;de trypsine-methode&quot; (figuur 1B) gebruikt om primaire kweken endometrial stellen. Deze werkwijzen worden in detail b...

Oprichting primaire endometrium stromale celkweek systemen van hysterectomie exemplaren is een waardevolle biologische techniek en een cruciale stap voorafgaand aan het nastreven van een breed scala van onderzoek wil. We beschrijven hier twee methoden om stroma culturen chirurgisch weggesneden endometriale weefsel van menselijke patiënten vastgesteld.

Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Het algemene doel van deze procedure is het vestigen van primaire endometriale stromale celculturen uit geresecteerde hysterectomieën. Dit wordt bereikt door eerst de baarmoederlagen te onderscheiden en te scheiden om een sectie endometrieel weefsel te isoleren. De tweede stap is het kiezen van een celisolatietechniek tussen de schraap- en tryin-methoden wanneer de schraapmethode wordt toegepast.Mechanische kracht en schrapen worden gebruikt om endometriale stromacellen te scheiden en te dissociëren. Alternatief, bij gebruik van de trypsinemethode, wordt de enzymatische activiteit van trypsine gebruikt om endometriale stromacellen te scheiden en te dissociëren. Uiteindelijk wordt microscopie gebruikt om celgroei en morfologie te observeren, terwijl andere technieken die in het manuscript worden besproken, worden gebruikt om endometriale stromaculturen te verifiëren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke fysiologische vragen binnen het reproductieve veld, zoals fenomenen betreffende de reproductiecyclus en menstruatie. De hysterectomie-monsters die in dit manuscript zijn gebruikt, zijn verzameld in overeenstemming met een door de universiteits-IRB goedgekeurd e

two-methods-for-establishing-primary-human-endometrial-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the protocol to isolate primary human mesothelial cells from the human omentum specimen. The mesothelial cells can be used to establish an in vitro ovarian cancer model to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Mesothelial Cell Isolation: A Technique to Isolate Primary Mesothelial Cells From Human Omentum Tissue Specimen

Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkanker cellen van vaste klinische monsters. Eierstokkanker klinische monsters worden onderworpen aan enzymatische vertering om levensvatbare, fibroblast gratis ovariumcarcinoom (EOC) cellen zeer geschikt voor verdere toepassingen te verkrijgen.

Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

Deze studie presenteert een gestandaardiseerde en gevalideerde methode voor de isolatie en kweek van primaire muis endometriale stroma- en epitheelcellen, die kan worden gebruikt in een cocultuursysteem om in vitro decidualisatie te bestuderen.

Isolatie van Mouse Endometrial epitheliale en stromale cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualisatie

Deze studie geeft een gevalideerde en geoptimaliseerde procedure voor de isolatie en de cultuur van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen uit te voeren in vitro decidualization assay. Verder biedt deze studie een gedetailleerde methode om efficiënt vechtpartij een specifiek gen siRNAs, waarbij in menselijk baarmoederslijmvlies stromale cellen.

Isolatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen voor In Vitro Decidualization

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Dit protocol demonstreert een betrouwbare en effectieve techniek om primaire fibroblasten te isoleren uit premenopauzaal of postmenopauzaal menselijk vaginaal weefsel. Bestaande protocollen voor vaginale fibroblastisolatie houden geen rekening met de uitdagingen van celisolatie uit senescent weefsel. Vaginaal weefsel werd verkregen van vrouwen na een operatie voor bekkenorgaanverzakking.

Weefselverwerking en isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina

Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.

Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Leer twee methoden om primaire humane endometriale stromale cellen te isoleren uit hysterectomie-exemplaren. Deze technieken gebruiken mechanische schraping of trypsine-vertering voor betrouwbare celkweek.

Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Meer video's verkennen