Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Het algemene doel van deze procedure is om primaire endometriumstromacellenculturen op te zetten uit gereseciteerde hysterectomieën. Dit wordt bereikt door eerst de baarmoederslagen te onderscheiden en te scheiden om een sectie van endometriumweefsel te isoleren. De tweede stap is het kiezen van een celisolatietechniek tussen de schraap- en trypsinemethoden bij gebruik van de schraapmethode.

Mechanieke kracht en schrapen worden gebruikt om endometriumstromacellen te scheiden en te dissociëren. Alternatief, bij gebruik van de trypsinemethode, wordt de enzymatische activiteit van trypsine gebruikt om endometriumstromacellen te scheiden en te dissociëren. Uiteindelijk wordt microscopie gebruikt om celgroei en -morfologie te observeren, terwijl andere in het manuscript besproken technieken worden gebruikt om endometriumstromacellencultures te verifiëren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke fysiologievragen in het reproductieve veld, zoals fenomenen als de voortplantingscyclus en menstruatie. Hysterectomiespecimens gebruikt in dit manuscript werden verzameld in overeenstemming met een universitair IRB-goedgekeurd ethisch protocol genummerd I-R-B-H-S-R nummer 1 4 4 2 4. Bewaar weefsel afkomstig van patiënten in een 50 milliliter buis met RPMI of DMEM met hoge glucose bij vier graden Celsius gedurende maximaal 24 uur voordat het monster wordt verwerkt. Wanneer u klaar bent om te beginnen, was het weefselmonster drie keer met een XPBS en gooi de oplossing weg tussen elke wasbeurt.

Voeg vervolgens vier tot 10 milliliter groeimedia toe, aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline-streptomycine, aan het weefselmonster. Voeg ook een schimmelzone toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 microgram per milliliter en incubeer gedurende 30 minuten. Gooi vervolgens het groeimedia weg en was het weefsel twee keer met een XPBS.

Plaats het weefsel op een zes centimeter celcultuurplaat en identificeer de endometriumlaag met behulp van deze afbeeldingen als gids. Scheid vervolgens het endometrium en bewaar de andere weefsellagen voor toekomstig gebruik. Gebruik een scalpel of scheermes om het weefsel in kleine stukken te snijden terwijl u op de celcultuurschotel krast.

De krassen vergemakkelijken de hechting van de opkomende primaire endometriumstromacellen. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter groeimedia toe aan de gekraste schotel. In dit stadium zullen weefselfragmenten zichtbaar en geïmmobiliseerd zijn door de krasbeweging.

Plaats de schotel in een aangewezen celcultuurincubator, gescheiden van andere cellijnen om besmetting te voorkomen. Bewaak de cellen dagelijks met behulp van een lichtmicroscoop. Zoek naar kleine populaties cellen die vanaf de tweede of derde dag om de drie dagen uit het gesneden weefsel opduiken.

Verwijder voorzichtig het oude media en was de culturen met een XPBS en voeg vervolgens twee milliliter vers groeimedia toe. Begin met het toevoegen van vier milliliter groeimedia. Zodra de proliferatiesnelheid tijdens de wasstappen toeneemt, zuigt u de resterende weefselstukken af.

Nieuwe kolonies zullen waarschijnlijk niet uit het weefsel opduiken. Na een week groei passage, gebruik 0,05%trypsine voor het passeren van de cellen. Wanneer de cellen tussen 75 en 80%confluency bereiken, bevriest u één plaat met cellen.

Zodra twee of drie platen worden onderhouden, kunnen primaire cellen niet oneindig worden gepasseerd. Om tripsine-gemedieerde isolatie te beginnen, plaatst u een klein stukje endometriumweefsel in een kegelbuis met twee milliliter 0,25%Trypsine aangevuld met 0,03 milligram per milliliter. Kan mycine en vervolgens incubeer het weefsel op een roterend platform bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Vortex vervolgens kort het weefsel en centrifugeer vervolgens 200 tot 400 keer G gedurende twee minuten, gooi de supernatant weg en voeg vers trypsine toe. En kan mycine en incubeer het weefsel vervolgens gedurende een uur bij 37 graden Celsius met roteren. Na de incubatie, vortex het weefsel gedurende vijf tot tien seconden.

Voeg vervolgens twee milliliter groeimedia toe met 10%FBS en 1%penicilline-streptomycine. Om het trypsine te deactiveren, centrifugeert u de cellen 200 tot 400 keer G gedurende twee tot drie minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en resuspendeer het cellenpellet.

Plaats de celsuspensie in twee milliliter groeimedia op een zes centimeter celcultuurschotel en schraap de schotel om de hechting van de primaire cellen te verbeteren. Bewaak de celgroei dagelijks met een lichtmicroscoop en ververs het groeimedia om de twee tot drie dagen. Zodra de cellen een confluency van 75 tot 80% hebben bereikt, gebruikt u 0,05% of 0,25%trypsine om ze te passeren en endometriumstromacellen te isoleren.

Het gebruik van de schraapmethode genereert clusters van vroeg opkomende cellen. Langs de door scalpel geïnduceerde krassen kunnen de endometriumstromacellen worden geïdentificeerd door hun fibroblastmorfologie. De trypsinemethode heeft een langere voorbereidingstijd dan de schraapmethode, maar er worden eerder levensvatbare cellen waargenomen.

De trypsinemethode genereert ook cellen met zowel geclusterde als verspreide groeipatronen. Er is nog geen weefselspecifieke marker voor endometriumstromacellen ontdekt. Een manier waarop endometriumstromacellen worden geïdentificeerd, is door het verlies van een marker te meten.

Voor epitheelcellen zoals cytokeratine. Gebrek aan cytokeratine toont een afwezigheid van endometriumepitheelcellen aan. Het verlies van cytokeratinekleuring waargenomen in passage vijf in vergelijking met passage twee, bevestigt de afwezigheid van epitheelcellen.

Functioneel bewijs voor de aanwezigheid van endometriumstromacellen kan worden geleverd door middel van een decellularisatie-assay. De toename van prolactine en insuline-achtig groeifactor-bindingseiwit één als reactie op behandeling met CAMP en hydroxyprogesteronacetaat geeft een succesvolle vestiging van een endometriumstromacultuur aan. Na het bekijken van deze video,