Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om functioneel activerende liganden van orfaan G-eiwit-gekoppelde receptoren of G-PCR's te identificeren. Dit wordt bereikt door tijdelijk een A-G-P-C-R van belang en een promiscue G alpha 16-constructie over te dragen in een cellulair expressiesysteem om tijdelijke heterologe expressie van beide eiwitten te verkrijgen. Als tweede stap worden de getransfecteerde cellen geladen met de calciumgevoelige kleurstof flu oh four, die de afgifte van calcium uit intracellulaire opslag detecteert door een toename van het fluorescente signaal bij calciuminteractie.

Vervolgens wordt de op fluorescentie gebaseerde calciummobilisatietest uitgevoerd door de heteroloog uitgedrukte receptor uit te dagen met een bibliotheek van kandidaat-liganden om verbindingen te bepalen die de receptor activeren en een intracellulaire signaalcascade veroorzaken die resulteert in de afgifte van calcium uit het endoplasmatisch reticulum, die kan worden gemeten als een fluorescerend signaal. Er worden resultaten verkregen die een concentratieresponscurve tonen met de halfmaximale effectieve concentratie van een activerende ligand, die is gebaseerd op de detectie van verschillende fluorescerende signalen afhankelijk van de toegediende ligandconcentraties aan het cellulaire expressiesysteem. Het belangrijkste voordeel van het uitvoeren van een tijdelijke overdracht om tijdelijke expressie van uw GPCR te verkrijgen, in plaats van gebruik te maken van stabiele clonale cellijnen, is dat het geen tijdrovende oprichting van dergelijke stabiel getransfecteerde cellijnen vereist.

Transfectie van de promiscue G alpha 16-subeenheid kan de intracellulaire signaalroute van de meeste GPCR's omleiden naar de afgifte van calcium, ongeacht de native signaalroute in endogene omgevingen. Als zodanig staat deze opstelling medium doorvoerscherming van honderden verbindingen op GPCR's van belang toe in een korte tijdsspanne, wat aantoont dat de procedure geel gas zal zijn, een promovendus en Nick Su, een technicus van ons laboratorium Groei de HEK 2 93 T-cellen drie dagen voordat de daadwerkelijke calciummobilisatietest plaatsvindt in T 75-kolven, passageer de cellen wanneer een confluëntie van 80% is bereikt. Bereid een T 75-fles voor voor transfectie met het receptorconstruct en een voor transfectie met een lege expressievector als negatieve controle.

Incubeer de flessen gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%CO2-incubator tot de celculturen 50 tot 70% confluëntie benaderen, zoals hier getoond. Voeg vervolgens 3,9 microgram van het receptorconstruct of lege vector en 3,9 microgram van het G alpha 16-expressieconstruct toe aan een micro centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. Voeg 500 microliters van de jet prime-buffer toe.

Meng goed door de buis te vortexen, gevolgd door een korte spin. Voeg vervolgens 37,5 microliter van het jet prime-reagens toe, vortex en spin een minuut bij maximale snelheid. Incubeer het transfectiemengsel gedurende 10 minuten.

Bij kamertemperatuur label je één populatie cellen als getransfecteerd met de expressievector, die codeert voor de GPCR van belang en de G alpha 16-constructie en de tweede fles met de lege vector en de G alpha 16-constructie. Na incubatie voeg je het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan het celkweekmedium, zorg ervoor dat je direct in het medium pipetteert en vermijd contact met de wanden van de kweekfles. Incubeer de flessen gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%CO2-incubator voor de calciummobilisatietest.

De getransfecteerde cellen worden verzameld en gezaaid in 96-wel platen met zwarte wanden en een heldere bodem. Bekleed eerst de platen met 60 microliter per putje van kamertemperatuur.

Fosfaat gebufferde zoutoplossing met fibronectine. Laat de platen een uur bij kamertemperatuur incuberen met het deksel erop. Verwijder de oplossing uit de putjes en incubeer de platen opnieuw gedurende een uur zonder het deksel bij kamertemperatuur.

Ondertussen verwijder je het oude groeimedium van de cellen. Spoel dode cellen af met drie milliliter PBS en verwijder de PBS. Voeg vervolgens drie milliliter PBS van kamertemperatuur toe en incubeer voor een minuut met EDTA in de trypsine voordat je de oplossing verwijdert.

Op dit punt verandert de morfologie van de cellen van stervormig naar bolvormig. Maak de cellen los van de bodem van de fles door voorzichtig te tikken en verzamel ze door meerdere keren te spoelen met 10 milliliter van kamertemperatuur. DM em transfer medium.

Breng de cellen over in een falconbuis van 50 milliliter. Om het aantal cellen per milliliter te tellen, voeg je 100 microliter van de celkweek toe aan een micro centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 100 microliter lysisbuffer toe en meng door de buis te tikken.

Voeg tenslotte 100 microliter stabiliserende buffer toe en meng door de buis te tikken. Vul een nucleo cassette met de celsuspensie en tel de cellen met de teller. De nucleo view-software vermenigvuldigt automatisch het aantal cellen met drie, omdat de cellen met een factor drie zijn verdund.

Bij het toevoegen van de lysis- en stabiliserende buffer, verdun je de cellen tot een eindconcentratie van 600.000 cellen per milliliter en zaai je 150 microliter van de cellen per putje in de beklede platen. Om een celdichtheid van ongeveer 90.000 cellen per putje te verkrijgen, vermijd luchtbellen en tik op de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen. Om een samenhangende cel laag te krijgen, incubeer je de platen gedurende 16 tot 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%CO2-incubator.

Gooi het medium van de cellen weg. Was de cellen met 200 microliter PBS per putje en verwijder de PBS. Merk op dat alle volgende stappen die operaties met de cellen omvatten, in het donker moeten worden uitgevoerd, omdat vanaf dit punt de cellen zullen worden geladen met de fluro four.

Voeg 55 microliter laadbuffer per putje toe, wikkel de plaat in aluminiumfolie om blootstelling van de plaat aan licht te voorkomen en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens wasbuffer om de gedroogde peptiden op te loss