Name: Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer het elektrospinproces om groeifactoren vrijzettende PLGA-microsferen in hyaluronzuurvezels te verwerken voor zenuwherstel. Deze methode ondersteunt gerichte neurietgroei met Dorsal Root Ganglia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Richard Barber Foundation en een Thomas Rumble Fellowship (TJW).

1 Water / Olie / Water Dubbele Emulsion Microsfeer Productie <ol><li> Maak eerst 2% en 0,5% w / v oplossing van polyvinylalcohol (PVA) in gedeïoniseerd water. Roer de oplossing bij 50 ° C totdat een heldere, kan enkele uren duren. Bereid een oplossing van 2% v / v isopropylalcohol in gedeïoniseerd water. </li><li> Bereid een waterige oplossing van hydrofiele gewenste eiwit. De onderstaande tabel geeft bijvoorbeeld formuleringen. </li></ol><img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tabel 1:. Voorbeeld Eiwit Oplossingen De volgende eiwit oplossingen zijn succesvol ingekapseld en elektrogesponnen gebruik van dit protocol. Andere hydrofiele eiwitoplossingen kunnen naar behoefte worden gebruikt. <ol start="3"><li> Plaats 40 ml van de 0,5% PVA oplossing in een centrifugebuis van 50 ml en zet apart. </li><li> In een 15 ml centrifugebuis los 300 mg 65:35poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) in 3 ml dichloormethaan. Een vortex mixer kan worden gebruikt PLGA oplossen versnellen. </li><li> Combineer 200 pi eiwitoplossing en 4 ui van 2% PVA oplossing. Giet het eiwitmengsel in de PLGA-oplossing (stap 1.4). De oplossingen zullen veelal gescheiden blijven. </li><li> Plaats de buis in een bekerglas van ijswater. Met een wand sonicator bij ~ 10 watt (RMS), schud de oplossing gedurende enkele seconden (5-10) totdat een uniform romig witte emulsie ontstaat. </li><li> Giet de emulsie in de 50 ml buis met 0,5% PVA (stap 1.3). Meng de oplossing bij hoge snelheid op een vortex mixer ~ 20 sec. De oplossing zal een troebele schijn ontwikkelen. </li><li> Breng de emulsie in een bekerglas en plaats 200 ml op een roer plaat bij 350 rpm gedurende 2 minuten. Voeg 50 ml van 2% isopropylalcohol aan de beker van de roerplaat. Laat het mengsel verder geroerd minimaal 1 uur om de DCM te verdampen en de PLGA uitharden. </li><li> Transfer tHij microbolletje oplossing in centrifugebuizen. </li><li> Centrifugeer bij 425 xg gedurende 3 minuten. De microsferen verzamelt op de bodem van de buis en wit worden weergegeven. Verwijder de supernatant van de buis boven de microsferen en bewaar in een fles van 500 ml. </li><li> Spoel de microsferen met gedeïoniseerd water door het vullen van de buis driekwart vol en schudden om de microsferen opnieuw te verdelen in de vloeistof. </li><li> Herhaal de stappen 1.10 &amp; 1.11 vier keer. </li><li> Na de laatste spoeling, verwijder het supernatans opnieuw en plaats in de fles van 500 ml met de andere monsters. Bevries de in de centrifugebuis verzameld microbolletjes vervolgens lyofiliseren ten minste 24 uur. </li><li> Zichtbaar de microsferen onder een lichtmicroscoop of een Scanning Electron Microscope. Microsferen niet groter dan 60 micrometer zijn voor een effectieve elektrospinproces. Als microbolletjes te groot zijn, kan het langer sonicatie of vortexen keer in stap 1.6 of 1.7 vereist. </li> &lt;li&gt; Bewaar de gedroogde microbolletjes in een -20 ° C vriezer. </li><li> Optioneel: Gebruik een eiwit assay, instructies van de fabrikant, om de hoeveelheid eiwit te testen in de fles 500 ml van stap 1.10 30. Dit wordt gebruikt om het percentage te berekenen eiwit ingekapseld in de microsferen, door het aftrekken van de hoeveelheid in de oplossing van wat werd gebruikt in het productieproces. </li></ol> Opmerking: visualiseren eiwit locatie in het microbolletje commentaar Rhodamine 2 ug / ml aan de PLGA oplossing 31 en kapselen een FITC geconjugeerd eiwit Figuur 1 toont een voorbeeld.. 2 Electrospinning met microsferen <ol><li> Alvorens met electrospinning oplossing maakt een 0,5% w / v oplossing van initiator, in gedeïoniseerd water door het oplossen bij 37 ° C. Dit proces kan enkele uren duren. </li><li> Een 2% w / v gemethacryleerd hyaluronzuur (meha) (zie Burdick et al. Synthese) 29, 3%w / v 900 kD poly (ethyleenoxide) (PEO) en 0,05% w / v photo initiator opgelost in gedeïoniseerd water. <ol><li> Bereken de juiste hoeveelheid meha en PEO voor het gewenste volume. Bijvoorbeeld, 10 ml electrospinning oplossing vereist 200 mg meha en 300 mg PEO. </li><li> Los het PEO in gedeïoniseerd water bij 90% van de uiteindelijke gewenste volume (9 ml voor dit voorbeeld). Dit kan enkele uren duren, kan een verhitte roerplaat of waterbad bij 37 ° C worden gebruikt om het proces te versnellen. </li><li> Voeg vervolgens de meha en gebruik een vortex mixer aan de oplossing totdat duidelijk roeren. Dit duurt slechts een paar minuten. </li><li> Voeg tenslotte de 0,5% fotoinitiator oplossing voor de resterende 10% volume (1 ml voor dit voorbeeld) te vullen. </li></ol></li><li> Voeg microsferen in de gewenste concentratie tot 400 mg / ml. Meng de oplossing op een vortex mixer totdat de microsferen gelijkmatig verdeeld in de oplossing. </li><li> Breng de oplossing aan een injectiespuit en bevestig een 6 inch 18 gauge blunt tip naald. </li><li> Plaats de spuit in een injectiepomp en zet deze af te zien van 1,2 ml / uur. </li><li> Tape een laagje aluminiumfolie op de collectie plaat of doorn. Dit zorgt voor een gemakkelijke schone up en opslag van de afgewerkte steiger. Een roterende doorn wordt gebruikt om uitgelijnd vezels geven. Een vlakke plaat of stationaire doorn resulteert in willekeurig gerangschikt vezels. </li><li> Sluit de aardedraad van een hoge spanning stroombron om de collectie apparaat. Sluit de positieve draad aan de naald. </li><li> Stel de spuitpomp en verzameling oppervlak zodat er 15 cm tussen de naaldpunt en verzameloppervlak. </li><li> Start de polymeer pompen, wanneer de oplossing zichtbaar aan het einde van de injectiespuit, zet de spanningsbron en zet de spanning 24 kV Let. Wanneer de spanning is ingeschakeld kan een metalen deel van het systeem aanraken. Heffing kan ook springen korte afstanden van geëlektrificeerde onderdelen voor de huid. </li><li> Voer de oplossing tot desired steiger dikte is bereikt. Als het klaar is uit te schakelen spanningsbron en injectiepomp. </li><li> Verwijder folie met steiger bevestigd. Afgesloten steigers eiwithoudende opgeslagen in een -20 ° C vriezer. </li></ol> 3 Protein Bioactiviteit Testing <ol><li> Bereid celcultuurmedia. Voeg 10% v / v foetaal runderserum, 1% v / v L-glutamine en 1% v / v penicilline-streptomycine aan Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium. </li><li> Selecteer dekglaasjes die volledig passen in een put plaat. </li><li> Gebruik 3 (Trimethoxysilyl) propyl methacrylaat de dekglaasjes behandelen als beschreven door de fabrikant. Methacrylation verbetert steiger vasthouden aan de dekglaasjes. </li><li> Bevestig gemethacryleerde dekglaasjes om het verzamelgebied van de electrospinner met verwijderbare dubbelzijdige tape voordat electospinning. Spinning op de dekglaasjes vergemakkelijkt bediening en weergave. </li><li> Electrospin gewenste dikte als boven beschreven. </li><li> Eenfter Electrospinning zorgvuldig dekglaasjes verwijderen uit doorn. Plaats de steiger gecoate dekglaasjes in een heldere stikstof kamer en ervoor zorgen dat alle zuurstof wordt gespoeld. </li><li> Plaats de kamer en steiger onder een 10 mW / cm 2 365 nm licht gedurende 15 minuten. Na verknoping plaats in geschikt formaat putjesplaat. Zorg ervoor dat de steiger kant naar boven is gericht. </li><li> Plaats scaffolds onder een kiemdodende lamp gedurende 30 min te steriliseren. Desgewenst fibronectine of andere eiwit wordt gebruikt als een bekleding op celhechting te verbeteren. Volg de instructies van de fabrikant om de vacht van steigers. </li><li> Oogst van de ganglia (DRG) zoals eerder beschreven door Hollenbeck 32. Een DRG zal nodig zijn voor elke steiger overdekte dekglaasje getest. </li><li> Plaats 100-200 ul van media op elke steiger in de wells plaat. Plaats een DRG voorzichtig op elke steiger in de media druppel. Voor dikke steiger meer media nodig zijn; DRG moeten volledig worden ondergedompeld en niet Floating. </li><li> Incubeer de steiger en DRG bij 37 ° C gedurende 4 uur om de cel te houden aan de steiger. </li><li> Vul de media op het juiste niveau voor het goed en plaats terug in de incubator. Verder incuberen gedurende 4-6 dagen. </li><li> Na de incubatieperiode zorgvuldig de media uit elke te verwijderen goed en voorzichtig een keer wassen met PBS. Fix cellen gedurende 30 min onder toepassing van 4% w / v paraformaldehyde. </li><li> Stain cellen met een antilichaam kleuring voor neurofilament. Hierdoor kunnen visualiseren van neurietuitgroei voor kwantificering. DAPI kan ook worden gebruikt om kernen van de cellen zien. Een voorbeeld kleuring protocol beschreven door Sundararaghavan en collega 14. </li><li> Zichtbaar de cellen met een fluorescentiemicroscoop. <ol><li> Plaats wells plaat op het podium van de microscoop. </li><li> Zoek de cel massa met behulp van de filter en de excitatie-instellingen voor DAPI. </li><li> Zodra de cel schakelt het filter FITC de uitgebreide neurieten visualiseren. Uzing de steek functie op de microscoop verzamelen en combineren veel afbeeldingen als nodig om de gehele structuur te bekijken. Herhaal dit voor DAPI, FITC en heldere veld. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vele studies hebben aangetoond dat de zenuwcellen kunnen worden geregisseerd door topografische cues (fiber alignment) en chemische signalen (groeifactoren) 1,2,10,11,35. Electrospinning is een gemakkelijke methode om uitgelijnde vezels geven. Groeifactoren stimuleren zenuwgroei maar om ze op te nemen in zenuw leidingen (NC), is een werkwijze voor aanhoudende afgifte vereist. Om een ​​meer robuust systeem met beide signalen maken, moeten deze twee signalen worden gecombineerd. Verscheidene werkwijzen zijn eer...

Een van de voortdurende uitdagingen in zenuwweefsel techniek is het creëren van een zenuwleiding (NC) die de extra cellulaire matrix, waar zenuwen groeien natuurlijk nabootst. Onderzoek heeft aangetoond dat de cellen reageren op verschillende factoren in hun omgeving met inbegrip van mechanische, topografische, lijm en chemische signalen 1-3. Een van de belangrijkste uitdagingen op dit gebied bepalen van de juiste combinatie van signalen en het vervaardigen van een systeem dat signalen kan handhaven voor een langere periode celgroei 4 ondersteunen. Perifere neuronen is bekend dat ze een zachte ondergrond de voorkeur geven, worden geregisseerd door uitgelijnde vezels, en reageren op zenuw groeifactor (NGF) 5-7. NC chemische signalen kan voorzien weken bleken verbeterde functioneel herstel dichter bij die van allografts, de huidige gouden standaard voor zenuwreparatie 8,9 verschaffen. Diverse materialen en productiemethoden worden gebruikt mechanische en topografische producerenal keuen 10-13. Mechanische signalen zijn inherent aan het gekozen materiaal, waardoor selectie van de geschikte materiaal voor de toepassing kritische 1,13. Productiemethoden te controleren topografische aanwijzingen bevatten fasescheiding, zelf-assemblage en electospinning 1,13. Voor microschaal toepassingen, microfluidics, photopatterning, etsen, zout bloedzuigers, of gas schuim kan ook worden gebruikt 14-17. Elektrospinproces heeft ontpopt als de meest populaire manier om vezelig substraten voor weefselkweek ingenieur vanwege de flexibiliteit en het gemak van de productie 13,18-23. Elektrogesponnen nanovezels zijn gefabriceerd door het toepassen van een hoge spanning naar een polymeer oplossing waardoor het zich af te weren en zich over een korte afstand te ontladen 24. Een uitgelijnde steiger kan worden gecreëerd door het verzamelen van de vezels op een geaard roterende doorn en nonaligned steigers worden verzameld op een stationaire plaat 25. Adhesie signalering kan worden bereikt door het bekleden van de vezelige scaffold with fibronectine of conjugeren een adhesie peptide, zoals RGD, de HA vóór elektrospinning 26. Chemische signalen zoals groeifactoren, dit zijn de moeilijk te handhaven gedurende langere perioden aangezien zij een bron voor gecontroleerde vrijgave nodig. Veel systemen zijn geprobeerd om gecontroleerde afgifte toe te voegen aan elektrogesponnen vezelig netwerken met wisselend succes. Deze methoden omvatten mix elektrospinnen, emulsie elektrospinnen, core-shell elektrospinproces en eiwitconjugatie 27. Bovendien wordt electrospinning traditioneel gedaan in een vluchtig oplosmiddel, waarbij de levensvatbaarheid van het eiwit 28 kan beïnvloeden, handhaaft derhalve bioactiviteit van het eiwit worden onderzocht. Deze aanpak specifiek over de combinatie van mechanische, topografische, chemische en lijm signalen naar een afstembare steiger voor perifere zenuw groei te creëren. Steiger monteurs wordt nauwkeurig gecontroleerd door het synthetiserengemethacryleerde Hyaluronzuur (HA). De methacrylation sites worden gebruikt om foto reactieve verknopers hechten. Het verknoopte materiaal niet meer water oplosbare en uitsluitend afgebroken door enzymen 29. De hoeveelheid verknoping verandert de afbraaksnelheid, mechanica en andere fysische eigenschappen van het materiaal. Met HA met 30% methacrylation, die een trekmodulus van -500 Pa heeft, is zacht substraat dat vlakbij de natieve mechanica van neuraal weefsel en kenmerkend voorkeur van neuronen 26,29. Elektrospinnen op een roterende doorn wordt gebruikt om uitgelijnde vezels te creëren voor een topografische cue. Met behulp elektrospinproces samen met microsferen biedt chemische signalen binnen het schavot gedurende langere perioden. Om neuriet groei microsferen bevattende NGF worden gebruikt om de chemische afgeven ondersteunen. Unlike meeste electrospun materialen HA oplosbaar in water zodat het NGF geen agressieve oplosmiddelen tegenkomt tijdens de productie. Om een ​​lijm signaal toe te voegen, de scaffold bekleed met fibronectine. Het ingevulde systeem bevat alle vier de soorten signalen zoals hierboven beschreven: zacht (mechanische) uitgelijnd (topografische) glasvezels met een NGF vrijgeven microsferen (chemische) gecoat met fibronectine (lijm). Productie en het testen van dit systeem wordt beschreven in dit protocol. Het proces begint met de productie van de microsferen met een water-in-olie-in-water dubbele emulsie. De emulsie wordt gestabiliseerd met een surfactant, polyvinylalcohol (PVA). De binnenste waterfase bevat het eiwit. Als het wordt toegevoegd aan de oliefase, die de PLGA schaalmateriaal opgelost in dichloormethaan (DCM), de surfactant creëert een barrière tussen de fasen beschermen het eiwit uit de DCM. Deze emulsie wordt dan gedispergeerd in een waterfase bevattende PVA aan het buitenoppervlak van de microsferen te creëren. De stabiele emulsie wordt geroerd om het DCM verdampen. Na het spoelen en vriesdrogen van u blijven zitten met de droge microbolletjes containing het eiwit. Nadat de microsferen zijn voltooid zijn ze klaar om te worden electrospun in steigers. Eerst moet je de elektrospinnen oplossing te bereiden. De viscositeit van de oplossing tiekritische vezelvorming. Oplossingen van pure HA niet voldoen aan deze eis; PEO wordt toegevoegd als drager polymeer om voor electrospinning. De microsferen worden toegevoegd aan de oplossing en electrospun resulteert in een vezelachtige steiger met microsferen overal verspreid. Zodra de productie voltooid is, moet het eiwit worden getest om de levensvatbaarheid verifiëren. Om dit te doen, kan een primaire cel die reageert op NGF worden gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van de ganglia (DRG) 8-10 dagen oude kippenembryo&#39;s. De cel bundels worden gezaaid op steigers microsferen gevuld met NGF of als ze leeg zijn. Als NGF nog steeds levensvatbaar zou u verbeterde neuriet groei bij de NGF bevattende scaffolds bekijken. Als NGF niet langer levensvatbaar zal hetniet neurites te breiden bevorderen en moeten vergelijkbaar zijn met de controle verschijnen. De hierin beschreven exacte procedure is gericht op neurale steun echter met eenvoudige wijzigingen van het materiaal, electrospinning methode en eiwitten het systeem kan worden geoptimaliseerd voor verschillende types cellen en weefsels.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Maak stockoplossing in DMSO</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Moet worden bevestigd aan een op maat gemaakte draaibank</td></tr><tr><td>Toerenteller</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>Gebruik om de snelheid van de draaibank te controleren</td></tr><tr><td>Omnicure UV Spot Cure System met collimaterende adapter</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Naalden</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Proteïne Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrospinproces growth factor releasing microsferen in stapel- steigers

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Deze procedure beschrijft een methode om een veelzijdig substraat te fabriceren om zenuwcelgroei te sturen. Dit systeem bevat mechanische, topografische, adhesieve en chemische signalen. Mechanische eigenschappen worden gecontroleerd door het type materiaal dat wordt gebruikt om de elektrogesponnen vezels te fabriceren. In dit protocol gebruiken we 30% gemethacryleerde hyaluronzuur (HA), dat een trekmodulus van ~500 Pa heeft, om een zacht vezelig schaaltje te produceren. Elektrospinnen op een roterende as produceert uitgelijnde vezels om een topografisch signaal te creëren. Adhesie wordt bereikt door het schaaltje te coaten met fibronectine. De belangrijkste uitdaging die hierin wordt aangepakt, is het leveren van een chemisch signaal gedurende de diepte van het schaaltje voor langere perioden. Deze procedure beschrijft het fabriceren van poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen die Zenuwgroeifactor (NGF) bevatten en het direct impregneren van het schaaltje met deze microsferen tijdens het elektrospinproces. Vanwege de ruwe productieomgeving, inclusief hoge schuifkrachten en elektrische ladingen, wordt de eiwitlevensvatbaarheid na de productie gemeten. Het systeem biedt eiwitafgifte gedurende meer dan 60 dagen en is aangetoond als bevorderlijk voor primaire zenuwcelgroei.

Microsferen 50 ± 14 micrometer in diameter met een meer dan 85% eiwit inkapseling zijn consistent geproduceerd en elektrogesponnen in steigers. Grootte werd bepaald door beeldvorming monsters van microsferen uit drie afzonderlijke productie batches. De beelden waarin vastgelegd op een optische microscoop en lengten wanneer gemeten met commerciële software lab. Figuur 1 toont een histogram van de grootteverdeling. Encapsulation percentage werd ook getest drie verschillende microsfeer opbrengsten, door he...

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een veelzijdige omgeving om zenuwgroei en -herstel te ondersteunen. Dit wordt bereikt door eerst groeifactoren in afbreekbare microsferen te inkapselen. De tweede stap is het voorbereiden van het steunmateriaal voor het grootste deel van de omgeving.Vervolgens worden de microsferen en het steunmateriaal gecombineerd en via electrospinning verwerkt tot een uitgelijnde vezelige scaffold. De laatste stap is het testen van de scaffold met neuronen uit de dorsale wortelganglia van kuikens. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om aan te tonen dat de neurietgroei en de groeirichting versneld zijn in vergelijking met de controles.Hoewel dit systeem is ontworpen voor neuraal weefsel, kan het met kleine aanpassingen in de gebruikte proteïnen en materialen ook worden toegepast op diverse weefseltypen, waaronder harten, longen en botten. Bereid vóór aanvang van deze procedure de benodigde reagentia voor: 2% en 0,5% gewicht/volumeprocent oplossingen van polyvinylalcohol of PVA in gedeïoniseerd water, een 2% volume/volumeprocent oplossing van isopropylalcohol en gedeïoniseerd water, en een waterige oplossing van de gewenste hydrofiele proteïne. Plaats 40 milliliter van de 0,5% PVA-oplossing in een centrifugebuis van 50 milliliter en los in een klein vial 300 milligram 65:35 polylactide-co-glycolidezuur of PLGA op in drie milliliter dichloormethaan.Een vortexmixer kan worden gebruikt om de oplossing van PLGA te versnellen in combinatie met 200 µL eiwitoplossing en vier µL 2% PVA-oplossing. Giet het eiwit-PVA-mengsel in de PLGA-oplossing. De oplossingen zullen grotendeels gescheiden blijven.Plaats het flacon in een bekerglas met ijswater en gebruik een W ator op ongeveer 10 watt; agiteer de oplossing gedurende vijf tot 10 seconden totdat er een uniforme, roomwitte emulsie is ontstaan. Giet de emulsie in de eerder voorbereide 50 milliliter buis met 0,5% PVA. Meng de oplossing op hoge snelheid in een vortexmixer gedurende ongeveer 20 seconden.De oplossing zal een troebele aanblik krijgen. Breng de emulsie over naar een bekerglas van 200 milliliter en plaats dit gedurende twee minuten op een roerplaat bij 350 RPM. Voeg 50 milliliter 2% isopropylalcohol toe aan het bekerglas op de roerplaat.Laat het mengsel nog minimaal een uur roeren zodat het chloormethaan kan verdampen en het PLGA kan uitharden. Breng vervolgens de microsfeeroplossing over in centrifugebuisjes en centrifugeer deze 3 minuten bij 425 ×g. De microsferen zullen zich onderin de buis verzamelen en wit van kleur zijn. Verwijder voorzichtig het supernatant boven de microsferen uit de buis en bewaar dit in een fles van 500 ml.Spoel de microsferen met gedeïoniseerd water door elke buis tot driekwart te vullen en te schudden om de microsferen in de vloeistof te herverdelen. Herhaal de centrifugatie, het verwijderen van het supernatant en het spoelen van de microsferen met gedeïoniseerd water vier keer na de laatste spoelbeurt. Verwijder het supernatant en plaats dit in de fles van 500 milliliter bij de overige monsters.Bevries de in de centrifugebuisjes verzamelde microsferen gedurende één nacht bij -20 °C en lyofiliseer deze vervolgens gedurende ten minste 24 uur. De volgende elektrospinning-oplossing dient vooraf te worden bereid in gedeïoniseerd water: methacryleerd hyaluronzuur (MiHA) met een concentratie van 2% w/v, polyethyleenoxide (PEO) van 900 kDa met een concentratie van 3% w/v en een foto-initiator-oplossing met een concentratie van 0,05% w/v.Nadat het gewenste volume electrospinning-oplossing is bereid, worden microsferen in de gewenste concentratie tot maximaal 400 mg/ml toegevoegd. Meng de oplossing met een vortexmixer totdat de microsferen gelijkmatig over de oplossing zijn verdeeld. Overbreng de oplossing naar een spuit en bevestig een stompe 18 gauge naald van zes inch.Plaats de spuit in een spuitenpomp en stel deze in om 1,2 milliliters per uur te dispenseren. Plak een laag aluminiumfolie op de mandrel. Dit maakt het schoonmaken en de opslag vanHet voltooide scaffold eenvoudig.Een roterende mandrel wordt gebruikt om uitgelijnde vezels te creëren. Verbind de aarddraad van een hoogspanningsvoeding met de opvangapparatuur. Verbind de positieve draad met de naald om een succesvolle elektrospinning te garanderen.Het is zeer belangrijk om te verifiëren dat alle verbindingen en instellingen correct zijn. Start het pompen van het polymeer en zodra de oplossing aan het uiteinde van de spuit zichtbaar is, schakelt u de spanningsbron in en stelt u de spanning in op 24 kilovolts. Laat de oplossing lopen totdat de gewenste dikte van het scaffold is bereikt.Schakel de spanningsbron en de spuitpomp uit wanneer de procedure is voltooid. Bevestig ter voorbereiding op deze procedure de bijbehorende dekglasjes met verwijderbare dubbelzijdige tape aan het opvanggedeelte van de electrospinner voordat u start met het electrospinnen. Door op de dekglasjes te spinnen, wordt de hantering en observatie na het electrospinnen tot de gewenste dikte vergemakkelijkt.Zoals gedemonstreerd in het vorige videosegment, worden de dekglasjes voorzichtig van de mandrel verwijderd. Plaats de met scaffold gecoate dekglasjes in een heldere stikstofkamer en zorg ervoor dat alle zuurstof is uitgedreven. Plaats de kamer en de scaffold gedurende 15 minuten onder een 10 mW/cm² 365 nm lichtbron.Plaats na het cross-linken de dekglasjes in een welplaat van een passende grootte. Zorg ervoor dat de zijde met het scaffold naar boven is gericht. Breng voorzichtig 100 tot 200 µL medium aan op elk scaffold in de welplaat.Plaats één dorsaal wortelganglion of DRG op elk scaffold in de mediumdruppel. Voor een dik scaffold kan meer medium nodig zijn. Het DRG moet volledig ondergedompeld zijn en mag niet drijven.Incubeer het scaffold en het DRG gedurende vier uur bij 37 °C om de cellen de mogelijkheid te geven aan het scaffold te hechten. Vul vervolgens het medium aan tot het juiste niveau voor de well. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer deze gedurende vier tot zes dagen na de initiële incubatieperiode.Verwijder voorzichtig het medium uit elke put en was één keer voorzichtig met PBS. Fixeer de cellen gedurende 30 minuten met 4% gewicht per volume paraformaldehyde en kleur vervolgens de cellen voor neurofilamenten en kernen volgens een vastgesteld protocol.Om de cellen te visualiseren met een fluorescentiemicroscoop, plaatst u de wellplaat op de tafel van de microscoop en lokaliseert u de celmassa met de filter- en excitatie-instellingen voor dpi. Zodra de cel is geïdentificeerd, schakelt u het filter over naar zi. Om de verlengde neurieten te visualiseren, gebruikt u de stitch-functie op de microscoop om zoveel mogelijk beelden te verzamelen en te combineren als nodig is om de volledige structuur te zien.Herhaal dit voor dpi-, fite- en brightfield-microsferen. Met dit protocol zijn consistent microsferen geproduceerd met een diameter van 50 ± 14 µm en een proteïne-inkapseling van meer dan 85%, die vervolgens via electrospinning in scaffolds zijn verwerkt. Deze fluorescentieafbeelding toont representatieve microsferen met Rhodamine in de PLGA-schil en ingekapseld BSA-FITC.Om de inkapseling te evalueren, werden de microsferen gevuld met BSA en werd de eiwitafgifte gedurende meer dan 60 dagen getest met een Bradford-eiwitassay. De afgifte begint met een initiële burst en gaat vervolgens door naarmate de microsferen na het electrospinning afbreken. De microsferen zijn zichtbaar verspreid over de 3D-vezelstructuur.In deze SEM-afbeelding van het complete scaffold zijn de sferen in meerdere lagen te zien, aangegeven door pijlen. Deze afbeelding met hoge vergroting toont één microsfeer met de nanovezels van het scaffold erboven.Dorsal root ganglia of DRG werden gebruikt om de levensvatbaarheid van nerve growth factor of NGF in de microsferen binnen het scaffold te testen. Hier zijn DRG geplaatst op een scaffold dat microsferen bevat. De belading met NGF wordt getoond naast microsferen zonder eiwit; de langere neurietuitlopers die vanuit de DRG op het NGF-scaffold groeien, geven aan dat de NGF levensvatbaar is en groei kan bevorderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten kunt inkapselen in microsferen en deze kunt integreren in vezelachtige steigers.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Uitgelijnd electrospun vezels direct de groei van neuronen in vitro en zijn een potentieel onderdeel van de zenuw regeneratie steigers. We beschrijven een procedure voor het bereiden van electrospun vezels substraten en de serum-vrije cultuur van primaire rat E15 sensorische (DRG) en de motor neuronen. Visualisatie van de neuronen door middel van immunocytochemie is ook inbegrepen.

De cultuur van primaire motorische en sensorische neuronen in de gedefinieerde media op electrospun Poly-L-lactide Nanovezel Steigers

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.

ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën maakt de ontwikkeling van driedimensionale constructen met meerdere celtypen mogelijk. We hebben electrospinning protocollen ontwikkeld om drie individuele scaffolds te produceren om de belangrijkste structurele cellen van de luchtweg te kweken en zo een 3D in vitro model van de wand van de bronchiolen in de luchtweg te bieden.

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Dit protocol fungeert als een uitgebreide richtsnoer te fabriceren steigers via electrospinning met polymeer in een directe schrijven-modus smelt. Wij systematisch overzicht van het proces en de juiste parameterinstellingen definiëren voor het bereiken van gerichte steiger platforms.

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

Dit artikel demonstreert de techniek van het uitbreiden van een traditionele, twee-dimensie (2D) electrospun nanofiber mat in een drie-dimensie (3D) steiger door de drukverlaging subkritische CO2 vloeistof. Deze augmented steigers zijn 3D, nauw mimic cellulaire nanotopographic signalen, en het behoud van de functies van biologische moleculen ingekapseld binnen de nanofibers.

Expansie van twee-dimensie Electrospun Nanofiber matten in de steigers van de drie-dimensie

Leer het elektrospinproces om groeifactoren vrijzettende PLGA-microsferen in hyaluronzuurvezels te verwerken voor zenuwherstel. Deze methode ondersteunt gerichte neurietgroei met Dorsal Root Ganglia.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Meer video's verkennen