Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Het algemene doel van deze procedure is om interneuronen in de ontwikkelende hersenen van de muis te targeten middels in utero electroporatie. Dit wordt bereikt door eerst de injectienaalden voor te bereiden. De tweede stap is het verwijderen van het embryonale keten uit het geanestheseerde dier.

Vervolgens worden DNA-injectie en elektroporatie in de hersenen uitgevoerd. De laatste stap is het dier te laten herstellen van de operatie. Uiteindelijk wordt in utero elektroporatie gebruikt om selectieve targeting van interneuroon-subtypes mogelijk te maken.

Het voordeel van deze methoden ten opzichte van onze bestaande technieken, zoals niet-specifieke in utero elektroporatie, is dat ze de mogelijkheid bieden om celautonome analyse uit te voeren op een subset van corticale interneuronen. De hoge niveaus van GFP-expressie maken visualisatie en analyse van individuele interneuronen mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen binnen het vakgebied van de neuro-ontwikkeling, zoals de regels die de integratie van rijpend interneuronen bepalen.

Om deze procedure te starten, bereidt u de microinjectiepipet voor door een glazen capillair te trekken met een pipettrekker. Verwijder vervolgens voorzichtig de capillair en verzamel de onderste naald voor de microinjectie. Plaats nu een geanestheseerde drachtige muis met de ventrale zijde naar boven op het warmtekussen.

Bedek de snuit met een masker dat gedurende de hele operatie isofluraan blijft toedienen. Breng vervolgens ooglubricant aan in beide ogen. Stel de warmtemat in op 36 graden Celsius om hypothermie achteraf te voorkomen.

Controleer op de afwezigheid van voet- en staartreflexen door in de achterpoten of de staart te knijpen. Reinig vervolgens de huid op de buik met 70% ethanol. Gebruik een pincet om de huid omhoog te trekken.

Maak vervolgens een kleine verticale incisie van twee centimeter langs de middenlijn, beginnend halverwege tussen het derde en vierde paar melkklieren. Let erop dat de buikwand niet wordt beschadigd door gebruik te maken van ronde pincetten. Trek de embryonale keten voorzichtig weg van de holte.

Laat de keten op de natte doekjes rusten. Begin met het blootleggen van één helft van de uterus. Ga vervolgens over tot de elektroporatie van de embryo's voordat u doorgaat naar de andere helft.

Bereid bij deze procedure een DNA-oplossing door het pellet dat is verkregen uit een standaard maxi prep-purificatieprotocol op te lossen in gedestilleerd water. Voeg vervolgens fast green toe aan de DNA-oplossing in een verhouding van één op 20 om visualisatie tijdens de injectie mogelijk te maken. Snijd daarna met een fijne pincet de punt van een vooraf ingetrokken micropipet af, zodat er zes millimeter overblijft van het begin van de schouder tot het uiteinde van de punt.

Laad vervolgens de micropipet met één µL DNA-oplossing met fast green voor injectie. Houd de kop van het embryo vast met een ronde pincet. Voer de pipet onder een hoek van 45 graden in de hersenen in, gericht op de laterale ventrikel nabij de middellijn.

Als de naald door het ventrikel dringt, trek de pipet dan langzaam terug. Het ventrikel moet groen worden zodra de oplossing het begint te vullen. Stop op dit punt met het bewegen van de pipet en injecteer één microliter DNA.

Trek vervolgens voorzichtig de pipet terug. Stel de ECM eight 30 ator in op 5 45 volt pulsen van 50 milliseconden met een interpulse-interval van 950 milliseconden. Dip de vijf millimeter pedelelektroden in PBS om een efficiënte stroomoverdracht te garanderen.

Plaats vervolgens de elektrodeplaten rond de kop van het embryo, waarbij een positieve plaat op het ventrikel met de DNA-oplossing wordt geplaatst. Plaats de positieve plaat iets lager dan de negatieve plaat om een ventrale stroom door de ganglionic eminences te creëren. Dit minimaliseert ectopische expressie in parametale cellen.

Dien nu een puls toe door eenmaal op het voetpedaal te drukken, verwijder vervolgens de elektroden en veeg ze schoon. Herhaal deze stappen voor elk van de embryo's. Nadat alle embryo's zijn geëlektroporeerd.

Giet drie milliliter PBS in de buikholte en plaats de embryo's terug in de buikholte. Hecht vervolgens de buikwand met een gebogen naald en 5-0 zijden hechtdraad, en daarna de huid. Breng lidocaïne aan op de wond en dien in eerste instantie 120 milligram per kilogram aspirine toe voor analgesie.

Verwijder het dier uit de anesthesieslangen en laat het herstellen op de warmteplaat op een papieren tissue. Plaats het dier daarna terug in de kooi. Houd het dier op de warmteplaat bij 37 °C en controleer de gezondheidstoestand.

In dit experiment worden geëlektroporeerde interneuronen gedelineerd door de expressie van markers voor subtypen afgeleid van de CGE. Deze afbeelding laat zien dat de interneuronen afgeleid van de CGE zijn geëlektroporeerd met een DLX vijf zes EGFP-plasmide. Deze afbeelding toont een VIP-expresserend interneuron bij P acht.

De EGFP-expressie bakent de volledige dendritische boom en axonale arborisatie van individuele neuronen af, en hier is een NPY-uitdrukkend interneuron bij P 8. De NPY-expressie bakent neurogliaformcellen af. Tot slot is hier een NPY-uitdrukkend interneuron bij P 15.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 20 minuten worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Door het gebruik van specifieke plasmiden en genetisch gemodificeerde muislijnen te combineren, is het mogelijk om temporele en spatiale controle over de expressie van genen van belang te bereiken. In sommige experimenten gebruiken we het A-D-L-X-T-T-A-plasmide om de expressie van AU-afhankelijke transgenen te induceren.

In deze experimenten schakelen we de expressie van het transgen uit door doxycycline toe te dienen.