Name: Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Leer hoe u interneuronen in de ontwikkelende muis voorhersenen kunt targeten met in utero elektroporatie. Deze methode maakt selectieve genexpressie in interneuron-subtypen mogelijk voor neuroontwikkelingsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Lihong Yin voor technische ondersteuning. NVD is een ontvanger van een NARSAD Young Investigator Award en wordt ook ondersteund door subsidies van de NIH (5 K99 MH095825-02). Onderzoek in de Fishell lab wordt ondersteund door het National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) en de Simons Foundation.

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de NYU School of Medicine. Muizestammen Swiss Webster vrouwtjesmuizen door TACONIC werden voor deze experimenten. Om specifiek te richten oppervlaktelaag interneuronen, werden E15.5 embryo&#39;s gebruikt. Opmerking: Het plasmide gebruikt in dit werk (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 ug / ul) werd onder toepassing van standaard kloneringstechnieken. De eGFP cDNA werd gekloneerd in een Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmide. Dit plasmide is op aanvraag (demarn02@nyumc.org) beschikbaar. 1 Bereiding van Microinjection Pipetten <ol><li> Zet de trekker Heat # 2-860. </li><li> Plaats en bevestig de glazen capillair in de buurt van de gloeidraad. Controleer of de buitendiameter (OD) van de pipet is ongeveer 30 micrometer. </li><li> Druk op de &quot;pull&quot;-knop. </li><li> Verwijder de capillaire zorgvuldig. Het onderste deel is de naald. Gooi het bovenste deel. </li></ol> 2 Anesthesie Procedure <ol><li> Bereid een isofluraan bevattende kamer. Opmerking: Isofluraan de voorkeur verdoving door zijn snelle werking en lage incidentie van bijwerkingen. Pentobarbital is een andere optie; echter tolerantie van deze drug is variabel en kan leiden tot een hogere sterfte dan isofluraan. </li><li> Stel de stroom van isofluraan 4-5% in 0,5-1 L / min O2. </li><li> Zorg ervoor dat de klep van de kamer open, terwijl de klep voor het hoofd-adapter is gesloten. </li><li> Plaats de zwangere muis in de kamer. </li><li> Laat de muis te gaan onder invloed van verdoving. Dit duurt ongeveer 2-3 min duren. Controleer de ademhaling. Als de muis begint te hyperventileren, hoe lager de dosis van isofluraan. </li><li> Nadat de muis is verdoofd, direct verwijderen uit de kamer. Plaats het ventrale zijde naar boven op de verwarming pad en insert de kop masker die blijft isofluraan leveren gedurende de operatie. Zorg ervoor dat de stroom van isofluraan schakelen van de kamer naar de buis verbindt de hoofd verloopstuk. Doe een druppel oog smeermiddel in elk oog en sluit de ogen. </li><li> Zet de verwarming pad tot 36 ° C graden om onderkoeling te voorkomen. </li><li> Controleren op de afwezigheid van de voet en de staart reflexen door te knijpen de achterste poten en de staart. </li></ol> 3 Chirurgie <ol><li> Reinigt de huid die de buik met 70% ethanol. </li><li> Gebruik een tang om de huid omhoog trekt. Na elke operatie, wassen alle instrumenten met water en zeep, en gesteriliseerd bij 72 ° CO / N. </li><li> Voeg een kleine verticale incisie (ongeveer 2 cm) langs de middellijn vanaf halverwege tussen de derde en vierde paar borstklieren. Gebruik fijne operatie schaar. Zorg ervoor dat de buikwand niet beschadigen. </li><li> Voorzichtig los van de huid van het buikvlies. </li><li> Visualiseer de slagadersen aders op de buikwand. Maak nog 2 cm verticale incisie door het buikvlies (het vermijden van de schepen) naar de buikholte bloot. </li><li> Klem de huid en abdominale wand aan weerszijden vermijden vastklemmen van de slagaders. Opmerking: als de slagaders ongeluk worden doorboord, offeren het dier onmiddellijk door het uitvoeren van cervicale dislocatie of isofluraan overdosis. </li><li> Pre warm de steriele PBS tot 37 ° C. Bedek de klemmen met PBS vochtige doekjes Kim. </li><li> Bevochtig de blootgestelde buikholte met PBS. Herhaal deze stap meerdere malen tijdens het uitvoeren van de operatie. </li><li> Met behulp van ronde tang, trek de embryonale keten (E15.5) uit de buurt van de holte. Laat de ketting rust op de natte doekjes. Begin met het blootstellen van de helft van de baarmoeder eerste. Zodra het embryo erin zijn geëlektroporeerd, breng het terug binnen, dan werken aan de tweede helft. </li></ol> 4 Electroporatie <ol><li> Blijf ronde tang gebruiken om de embryo&#39;s te manipuleren. </li><li> Visualize de laterale ventrikels. De laterale ventrikels langs de middellijn (figuur 1b). </li><li> Voeg snel groen (Stock: 10% w / v) aan de DNA-oplossing voor een 01:20 mengsel visualiseren tijdens de injectie. Bereid de DNA-oplossing door oplossen van de pellet verkregen uit een standaard maxi-prep zuiveringsprotocol in gedestilleerd water. </li><li> Gebruik vooraf getrokken micropipetten met een zuiger te injecteren 1 ml van de DNA-oplossing (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) met Fast Green. Verwijder de punt van de micropipet met een fijne pincet # 5 (Dumont) tot 6 mm lengte vertrekken vanaf het begin van de schouder aan het einde van de punt van de naald voordat de pipet. Houd de kop van de embryo met ronde pincet. Voer de hersenen met de pipet in een hoek van 45 ° te streven naar de laterale ventrikel in de buurt van de middellijn. Als de naald dringt door het ventrikel, langzaam trekken de pipet als je de zuiger gebruikt om te injecteren van DNA. Het ventrikel moet groen wanneer deoplossing begint te vullen. Op dit moment stoppen met bewegen de pipet en injecteer 1 ml DNA. Zachtjes, trekken de pipet. </li><li> Stel de CUY21 electroporator vijf 45V pulsen van 50 msec gescheiden door 950 msec. </li><li> Met 5 mm peddel elektroden voor E15.5 embryo&#39;s. Dompel de elektroden in PBS om efficiënte huidige overdracht te garanderen. </li><li> Elektrode schoepen rond het hoofd van de embryo met de positieve paddle op de ventrikel die de DNA-oplossing. Iets lager de positieve peddel met betrekking tot de negatieve naar een ventrale stroom creëren door middel van het ganglion grootheden. Deze manipulatie zal ectopische expressie in piramidale cellen te minimaliseren. </li><li> Na het plaatsen van de elektroden, levert een puls door een keer op het voetpedaal. </li><li> Verwijder de elektroden en veeg ze schoon. Herhaal de stappen 4,6-4,9 met elk embryo. </li><li> Na electroporating alle embryo Giet 3 ml PBS in de buikholte en terug naar de buikholte. </li><li>Eerst hechtdraad de buikwand met een gekromde naald en 5-0 zijden hechtdraad en de huid. Solliciteer lidocaïne (4%) op de wond. Dien 120 mg / kg van Aspirine intra buikvlies voor pijnstilling. Opmerking: De hele procedure moet in 20 minuten of minder worden uitgevoerd. Het is raadzaam dat beginners alleen electroporate een paar embryo&#39;s om de werking tijd kort te houden. Langdurig operaties wordt het overlevingspercentage van de embryo&#39;s te verminderen. </li><li> Haal het dier uit de narcose slangen en terug te kunnen halen op de verwarming pad op een papieren doekje. </li><li> Terug dier naar de kooi, houd het op de verwarming pad bij 37 ° C en het toezicht op de gezondheidstoestand. De dieren gewoonlijk ook de operatie goed en beginnen langzaam kort nadat zij uit de anesthesie slang. Als overmatig bloeden of lethargie wordt waargenomen, offeren het dier onmiddellijk door het uitvoeren IACUC goedgekeurde euthanasie procedures zoals cervicale dislocatie of verdoving overdosis. </li><li> Keer terug naar de kooi vivarium. De vrouwtjes zullen geboorte van nature geven. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beperkingen van de Techniek Hoewel deze techniek maakt cell autonome analyse van celprocessen, is het niet geschikt voor populatie-analyse. De electroporations zijn erg schraal minder dan duizend cellen geëlektroporeerd per hersenen. Bijgevolg kan de techniek niet worden gebruikt om gedragsconsequenties gevolg van de genetische manipulatie van CGE-afgeleide interneuronen beoordelen. Terwijl electroporations uitgevoerd op E13.5-E14.5 doel MGE-afgeleide subtypen, h...

Het grootste deel van de corticale GABAergische interneuronen zijn afkomstig van twee tijdelijke embryonale structuren genaamd de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE respectievelijk) 4. Parvalbumine en somatostatine uiten interneuronen hun oorsprong in de MGE terwijl calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) en Reelin (Re) uiten interneuronen zijn afkomstig uit de CGE. Deze interneuron subtypen kunnen worden onderscheiden door hun geboortedata. MGE afgeleide subtypen zijn geboren tussen embryonale dag 9.5 (E9.5) en E16.5 5,6. In tegenstelling, zijn CGE afgeleid interneuronen geboren uit E12.5 door E18.5 met hun productie een piek van E15.5 6. De genetische targeting van dit late geboren bevolking blijft echter ongrijpbaar. Het murine distale minder (Dlx) genen exclusief tot expressie in de ontwikkeling ventrale voorhersenen 3. GABA-erge interneuronen en striatum projectie neuronen maar niet corticale piramidale cellen brengen Dlx1, 2,5, en 6 genen in de vroege ontwikkelingsstadia 3. Inderdaad, de Dlx genen die in de MGE en CGE subventriculaire zone (SVZ) in alle GABAerge voorlopers. Expressie van deze genen wordt beperkt tot subtypen te selecteren op postmitotische stadia 7-9. Vorige experimenteel bewijsmateriaal bleek dat de Dlx5 / 6 versterkend element zorgt voor de selectieve targeting van GABAergic geslachten in transgene muismodellen 2. We testten het gebruik van een van deze enhancer elementen in de context van episomale expressie in de zich ontwikkelende hersenen van muizen. We sub gekloneerd de Dlx5 / 6 enhancer element met een minimale promotor en versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) in een Bluescript-(BS) backbone plasmide (Figuur 1). We introduceerden het plasmide door middel van in utero elektroporatie op E15.5 om selectief richten Cr-, VIP en Re- subtypes 3,8,10. De techniek maakt sparse elektroporatie, welke vergemakkelijktde reconstructie van de morfologische kenmerken van singe cellen. Bovendien, de uitzonderlijk hoge niveaus van genexpressie in corticale GABAerge neuronen zorgt voor functionele studies. Voerden we verlies en winst van functie studies met behulp van verschillende wild-type en dominant negatieve genen 11.

<table><tbody><tr><td>Electroporator&nbsp; met pedaal</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm peddelelektroden&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 Puller&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anesthesia Systems</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Fijne operatieschaart 4,75" Rechte Scherp/Scherp</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Zijde Zwart Vlecht 18" C-1 Doos 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Aanbrengtang 5,5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Klauwschaar</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Vangkanger&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillairbuis&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steriele PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

subtype-selectieve electroporatie van corticale interneurons

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

De studie van het centrale zenuwstelsel (CZS) rijping is gebaseerd op genetische doelgerichtheid van neuronale populaties. Echter de taak van de expressie van genen van belang specifieke neuronale subtypes beperkt opmerkelijk moeilijk gebleken vanwege de relatieve schaarste aan specifieke promotor elementen. GABA-erge interneuronen vormen een neuronale populatie met uitgebreide genetische en morfologische diversiteit. Sterker nog, meer dan 11 verschillende subtypes van GABA-erge interneuronen gekarakteriseerd in de muis cortex 1. Hier geven we een geschikt protocol voor het selectief richten van GABAerge populaties. We bereikten subtype selectieve targeting van GABAerge interneuronen door de enhancer element van het homeobox transcriptiefactoren Dlx5 en Dlx6, homologen van het Drosophila distale minder (Dll) gen 2,3, om de expressie van specifieke genen rijden door in utero elektroporatie.

We passen de in utero elektroporatie techniek om celtype specifieke targeting van rijpen neuronen bereiken. Om de expressie van eGFP in CGE-afgeleide interneuronen rijden, gebruikten we de Dlx5 / 6 versterkend element en beperkt onze injecties om E15.5, de fase waarin de meerderheid van de CGE-afgeleide interneuronen worden gegenereerd. We voerden de analyse op P8 en P15 11 (figuren 1 en 2). We bevestigden de ventrale oorsprong van geëlectroporeerd neuronen ...

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Het algemene doel van deze procedure is om interneuronen in de ontwikkelende hersenen van de muis te targeten middels in utero electroporatie. Dit wordt bereikt door eerst de injectienaalden voor te bereiden. De tweede stap is het verwijderen van het embryonale keten uit het geanestheseerde dier.Vervolgens worden DNA-injectie en elektroporatie in de hersenen uitgevoerd. De laatste stap is het dier te laten herstellen van de operatie. Uiteindelijk wordt in utero elektroporatie gebruikt om selectieve targeting van interneuroon-subtypes mogelijk te maken.Het voordeel van deze methoden ten opzichte van onze bestaande technieken, zoals niet-specifieke in utero elektroporatie, is dat ze de mogelijkheid bieden om celautonome analyse uit te voeren op een subset van corticale interneuronen. De hoge niveaus van GFP-expressie maken visualisatie en analyse van individuele interneuronen mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen binnen het vakgebied van de neuro-ontwikkeling, zoals de regels die de integratie van rijpend interneuronen bepalen.Om deze procedure te starten, bereidt u de microinjectiepipet voor door een glazen capillair te trekken met een pipettrekker. Verwijder vervolgens voorzichtig de capillair en verzamel de onderste naald voor de microinjectie. Plaats nu een geanestheseerde drachtige muis met de ventrale zijde naar boven op het warmtekussen.Bedek de snuit met een masker dat gedurende de hele operatie isofluraan blijft toedienen. Breng vervolgens ooglubricant aan in beide ogen. Stel de warmtemat in op 36 graden Celsius om hypothermie achteraf te voorkomen.Controleer op de afwezigheid van voet- en staartreflexen door in de achterpoten of de staart te knijpen. Reinig vervolgens de huid op de buik met 70% ethanol. Gebruik een pincet om de huid omhoog te trekken.Maak vervolgens een kleine verticale incisie van twee centimeter langs de middenlijn, beginnend halverwege tussen het derde en vierde paar melkklieren. Let erop dat de buikwand niet wordt beschadigd door gebruik te maken van ronde pincetten. Trek de embryonale keten voorzichtig weg van de holte.Laat de keten op de natte doekjes rusten. Begin met het blootleggen van één helft van de uterus. Ga vervolgens over tot de elektroporatie van de embryo's voordat u doorgaat naar de andere helft.Bereid bij deze procedure een DNA-oplossing door het pellet dat is verkregen uit een standaard maxi prep-purificatieprotocol op te lossen in gedestilleerd water. Voeg vervolgens fast green toe aan de DNA-oplossing in een verhouding van één op 20 om visualisatie tijdens de injectie mogelijk te maken. Snijd daarna met een fijne pincet de punt van een vooraf ingetrokken micropipet af, zodat er zes millimeter overblijft van het begin van de schouder tot het uiteinde van de punt.Laad vervolgens de micropipet met één µL DNA-oplossing met fast green voor injectie. Houd de kop van het embryo vast met een ronde pincet. Voer de pipet onder een hoek van 45 graden in de hersenen in, gericht op de laterale ventrikel nabij de middellijn.Als de naald door het ventrikel dringt, trek de pipet dan langzaam terug. Het ventrikel moet groen worden zodra de oplossing het begint te vullen. Stop op dit punt met het bewegen van de pipet en injecteer één microliter DNA.Trek vervolgens voorzichtig de pipet terug. Stel de ECM eight 30 ator in op 5 45 volt pulsen van 50 milliseconden met een interpulse-interval van 950 milliseconden. Dip de vijf millimeter pedelelektroden in PBS om een efficiënte stroomoverdracht te garanderen.Plaats vervolgens de elektrodeplaten rond de kop van het embryo, waarbij een positieve plaat op het ventrikel met de DNA-oplossing wordt geplaatst. Plaats de positieve plaat iets lager dan de negatieve plaat om een ventrale stroom door de ganglionic eminences te creëren. Dit minimaliseert ectopische expressie in parametale cellen.Dien nu een puls toe door eenmaal op het voetpedaal te drukken, verwijder vervolgens de elektroden en veeg ze schoon. Herhaal deze stappen voor elk van de embryo's. Nadat alle embryo's zijn geëlektroporeerd.Giet drie milliliter PBS in de buikholte en plaats de embryo's terug in de buikholte. Hecht vervolgens de buikwand met een gebogen naald en 5-0 zijden hechtdraad, en daarna de huid. Breng lidocaïne aan op de wond en dien in eerste instantie 120 milligram per kilogram aspirine toe voor analgesie.Verwijder het dier uit de anesthesieslangen en laat het herstellen op de warmteplaat op een papieren tissue. Plaats het dier daarna terug in de kooi. Houd het dier op de warmteplaat bij 37 °C en controleer de gezondheidstoestand.In dit experiment worden geëlektroporeerde interneuronen gedelineerd door de expressie van markers voor subtypen afgeleid van de CGE. Deze afbeelding laat zien dat de interneuronen afgeleid van de CGE zijn geëlektroporeerd met een DLX vijf zes EGFP-plasmide. Deze afbeelding toont een VIP-expresserend interneuron bij P acht.De EGFP-expressie bakent de volledige dendritische boom en axonale arborisatie van individuele neuronen af, en hier is een NPY-uitdrukkend interneuron bij P 8. De NPY-expressie bakent neurogliaformcellen af. Tot slot is hier een NPY-uitdrukkend interneuron bij P 15.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 20 minuten worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Door het gebruik van specifieke plasmiden en genetisch gemodificeerde muislijnen te combineren, is het mogelijk om temporele en spatiale controle over de expressie van genen van belang te bereiken. In sommige experimenten gebruiken we het A-D-L-X-T-T-A-plasmide om de expressie van AU-afhankelijke transgenen te induceren.In deze experimenten schakelen we de expressie van het transgen uit door doxycycline toe te dienen.

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

This video demonstrates the protocol for single-cell electroporation of genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice cultures. The technique is useful to examine specific molecular and physiological functions of neurons, including cell autonomous mechanisms and transsynaptic protein interactions.

Single Cell Electroporation in Organotypic Brain Slice Cultures: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids Inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Leer hoe u interneuronen in de ontwikkelende muis voorhersenen kunt targeten met in utero elektroporatie. Deze methode maakt selectieve genexpressie in interneuron-subtypen mogelijk voor neuroontwikkelingsonderzoek.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Meer video's verkennen