Twee-Photon In vivo Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding
May 12th, 2014
Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om transcraniële beeldvorming mogelijk te maken, fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie. De eerste stap na het verdoven van de muis is het uitvoeren van een preparatie met een verdunde schedel. Vervolgens wordt de kop van de muis geïmmobiliseerd met behulp van een op maat gemaakte houdplaat.
Vervolgens worden beeldstacks verkregen door de verdunde schedel met behulp van twee-foton microscopie. Uiteindelijk, herplaatsen en afbeelden. Het eerder afgebeelde gebied maakte het mogelijk om de dynamica van dendritische stekels over verschillende tijdsperioden onder verschillende omstandigheden te volgen.
Om je voor te bereiden op de operatie, verdooft u een muis met ketamine en xylazine en voert u een teenprik uit om volledige verdoving te verzekeren. Plaats vervolgens de muis op een verwarmingskussentje en gebruik een scheermes om het hoofd te scheren. Veeg de huid af met afwisselend alcoholpads om het geschoren gebied te steriliseren en eventuele resterende haarclippings te verwijderen.
Breng ook voorzichtig oogzalf aan op beide ogen. Maak vervolgens een rechte incisie langs de middellijn van de hoofdhuid en beweeg de huid lateraal naar de randen van de schedel. Verwijder vervolgens het bindweefsel dat aan de schedel is bevestigd om de voorbereiding van de verdunde schedel te beginnen.
Identificeer eerst het gewenste beeldvormingsgebied op basis van de relatieve locatie ten opzichte van de middellijn en bgma. Bevochtig vervolgens de schedel met zoutoplossing om de vaatbundels te observeren om te voorkomen dat de schedel wordt verdund in een gebied met grote bloedvaten, omdat deze de lichtpenetratie blokkeren en de beeldafbeeldingen vervagen. Zodra een gebied van 0,5 tot één millimeter diameter is geselecteerd, gebruikt u een hogesnelheidsmicroboor om een cirkelvormig gebied van de schedel te verdunnen.
Beweeg de boor parallel aan het schedeloppervlak in plaats van hem tegen de schedel te houden en naar beneden te drukken om schade door oververhitting te voorkomen. Vermijd langdurig contact tussen de boorkop en de schedel totdat zowel de buitenste compacte botlaag als de middelste sponsachtige botlaag zijn verwijderd. Gebruik vervolgens een microchirurgische mes gehouden op ongeveer 45 graden om de binnenste compacte botlaag in het midden van het door de boor verdunde gebied te verdunnen.
Schraap de schedel zonder naar beneden te drukken totdat een gelijkmatig verdund gebied van 200 tot 300 micrometer diameter met een dikte van ongeveer 20 tot 30 micrometer is verkregen. Zodra de schedel voldoende is verdund, verwijdert u voorzichtig het botafval. De volgende stap is om de kopplaat te bevestigen, die is gemaakt van scheermessen met scherpe randen bedekt met tapes.
Begin met het plaatsen van een kleine druppel cyanoacrylaatlijm op elke rand van de centrale opening van de kopplaat. Centreer vervolgens de kopplaat op het verdunde gebied. Houd het stevig tegen de schedel.
Trek nu voorzichtig de huid van de zijkanten van de schedel naar de randen van de centrale opening van de kopplaat. Houd de kopplaat gedurende één tot twee minuten op zijn plaats. Wacht vervolgens nog eens acht tot negen minuten tot de kopplaat goed aan de schedel is bevestigd.
Na 10 minuten plaatst u de kopplaat op de twee laterale blokken van de houdplaat. Draai vervolgens de schroeven over de randen van de kopplaat vast om de muis op de houdplaat te immobiliseren. Kijk door een dissectiemicroscoop naar het hoofd van de muis terwijl u voorzichtig de rug van de muis polstert om er zeker van te zijn dat het hoofd goed is geïmmobiliseerd.
Spoel vervolgens de blootgestelde schedel af met zoutoplossing om eventuele niet-gepolymeriseerde lijm te verwijderen om het eerder afgebeelde gebied opnieuw te lokaliseren. Neem in volgende beeldvormingssessies een foto van de vaatbundels van het verdunde gebied van de blootgestelde schedel, die map één wordt genoemd. Plaats vervolgens de muis onder de beeldvormingsmicroscoop en lokaliseer het verdunde gebied onder het 10 x luchtobjectief.
Gebruik epifluorescentie om het dunste gebied naar het midden van het zicht te verplaatsen. Voeg nu een druppel zoutoplossing toe aan de bovenkant van de schedel en schakel over naar het 60 x objectief. Selecteer een gebied waar individuele dendritische stekels duidelijk zichtbaar zijn langs dendrieten.
Identificeer en label het overeenkomstige gebied op map één door de vaatbundels te vergelijken tussen de epifluorescente weergave en de vaatfoto. Stem vervolgens de golflengte van de twee-foton laser af op de fluoro vieren. Gebruik vervolgens het 60 x objectief om beeldstacks te verkrijgen met stappen van twee micrometer langs de Z-as, die een gebied van ongeveer 200 micrometer bij 200 micrometer bedekken.
Dit wordt map twee genoemd en wordt gebruikt voor het opnieuw lokaliseren van het beeld van het dendritische segment tijdens volgende beeldvormingssessies. Verkrijg nu negen beeldstacks binnen map twee met behulp van drievoudige digitale zoom. Elke beeldstack bedekt een geschat gebied van 70 micrometer bij 70 micrometer met stappen van 0,7 micrometer langs de Z-as.
Na de beeldvorming verwijdert u voorzichtig de kopplaat van de schedel. Gebruik vervolgens een microchirurgisch mes om de resterende lijm van de schedel te verwijderen. Spoel vervolgens de schedel en de huid meerdere keren met zoutoplossing en naai de hoofdhuid met steriele chirurgische hechtingen.
Tijdens het herstel houdt u het dier op een verwarmingskussen in een aparte kooi en dient u buprenorfine analgeticum subcutaan toe voor postoperatieve pijn. Na volledige herstel brengt u het dier terug naar de thuiskooi. Om dendrieten op een andere dag opnieuw af te beelden, verdooft u het dier en stelt u de schedel bloot. Herhaal zoals eerder de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor transcraniële beeldvorming van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex met behulp van twee-foton microscopie. De verdunde schedelpreparatie maakt gedetailleerde observatie van structurele reorganisatie in de intacte hersenen mogelijk over tijd.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Beeldvormingstechnieken
- Synaptische Dynamiek
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische structuren is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Traditionele beeldvormingsmethoden staan mogelijk geen in vivo observatie toe.
- Twee-foton microscopie biedt hoogwaardige beeldvormingscapaciteiten.
- De verdunde schedelpreparatie is een nieuwe aanpak voor dergelijke beeldvorming.
Doel van het onderzoek
- Om transcraniële beeldvorming van synaptische structuren in levende muizen mogelijk te maken.
- Om de dynamica van dendritische stekels over tijd te observeren.
- Om onderzoek naar structurele reorganisatie in de hersenen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verdoving van de muis.
- Uitvoeren van een verdunde schedelpreparatie.
- Immobilisatie van het hoofd van de muis met een aangepaste houdplaat.
- Verkrijgen van beeldstacks door de verdunde schedel met behulp van twee-foton microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van fluorescent gelabelde synaptische structuren.
- Mogelijkheid om de dynamica van dendritische stekels over tijd te traceren.
- Inzichten in structurele veranderingen in de levende muizencortex.
- Demonstratie van de effectiviteit van de verdunde schedelpreparatie.
Conclusies
- De verdunde schedelpreparatie is een waardevolle techniek voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Twee-foton microscopie maakt gedetailleerde in vivo beeldvorming mogelijk.
- Deze methode kan ons begrip van synaptische dynamica verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex enables direct observation of synaptic structural dynamics over time, supporting mechanistic de-risking in neurobiology discovery. This approach provides predictive confidence for target validation and pathway interrogation in CNS drug discovery portfolios. The method's repeatability and minimal invasiveness facilitate longitudinal studies critical for translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic remodeling, informing target engagement and pathway relevance.
- Supports functional validation of synaptic plasticity mechanisms in disease-relevant neural circuits.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing repeated, quantitative assessment of dendritic spine dynamics.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for evaluating compound effects on synaptic structure.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports assay standardization by mapping and relocating identical dendritic segments over multiple sessions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling imaging in various cortical regions and cell types under physiological and pathological states.
- Facilitates longitudinal biomarker studies by tracking synaptic changes over extended periods.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, repeatable in vivo measurements.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational research in CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of synaptic changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging data for compound evaluation in live neural tissue.
- Analytics: Provides high-content image stacks and quantitative spine turnover metrics for statistical comparison.
- Translational Research: Enables continuity by allowing repeated imaging in the same animal across time points and conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS targets, cell types, and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in synaptic target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust longitudinal data collection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy and small animal surgical techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and custom head immobilization hardware.
- Necessitates rigorous cross-session mapping and standardization for longitudinal studies.
- Adaptable to various cortical regions, layers, and cell types as supported by the protocol.
- Limited by the need for precise skull thinning and potential regrowth of bone over time.
