Name: Twee-Photon In vivo Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer twee-fotonmicroscopie voor in vivo beeldvorming van dendritische stekels in de muis hersenschors met een uitgedunde schedel. Deze methode maakt langdurige observatie van synaptische dynamiek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken James Perna voor de grafische illustratie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Mental Health aan YZ

Goedkeuring moet worden verkregen van thuis instellingen voor aanvang van de chirurgie en beeldvorming studie. Experimenten in dit manuscript beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Californië, Santa Cruz Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Chirurgie <ol><li> Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en steriliseer de werkruimte met 70% alcohol goed voor de operatie. </li><li> Verdoven de muis door intraperitoneale (IP) injectie van KX anestheticum (200 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine) volgens muis lichaamsgewicht. Opmerking: KX dosering worden aangepast aan de stam, leeftijd en gezondheidstoestand van de muizen. Veterinaire overleg om de optimale dosis te bepalen is ook een aanrader. </li><li> Voer een teen-pinch-test periodiek door op de tenen van de muis en het controleren op een reflexieve reactie op de verdoving statusvenster.Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd voordat de operatie. Opmerking: Tijdens langdurige beeldvorming sessies, controleer anesthesie status van de muis periodiek, administreren extra KX indien nodig. </li><li> Plaats de muis op een verwarmingselement voor de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. </li><li> Scheer de kop van de muis met behulp van een scheermesje om de hoofdhuid te bloot. </li><li> Steriliseer het geschoren gebied door de huid met afwisselend alcohol pads en betadine vegen. Verwijder eventuele resterende haren knipsels. </li><li> Voorzichtig toe te passen oogzalf in beide ogen te smeren, dus het voorkomen van permanente schade veroorzaakt door uitdroging tijdens het experiment. </li><li> Maak een rechte incisie langs de middellijn van de hoofdhuid, en verplaats de huid lateraal naar de randen van de schedel. </li><li> Verwijder het bindweefsel aan de schedel. </li></ol> 2. Verdunde-schedel Voorbereiding <ol><li> Identificeer de beeldvorming regio op basis van ster. eotaxic coördinaten Opmerking: Probeer om grote bloedvaten, die blok lichtinval te voorkomen en vervagen de afgebeelde structuren. Vaatstelsel wordt het best waargenomen wanneer de schedel is vochtig met steriele zoutoplossing. </li><li> Met de high-speed micro boor te dun een cirkelvormig gebied van de schedel (0,5-1,0 mm diameter). Beweeg de boor parallel aan de schedel oppervlak, in plaats van vast te houden tegen de schedel en de naar beneden te drukken. Boor tot zowel de buitenste compact bot laag en de middelste sponsachtige bot laag worden verwijderd. Opmerking: Om schade door oververhitting te voorkomen, vermijd langdurig contact tussen de boor en de schedel. </li><li> Verder verdunnen van de binnenste compacta laag met een microchirurgische mes in het midden van de boor verdund regio. Houd de microchirurgische mes onder een hoek van ongeveer 45 ° aan de schedel schrapen zonder naar beneden te drukken tegen de schedel tot een gelijkmatig uitgedund klein gebied (200-300 micrometer diameter) met een dikte van ongeveerly 20-30 urn wordt verkregen. Door de automatische fluorescentie van de schedel, kan de dikte worden gemeten door het scannen van de afstand tussen bovenste en onderste oppervlak van de schedel onder de twee-foton microscoop. Opmerking: hoewel een schedel dikte van minder dan 20 urn biedt een goede beeldkwaliteit, het is niet aanbevolen, want het maakt het dunner proces in latere re-imaging-sessies moeilijk. Om te voorkomen dat over-dunner, de dikte van de schedel moet regelmatig worden gecontroleerd tijdens de operatie (zie Discussie). </li></ol> 3. Immobilisatie <ol><li> Verwijder bot puin zorgvuldig. </li><li> Plaats een kleine druppel cyanoacrylaat lijm op elke rand van de centrale opening van de steriele kopplaat, die is geautoclaveerd (zie figuur 1). Houd het hoofd plaat strak tegen de schedel met de verdunde regio gelegen in het centrum van de opening. Opmerking: Als de lijm vervuilt de verdunde region per ongeluk, verwijder deze dan voorzichtig met de microchirurgische mes. </li><li> Trek de huid tegen de zijkanten van de schedel om de randen van de centrale opening van de kopplaat. </li><li> Wacht ongeveer 10 minuten totdat de kop plaat goed is bevestigd aan de schedel. </li><li> Plaats het hoofd plaat op twee zijdelingse blokken van de montageplaat en draai de schroeven over de randen van het hoofd plaat om de muis te immobiliseren op de montageplaat (zie figuur 1). Opmerking: Zorg ervoor dat er geen huid of snorharen tussen het hoofd bord en de blokken voor het aandraaien van de schroeven. Een goede geïmmobiliseerd preparaat dient geen waarneembare beweging van de schedel af onder de stereomicroscoop bij de rug van het dier zachtjes klopte. </li><li> . Spoel de blootgestelde schedel met zoutoplossing om gepolymeriseerde lijm verwijderen Opmerking: Het is belangrijk om alle resterende lijm te verwijderen, als niet-gepolymeriseerd lijm vervaagt beelden en schade microscoop doelstellingen &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Imaging <ol><li> Maak een foto van het vaatstelsel van de blootgestelde schedel met de uitgedund regio op de kaart 1, die wordt gebruikt om te verhuizen de afgebeelde regio in de daaropvolgende beeldvorming sessies (zie figuur 2). </li><li> Plaats de muis onder de imaging microscoop. Zoek de verdunde gebied onder een 10X lucht doelstelling met behulp van epifluorescentie en verplaats de dunste gebied naar het centrum van het uitzicht. </li><li> Voeg een druppel zoutoplossing op de bovenkant van de schedel en naar het 60x objectief, die is gespoeld met steriel water. Selecteer een regio waar individuele vertakte stekels duidelijk zichtbaar langs de dendrieten. Identificeer en label het overeenkomstige gebied op kaart 1 door het vergelijken vaatstelsel tussen de epifluorescerende uitzicht en het vaatstelsel foto. </li><li> Stem de twee-foton laser golflengte volgens de fluoroforen. Bijvoorbeeld 920 nm voor YFP; 890 nm voor GFP; 1000 nm voor DsRed en tdTomato 24. </li><li> Acquire image stacks met 2urn stappen langs de z-as met de 60X objectief. Dit afbeeldingsstapel omvat een ongeveer 200 urn x 200 urn stippellijn (512 x 512 pixels) en wordt gebruikt als kaart 2 voor verplaatsing in latere beeldvorming sessies (zie figuur 2). </li><li> Acquire negen image stacks binnen Kaart 2 met behulp 3x digitale zoom. Elke afbeeldingsstapel heeft een oppervlakte van ongeveer 70 urn x 70 urn (512 x 512 pixels), met 0,7 micrometer stappen langs de z-as. Opmerking: De intensiteit van de laser moet lager zijn dan 40 mW, gemeten in monsters fototoxiciteit minimaliseren. </li></ol> 5. Recovery <ol><li> Na beeldvorming, voorzichtig los het hoofd plaat uit de schedel. </li><li> Grondig reinigen van de schedel en de huid om alle resterende lijm te verwijderen. Opmerking: Eventuele resterende lijm op de huid irritaties veroorzaken en vertraagt ​​herstel van de huid terwijl de resterende lijm op de schedel zal erosie van de schedel en een oorzaakngiogenesis in de pas gegroeide bot laag, waardoor de daaropvolgende verhuizing en re-imaging moeilijk. </li><li> Spoel de schedel en de huid met een zoutoplossing meerdere malen. </li><li> Hecht de hoofdhuid met steriel chirurgisch hechtdraad. </li><li> Houd het dier op een verwarmingselement in een aparte kooi. Dien analgetische buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan om postoperatieve pijn te verzachten. Breng het dier naar de kooi na volledig herstel. Nauwlettend toezien op het dier (check minstens eenmaal per dag) tot de incisie is genezen en de hechtingen worden verwijderd. Dien volgende injecties buprenorfine analgetische indien nodig. </li></ol> 6. Reimaging <ol><li> Herhaal de stappen 1,1-1,8. </li><li> Herhaal de stappen 3,1-3,6 </li><li> Zoek eerder afgebeeld regio door het vergelijken van het vaatstelsel patroon kaart 1 en de dendritische tak patroon kaart 2. </li><li> Als reimaging wordt uitgevoerd binnen 1 week, herhaal stap 2.3 de dunne laag van pas gegroeide bot bovenop de verdunde re verwijderenGewest met de microchirurgische mes. Als reimaging wordt uitgevoerd na meer dan 1 week, herhaalt u stap zowel 2.2 en 2.3. Opmerking: De pas gegroeide bot laag bestaat uit een minder gecondenseerde structuur in vergelijking met de oorspronkelijke compacte bot laag, wat leidt tot een mindere beeldkwaliteit. Daarom, om dezelfde kwaliteit te verkrijgen, is het noodzakelijk om dunne schedel iets meer dan de vorige opnamesessie. </li><li> Pas de positie en oriëntatie op de foto om stapels die voorheen image stacks overeenkomen genomen in het kader van de twee-foton microscoop te verkrijgen. </li><li> Acquire beelden als in stap 4.6. </li><li> Herhaal de stappen 5,1-5,5 na beeldvorming. </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Om een ​​succesvolle uitgedund-schedel voorbereiding te verkrijgen, verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal. 1) De dikte van de schedel. Het schedelbot heeft een sandwich-structuur, met twee lagen van high-density compact bot en een middelste laag van lage-dichtheid sponsachtig bot. De hoge-snelheid micro boormachine is geschikt voor het verwijderen van de buitenlagen van compact bot en sponsachtig been, de microchirurgische blad is ideaal voor het verdunnen van de binnenlaag van compacta. Aangezien de dikte...

De zoogdieren cortex participeert in vele hersenfuncties, van zintuiglijke waarneming en controle voor het abstracte informatieverwerking en cognitie. Verschillende corticale functies bouwen op verschillende neurale circuits, die zijn opgebouwd uit verschillende soorten neuronen communiceren en uitwisselen van informatie op individueel synapsen. De structuur en functie van synapsen consequent worden gewijzigd ingevolge ervaringen en pathologieën. In de volwassen hersenen, synaptische plasticiteit in de vorm van zowel kracht veranderingen en toevoeging / verwijdering van synapsen, spelen een belangrijke rol bij de vorming en instandhouding van een functionele neurale circuits. Dendritische stekels zijn de postsynaptische onderdelen van de meerderheid van exciterende synapsen in de hersenen van zoogdieren. De constante omzet en morfologische veranderingen van de stekels worden verondersteld om te dienen als een goede indicator van veranderingen in synaptische verbindingen 1-7. Twee-foton laser scanning microscopie biedt diepe penetratie door dikke, ondoorzichtige voorbereidingen en lage fototoxiciteit, waardoor het geschikt is voor live-imaging in de intacte hersenen 8 maakt. In combinatie met fluorescentielabelling, twee-foton beeldvorming biedt een krachtig instrument om een ​​kijkje in het levende brein en volg structurele reorganisatie bij individuele synapsen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Verschillende methoden zijn gebruikt om muizen te bereiden voor levende beeldvorming 9-13. Hier beschrijven we een uitgedunde schedel voorbereiding van in vivo twee-foton beeldvorming om de structurele plasticiteit van postsynaptische vertakte stekels in de muis cortex onderzoeken. Met deze benadering hebben onze recente studies een dynamisch beeld van dendritische spine veranderingen weergegeven in reactie op motorische vaardigheden leren Met de toenemende beschikbaarheid van met fluorescent gelabelde neuronale subsets en snelle ontwikkeling van in vivo labeling technieken transgene dieren, kan dit hier beschreven ook worden toegepast te onderzoekente andere celtypes en corticale gebieden, gecombineerd met andere manipulaties, alsook in ziektemodellen 16-23.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Gemengd met xylazine voor anesthesie</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Gemengd met ketamine voor anesthesie</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0,9% NaCl voor injectie en beeldvorming</td></tr><tr><td>Vleesmessen</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>72000</td><td>Dubbelzijdige roestvrijstalen vleesmessen</td></tr><tr><td>Alcoholdoekjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Steriele alcoholdoekjes</td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Petrolatum oogzalf steriele oculaire smeermiddel</td></tr><tr><td>Microboor met hoge snelheid</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>De microboor met hoge snelheid is geschikt voor het verdunnen van de buitenste laag compact bot en het targeten van een klein gebied</td></tr><tr><td>Microboor stalen beitels</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td>1,4 mm diameter</td></tr><tr><td>Microchirurgisch mes</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>Het microchirurgisch mes is geschikt voor het verdunnen van de binnenste laag compact bot en de middelste laag sponsachtig bot</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Bevestig de hoofdplaat op de schedel</td></tr><tr><td>Hechtdraad</td><td>Havard Apparatus</td><td>510461</td><td>Niet-absorbeerbare, steriele zijdedraad, 6-0 monofilament</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee-foton microscoop</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X objectief</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0,30, lucht</td></tr><tr><td>60X objectief</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1,1, IR doorlaatbaar, waterimmersie</td></tr><tr><td>Ti-saffierlaser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

twee-photon<em&gt; in vivo</em&gt; imaging van vertakte stekels in de mouse cortex met een uitgedunde schedel voorbereiding

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In de zoogdieren cortex neuronen vormen extreem gecompliceerde netwerken en informatie uitwisselen bij synapsen. Veranderingen in synaptische sterkte, evenals toevoeging / verwijdering van synapsen, plaatsvinden in een ervaringsafhankelijke wijze die de structurele basis van neuronale plasticiteit. Als postsynaptische onderdelen van de exciterende synapsen in de cortex, worden dendritische beschouwd als een goede benadering van synapsen zijn. Het nemen van de voordelen van de muis genetica en fluorescentielabelling technieken, individuele neuronen en hun synaptische structuren kunnen in de intacte hersenen worden geëtiketteerd. Hier introduceren we een transcraniële imaging protocol met behulp van twee-foton laser scanning microscopie om fluorescent gelabelde postsynaptische vertakte stekels in de tijd in vivo te volgen. Dit protocol maakt gebruik van een uitgedund-schedel voorbereiding, waarbij de schedel intact houdt en voorkomt inflammatoire effecten veroorzaakt door blootstelling van de hersenvliezen en de cortex. Daarom beelden kunnen direct na su verworvenrgery wordt uitgevoerd. De experimentele procedure kan herhaaldelijk worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen, variërend van enkele uren tot jaren. De toepassing van dit preparaat kan ook worden uitgebreid tot verschillende corticale gebieden en lagen, alsmede andere celtypes, onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

In YFP-H lijn 25 muizen, geel fluorescerend eiwit expressie in een subset van laag V piramidale neuronen, die de apicale dendrieten uitsteken in de oppervlakkige lagen van de cortex. Door de uitgedunde schedel voorbereiding, kan de fluorescent gelabelde dendritische segmenten herhaaldelijk worden afgebeeld onder twee-foton microscoop op verschillende beeldvormende intervallen, variërend van uren tot maanden. Hier tonen we een voorbeeld van een vier-time beeldvorming van dezelfde dendrieten dan 8 dagen in de m...

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Het algemene doel van deze procedure is om transcraniale beeldvorming van fluorescentielabelige synaptische structuren in de levende cortex van de muis mogelijk te maken met behulp van tweefotonmicroscopie. De eerste stap na het anesthetiseren van de muis is het uitvoeren van een preparatie waarbij de schedel wordt uitgedund. Vervolgens wordt de kop van de muis geïmmobiliseerd met een op maat gemaakte klemplaat.Vervolgens worden beeldstacks via de uitgedunde schedel verkregen met behulp van tweefotonmicroscopie. Door uiteindelijk de eerder gefotografeerde regio opnieuw te lokaliseren en af te beelden, konden de dynamieken van dendritische stekels gedurende verschillende tijdsperioden onder uiteenlopende condities worden gevolgd.Ter voorbereiding op de operatie wordt een muis geanestheseerd met ketamine en xylazine, waarna een knijptest bij de teen wordt uitgevoerd om volledige anesthesie te bevestigen. Plaats de muis vervolgens op een warmtemat en scheer de kop met een scheermesje. Veeg de huid af met afwisselende alcoholpads om het geschoren gebied te steriliseren en eventuele resterende haartjes te verwijderen.Breng daarna voorzichtig oogsalf aan in beide ogen. Maak vervolgens een rechte incisie langs de middenlijn van de hoofdhuid en schuif de huid zijwaarts richting de randen van de schedel. Verwijder daarna het aan de schedel gehechte bindweefsel om te beginnen met de preparatie van de uitgedunde schedel.Identificeer eerst het gewenste beeldregio op basis van de relatieve locatie ten opzichte van de middellijn en de bgma. Bevochtig vervolgens de schedel met zoutoplossing om de vaten waar te nemen, om zo te voorkomen dat de schedel in een gebied met grote bloedvaten wordt uitgedund, aangezien deze de lichtpenetratie blokkeren en de beeldstructuren vervagen. Zodra een gebied met een diameter van 0,5 tot 1 millimeter is geselecteerd, dient een hogesnelheidsmicroboor te worden gebruikt om een cirkelvormig deel van de schedel uit te dunnen.Beweeg de boor parallel aan het schedeloppervlak in plaats van deze tegen de schedel aan te houden en naar beneden te drukken, om schade door oververhitting te voorkomen. Vermijd langdurig contact tussen de boorkop en de schedelboor totdat zowel de buitenste compacte botlaag als de middelste sponsachtige botlaag zijn verwijderd. Gebruik vervolgens een microsurgisch mesje, onder een hoek van ongeveer 45 graden gehouden, om de binnenste compacte botlaag in het centrum van het door de boor uitgedunde gebied verder uit te dunnen.Schraap de schedel zonder hard op de schedel te drukken totdat een gelijkmatig verdund gebied met een diameter van 200 tot 300 micrometers en een dikte van ongeveer 20 tot 30 micrometers is verkregen. Zodra de schedel voldoende is verdund, dient het botresidu zorgvuldig te worden verwijderd. De volgende stap is het bevestigen van de hoofdfixatieplaat, die is vervaardigd uit scheermesjes met scherpe randen die zijn afgedekt met tape.Begin met het aanbrengen van een kleine druppel cyanoacrylaatlijm op elke rand van de centrale opening van de hoofplaat. Centreer vervolgens de hoofplaat op het uitgedunde gebied. Houd deze stevig tegen de schedel aan.Trek nu voorzichtig de huid vanaf de zijkanten van de schedel naar de randen van de centrale opening van de hoofdplaat. Houd de hoofdplaat één tot twee minuten op zijn plaats. Wacht vervolgens nog acht tot negen minuten totdat de hoofdplaat goed aan de schedel is gehecht.Plaats na 10 minuten de hoofdplaat op de twee laterale blokken van de houderplaat. Draai vervolgens de schroeven over de randen van de hoofdplaat aan om de muis op de houderplaat te immobiliseren. Bekijk de kop van de muis via een dissectiemicroscoop terwijl u voorzichtig op de rug van de muis drukt om er zeker van te zijn dat de kop correct is geïmmobiliseerd.Spoel vervolgens de blootgestelde schedel met zoutoplossing om alle niet-gepolymeriseerde lijm te verwijderen, zodat de eerder in beeld gebrachte regio opnieuw kan worden gelokaliseerd. Maak in opeenvolgende imagingsessies een foto van de vasculatuur van het verdunde deel van de blootgestelde schedel, wat wordt aangeduid als kaart één. Plaats de muis vervolgens onder de imagingmicroscoop en lokaliseer het verdunde gebied onder het 10 x luchtobjectief.Verplaats met behulp van epifluorescentie het dunste gebied naar het midden van het beeldveld. Voeg nu een druppel zoutoplossing toe aan de bovenkant van de schedel en schakel over naar het 60 x objectief. Selecteer een gebied waar individuele dendritische spines langs de dendrieten duidelijk zichtbaar zijn.Identificeer en label de overeenkomstige regio op kaart één door de vasculatuur in het epifluorescentiebeeld te vergelijken met de foto van de vasculatuur. Stel vervolgens de golflengte van de tweefotonlaser in op basis van de fluoroforen. Neem vervolgens met het 60 x objectief beeldstacks op met stappen van 2 µm langs de Z-as, waarbij een gebied van ongeveer 200 µm bij 200 µm wordt bestreken.Dit wordt aangeduid als kaart twee en wordt gebruikt om het dendritische segment van het beeld te herpositioneren tijdens daaropvolgende beeldsessies. Neem nu negen beeldstacks binnen kaart twee op met een digitale zoom van drie x. Elke beeldstack beslaat een oppervlakte van ongeveer 70 micrometer bij 70 micrometer met stappen van 0,7 micrometer langs de Z-as.Koppel na de beeldvorming voorzichtig de hoofdplaat los van de schedel. Gebruik vervolgens een microsurgisch mesje om de resterende lijm van de schedel te verwijderen. Spoel daarna de schedel en de huid meerdere keren af met zoutoplossing en hecht de hoofdhuid met steriele chirurgische hechtdraad.Houd het dier tijdens het herstel op een warmtemat in een aparte kooi en dien subcutaan buprenorfine als analgeticum toe tegen postoperatieve pijn. Keer na volledig herstel terug naar de thuiskooi. Om de dendrieten op een andere dag opnieuw in beeld te brengen, moet het dier worden geanestheseerd en de schedel worden blootgelegd. Herhaal, zoals voorheen, de immobilisatie van de kop door de hoofdplaat te monteren en deze aan de houdersplaat te bevestigen.Lokaliseer vervolgens het eerder gefotografeerde gebied door het patroon van de vasculatuur te vergelijken met kaart één en het patroon van de dendritische vertakkingen met kaart twee. Als de heropname binnen een week plaatsvindt, kan de dunne laag nieuw gevormd bot met een microschirurgisch mesje worden verwijderd. Als de heropname na meer dan een week plaatsvindt, gebruik dan eerst de microboor en daarna het microschirurgisch mesje om de schedel uit te dunnen.Pas nu de positie en oriëntatie onder de tweefotonmicroscoop aan om beeldstacks te verkrijgen die overeenkomen met de eerder gemaakte beeldstacks. Laat de muis na het vastleggen van de beelden herstellen en plaats deze zoals voorheen terug in de kooi; een afbeelding van het vasculaire patroon rondom het dunne schedelgebied, aangeduid als kaart één, dient als referentie voor alle volgende beeldsessies. Het zwarte kader geeft de regio aan waar de tweefoton in vivo beelden zijn vastgelegd.Deze afbeelding van dendritische vertakkingen in de motorische cortex van een muis van één maand oud is aangeduid als kaart twee. Het witte kader toont het dendritische segment dat voor beeldvorming is geselecteerd. In de loop van de tijd werd tweefoton-beeldvorming uitgevoerd van hetzelfde dendritische segment op dag nul, dag twee, dag vier en dag acht.Nieuwe gevormde spines. Spines die niet aanwezig waren tijdens de vorige beeld acquisitiesessie worden aangegeven met pijlpunten; spines die tussen de sessies zijn verdwenen worden aangegeven met pijlen. Filopodia worden aangegeven met sterren zodra ze zijn gerijpt.Deze techniek kan in één tot twee uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.

Imaging glioom Initiatie<em&gt; In Vivo</em&gt; Door middel van een gepolijst en versterkte Thin-schedel Schedel Window

Source: Pekarek, B. T., et. al., Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021)In this video, we demonstrate the preparation, imaging, and analysis of a cleared mouse brain to examine dendritic arbors, spine morphology, and neuronal distribution using confocal microscopy and 3D reconstruction techniques.

Confocal Microscopy Imaging of Intact Dendritic Arbors and Spine Morphology in a Cleared Mouse Brain

Dit artikel beschrijft een werkprotocol op de foto dendritische stekels van hippocampale neuronen in vitro met behulp van Structured Illumination Microscopy (SIM). Superresolutietechnieken gebruik van SIM biedt beeldresolutie aanzienlijk verder gaan dan het licht limiet diffractie in alle drie ruimtelijke dimensies, waardoor de beeldvorming van individuele vertakte stekels met verbeterde details.

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer twee-fotonmicroscopie voor in vivo beeldvorming van dendritische stekels in de muis hersenschors met een uitgedunde schedel. Deze methode maakt langdurige observatie van synaptische dynamiek mogelijk.

Twee-Photon

Meer video's verkennen