Twee-Photon In vivo Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding
12 mei 2014
Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om transcraniële beeldvorming mogelijk te maken, fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie. De eerste stap na het verdoven van de muis is het uitvoeren van een preparatie met een verdunde schedel. Vervolgens wordt de kop van de muis geïmmobiliseerd met behulp van een op maat gemaakte houdplaat.
Vervolgens worden beeldstacks verkregen door de verdunde schedel met behulp van twee-foton microscopie. Uiteindelijk, herplaatsen en afbeelden. Het eerder afgebeelde gebied maakte het mogelijk om de dynamica van dendritische stekels over verschillende tijdsperioden onder verschillende omstandigheden te volgen.
Om je voor te bereiden op de operatie, verdooft u een muis met ketamine en xylazine en voert u een teenprik uit om volledige verdoving te verzekeren. Plaats vervolgens de muis op een verwarmingskussentje en gebruik een scheermes om het hoofd te scheren. Veeg de huid af met afwisselend alcoholpads om het geschoren gebied te steriliseren en eventuele resterende haarclippings te verwijderen.
Breng ook voorzichtig oogzalf aan op beide ogen. Maak vervolgens een rechte incisie langs de middellijn van de hoofdhuid en beweeg de huid lateraal naar de randen van de schedel. Verwijder vervolgens het bindweefsel dat aan de schedel is bevestigd om de voorbereiding van de verdunde schedel te beginnen.
Identificeer eerst het gewenste beeldvormingsgebied op basis van de relatieve locatie ten opzichte van de middellijn en bgma. Bevochtig vervolgens de schedel met zoutoplossing om de vaatbundels te observeren om te voorkomen dat de schedel wordt verdund in een gebied met grote bloedvaten, omdat deze de lichtpenetratie blokkeren en de beeldafbeeldingen vervagen. Zodra een gebied van 0,5 tot één millimeter diameter is geselecteerd, gebruikt u een hogesnelheidsmicroboor om een cirkelvormig gebied van de schedel te verdunnen.
Beweeg de boor parallel aan het schedeloppervlak in plaats van hem tegen de schedel te houden en naar beneden te drukken om schade door oververhitting te voorkomen. Vermijd langdurig contact tussen de boorkop en de schedel totdat zowel de buitenste compacte botlaag als de middelste sponsachtige botlaag zijn verwijderd. Gebruik vervolgens een microchirurgische mes gehouden op ongeveer 45 graden om de binnenste compacte botlaag in het midden van het door de boor verdunde gebied te verdunnen.
Schraap de schedel zonder naar beneden te drukken totdat een gelijkmatig verdund gebied van 200 tot 300 micrometer diameter met een dikte van ongeveer 20 tot 30 micrometer is verkregen. Zodra de schedel voldoende is verdund, verwijdert u voorzichtig het botafval. De volgende stap is om de kopplaat te bevestigen, die is gemaakt van scheermessen met scherpe randen bedekt met tapes.
Begin met het plaatsen van een kleine druppel cyanoacrylaatlijm op elke rand van de centrale opening van de kopplaat. Centreer vervolgens de kopplaat op het verdunde gebied. Houd het stevig tegen de schedel.
Trek nu voorzichtig de huid van de zijkanten van de schedel naar de randen van de centrale opening van de kopplaat. Houd de kopplaat gedurende één tot twee minuten op zijn plaats. Wacht vervolgens nog eens acht tot negen minuten tot de kopplaat goed aan de schedel is bevestigd.
Na 10 minuten plaatst u de kopplaat op de twee laterale blokken van de houdplaat. Draai vervolgens de schroeven over de randen van de kopplaat vast om de muis op de houdplaat te immobiliseren. Kijk door een dissectiemicroscoop naar het hoofd van de muis terwijl u voorzichtig de rug van de muis polstert om er zeker van te zijn dat het hoofd goed is geïmmobiliseerd.
Spoel vervolgens de blootgestelde schedel af met zoutoplossing om eventuele niet-gepolymeriseerde lijm te verwijderen om het eerder afgebeelde gebied opnieuw te lokaliseren. Neem in volgende beeldvormingssessies een foto van de vaatbundels van het verdunde gebied van de blootgestelde schedel, die map één wordt genoemd. Plaats vervolgens de muis onder de beeldvormingsmicroscoop en lokaliseer het verdunde gebied onder het 10 x luchtobjectief.
Gebruik epifluorescentie om het dunste gebied naar het midden van het zicht te verplaatsen. Voeg nu een druppel zoutoplossing toe aan de bovenkant van de schedel en schakel over naar het 60 x objectief. Selecteer een gebied waar individuele dendritische stekels duidelijk zichtbaar zijn langs dendrieten.
Identificeer en label het overeenkomstige gebied op map één door de vaatbundels te vergelijken tussen de epifluorescente weergave en de vaatfoto. Stem vervolgens de golflengte van de twee-foton laser af op de fluoro vieren. Gebruik vervolgens het 60 x objectief om beeldstacks te verkrijgen met stappen van twee micrometer langs de Z-as, die een gebied van ongeveer 200 micrometer bij 200 micrometer bedekken.
Dit wordt map twee genoemd en wordt gebruikt voor het opnieuw lokaliseren van het beeld van het dendritische segment tijdens volgende beeldvormingssessies. Verkrijg nu negen beeldstacks binnen map twee met behulp van drievoudige digitale zoom. Elke beeldstack bedekt een geschat gebied van 70 micrometer bij 70 micrometer met stappen van 0,7 micrometer langs de Z-as.
Na de beeldvorming verwijdert u voorzichtig de kopplaat van de schedel. Gebruik vervolgens een microchirurgisch mes om de resterende lijm van de schedel te verwijderen. Spoel vervolgens de schedel en de huid meerdere keren met zoutoplossing en naai de hoofdhuid met steriele chirurgische hechtingen.
Tijdens het herstel houdt u het dier op een verwarmingskussen in een aparte kooi en dient u buprenorfine analgeticum subcutaan toe voor postoperatieve pijn. Na volledige herstel brengt u het dier terug naar de thuiskooi. Om dendrieten op een andere dag opnieuw af te beelden, verdooft u het dier en stelt u de schedel bloot. Herhaal zoals eerder de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor transcraniale beeldvorming van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende cortex van muizen met behulp van tweefotonmicroscopie. De preparatie met een verdunde schedel maakt gedetailleerde observatie van structurele reorganisatie in de intacte hersenen over een langere periode mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Synaptische Dynamiek
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische structuren is essentieel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Traditionele beeldvormingsmethoden maken in vivo observatie mogelijkwel niet mogelijk.
- Twee-fotonmicroscopie biedt mogelijkheden voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- De thinned-skull preparatie is een innovatieve benadering voor dergelijke beeldvorming.
Doel van de studie
- Om transcraniale beeldvorming van synaptische structuren in levende muizen mogelijk te maken.
- Om de dynamiek van dendritische spines in de loop van de tijd te observeren.
- Om onderzoek naar structurele reorganisatie in de hersenen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het anesthetiseren van de muis.
- Het uitvoeren van een thinned skull preparatie.
- Het immobiliseren van de kop van de muis met een op maat gemaakte fixatieplaat.
- Het verkrijgen van beeldstacks door de thinned skull met behulp van tweefotonenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van fluorescentie-gelabelde synaptische structuren.
- Vermogen om de dynamiek van dendritische spines in de tijd te volgen.
- Inzichten in structurele veranderingen in de levende cortex van muizen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de thinned-skull preparatie.
Conclusies
- De preparatie van een dun geslepen schedel is een waardevolle techniek voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Twee-fotonmicroscopie maakt gedetailleerde in vivo imaging mogelijk.
- Deze methode kan ons begrip van synaptische dynamiek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Hoge-resolutie two-photon in vivo beeldvorming van dendritische spines in de cortex van de muis maakt directe observatie van synaptische structurele dynamiek over tijd mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij neurobiologisch onderzoek. Deze benadering biedt voorspellend vertrouwen voor targetvalidatie en het onderzoeken van signaalpaden in portfolio's voor geneesmiddelenontwikkeling voor het centraal zenuwstelsel. De reproduceerbaarheid en minimale invasiviteit van de methode faciliteren longitudinale studies die cruciaal zijn voor translationele continuïteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van synaptische remodellering mogelijk, wat inzicht geeft in target engagement en de relevantie van signaalpaden.
- Ondersteunt functionele validatie van mechanismen van synaptische plasticiteit in ziekterelatede neurale circuits.
- Faciliteert mechanische risicovermindering door herhaalde, kwantitatieve beoordeling van de dynamiek van dendritische spines mogelijk te maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd in vivo-systeem voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de synaptische structuur.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs mogelijk die geschikt zijn voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays door identieke dendritische segmenten over meerdere sessies in kaart te brengen en te lokaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen door beeldvorming mogelijk te maken in diverse corticale regio's en celtypen onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
- Faciliteert longitudinale biomarkerstudies door synaptische veranderingen over langere perioden te volgen.
- Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door middel van robuuste, reproduceerbare in vivo metingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit beeldvormingsprotocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen vroege mechanistische studies en translationeel onderzoek binnen CNS-portfolio's.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen en padverduidelijking door directe observatie van synaptische veranderingen mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve beeldata voor de evaluatie van verbindingen in levend neuraal weefsel.
- Analytica: Biedt high-content beeldstacks en kwantitatieve metrieken voor de turnover van spines voor statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Maakt continuïteit mogelijk door herhaalde beeldvorming in hetzelfde dier over verschillende tijdspunten en condities toe te staan.
- Zakelijk hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor diverse CNS-targets, celtypen en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van synaptische targets en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert in vivo imaging-workflows en ondersteunt de reproduceerbaarheid over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door robuuste longitudinale gegevensverzameling mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van CNS-programma's.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in tweefotonmicroscopie en chirurgische technieken voor kleine dieren.
- Vereist toegang tot geavanceerde beeldvormingsinstrumentatie en op maat gemaakte hardware voor hoofdimmobilisatie.
- Necessiteert strikte mapping tussen sessies en standaardisatie voor longitudinale studies.
- Aanpasbaar aan diverse corticale regio's, lagen en celtypen, zoals ondersteund door het protocol.
- Beperkt door de noodzaak van precieze schedelverdunning en mogelijke botterugroei in de loop van de tijd.
