Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen
23 november 2014
We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium (C.M.).
Het algemene doel van het volgende experiment is om echografie en endo microscopie te gebruiken om het angiogenesepotentieel van een groep factoren te illustreren die door kankercellen worden uitgescheiden. Dit wordt bereikt door eerst een plug te implanteren om een tumorachtige omgeving in de muis te genereren in afwezigheid van tumorcellen. Vervolgens worden de dichtheid van de bloedvaten en het percentage van de functionele bloedvaten binnen de plug beoordeeld.
In de laatste stap wordt de morfologie van de bloedvaten gevisualiseerd. Uiteindelijk kan het evenwicht tussen de pro- en anti-angiogene factoren die door de cellen worden uitgescheiden en hun effecten op angiogenesis worden beoordeeld, int, vitaal, en op verschillende tijdstippen door de twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals de conventionele matrigel plug assay, is dat het de analyse van een groep uitgescheiden factoren door de cellen mogelijk maakt, terwijl complementaire intravitale beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt.
Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door F Andra PhD studenten uit mijn laboratorium. Om echografie te gebruiken voor het evalueren van extracellulaire matrix of ECM imitatie gel plug vascularisatie, begint u met het plaatsen van één 1,5 milliliter einor buis bevattend 80 microliters vers bereide geconditioneerde media op ijs. Het lastigste deel van de procedure is het injecteren van het gel zonder bellen met ijskoude punten. Voorzichtig mengen en een langzame injectie zorgen voor een optimale gel toediening.
Gebruik vervolgens ijskoude 1000 microliter punten om 600 microliters ijskoud vier graden Celsius overnacht. Ontdooide ECM imitatie gel in het media, zorg ervoor dat er geen bellen ontstaan. Na bevestiging van sedatie door teen prikken, scheer de buik van elke muis en gebruik een ijskoude één milliliter spuit uitgerust met een 27 gauge naald om langzaam subcutaan te injecteren.
Injecteer de inhoud van één EEND DPH buis per dier. Zodra het hele volume is toegediend, houdt u de naald enkele minuten op zijn plaats totdat versteviging optreedt. Drie weken later, scheer de buikstreek van de muizen opnieuw, verwijder eventueel overtollig haar met ontharingscreme, en bevestig vervolgens de muizen in een rugligging op het podium van de micro manipulator.
Vervolgens vult u een één milliliter spuit uitgerust met een 30 gauge naald met zoutoplossing. Plaats vervolgens de naald in de staarsafvoer. Bevestig de naald stevig en maak de spuit los.
Plaats nu de transducer in het midden van het gewenste scangebied en klik op 3D om de 3D motor stage te initialiseren. Klik op 3D. Voer opnieuw de scanafstand en stapgrootte in en druk op scannen.
Bevestig dat de hele plug is gescand in de 3D beeldgegevens die worden weergegeven. Zo niet, pas de transducer aan zodat de hele plug zichtbaar is en scan het gebied opnieuw zoals zojuist is gedemonstreerd. Selecteer vervolgens contrast en pas de tijdsversterkercompensatie of tgc-bedieningselementen aan om het beeld donkerder te maken, gebruik een flaconmixer om de microbellen 45 seconden te activeren.
Meng vervolgens 50 microliters van de microbellen met 50 microliters zoutoplossing in een één milliliter spuit. Vervang de zoutoplossing bevattende losse spuit door de spuit met de geactiveerde microbellen en injecteer de verdunde microbellen in de staarsafvoer van elke muis. Wacht een paar seconden tot de bellen een stabiele toestand hebben bereikt en klik vervolgens op 3D en selecteer scan om 3D te verkrijgen.
Contrastverbeterde beelden. Klik op gezien een winkel om de beeldgegevens op te slaan, en selecteer vervolgens 3D en vernietig 3D. Om de microbellen te vernietigen, klikt u opnieuw op 3D en selecteert u scan om een post vernietiging cena lus te verkrijgen.
Klik vervolgens op gezien een winkel. Volgende in de referentie-instellingen, klikt u op verwijderen verwijzen, en selecteert u vervolgens studie beheer. Om de pre vernietiging cena lus te openen.
Klik nu op proces cena om een groen contrastoverleg te genereren. Selecteer vervolgens laden in 3D in de echografie beeldvormingssoftware. Klik vervolgens op modus instellingen, klik op volume en selecteer parallel.
Segment vervolgens een reeks contouren om een 3D volume van het doelweefsel te creëren en klik op voltooien om de segmentatie te voltooien. Gebruik fibered confocale endo microscopie om de ECM imitatie gel plug vasculaire morfologie te evalueren door 200 microliters van 10 milligram per milliliter, fit C gelabeld dextran in de staarsafvoer van elk experimenteel dier te injecteren. Maak vervolgens een kleine incisie op ongeveer een centimeter van de plug en plaats de endo microscopie sonde voorzichtig bovenop de plug terwijl de plug intact blijft.
Zodra de sonde op zijn plaats is, gebruikt u de voetpedaal om de laser te starten. Zodra de fluorescentie op het scherm verschijnt, drukt u op selecteren met de voetpedaal om korte films tot 32 lang te verkrijgen tussen films, was de sondetip in een buisje met water. Wanneer het filmen is voltooid, maak de tip schoon met een wattenstaafje om de gemiddelde vaatdiameter te analyseren.
Klik vervolgens op micro vaten detecteren om het venster van de vaatdetectiemodule te openen en klik op voorkeuren. Zorg ervoor dat de gemiddelde vaatdiameter in de statistiek van belang is. Venster en schakel histogramstaven in de weergavemodus zijn gemarkeerd.
Klik op detecteren om de geselecteerde metingen weer te geven. Om de fluorescente signaalintensiteit in de gebieden naast bloedvaten te analyseren, selecteert u cirkel ROI maken en maakt u een cirkel in het gebied van belang. Selecteer ten slotte histogram berekenen binnen ROI om de waarden te berekenen die betrekking hebben op het omcirkelde gebied.
Hier wordt de uitgebreide rekrutering van functionele bloedvaten binnen U 87 mg geconditioneerd medium geladen pluggen onthuld door microbel contrast verbeterde echografie beeldvorming. Omgekeerd, binnen de pluggen die geconditioneerd medium bevatten van inactieve tumor genererende cellen, is de bloedstroom bijna ondetecteerbaar. De morfologie van deze nieuw gevormde bloedvaten wordt verder benadrukt door fibered confocale endo microscopie van de vaten na fit c dextran toediening
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een matrigel-plug-assay om het angiogene potentieel van door kankercellen uitgescheiden factoren te beoordelen met behulp van echografie en endomicroscopie. De methode maakt het mogelijk om de bloedvatdichtheid en morfologie te evalueren in een tumorachtige omgeving die in muizen is gecreëerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Oncologie
- Angiogenese
Achtergrond
- Angiogenese is cruciaal voor tumorgroei en metastasering.
- Het begrijpen van de balans tussen pro- en anti-angiogene factoren is essentieel.
- Traditionele methoden analyseren gesecreteerde factoren mogelijk niet effectief.
- Complementaire beeldvormingstechnieken verbeteren de beoordeling van angiogenese.
Doel van de studie
- Om het angiogene potentieel van door kankercellen uitgescheiden factoren te illustreren.
- Om een matrigel-plug-assay in een muismodel toe te passen.
- Om de dichtheid en functionaliteit van bloedvaten te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Implantatie van een matrigel-plug in muizen om een tumormilieu te simuleren.
- Beoordeling van de bloedvatdichtheid en functionele bloedvaten.
- Visualisatie van de bloedvatmorfologie met behulp van beeldvormingsmodaliteiten.
- Evaluatie van angiogene factoren over een bepaalde tijd.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van een tumor-achtige omgeving in muizen.
- Kwantitatieve beoordeling van de bloedvatdichtheid is bereikt.
- Visualisatie van de morfologie van bloedvaten is aangetoond.
- Inzichten in de balans van angiogene factoren zijn verkregen.
Conclusies
- De matrigel-plug-assay beoordeelt effectief het angiogene potentieel.
- Complementaire beeldvormingsmodaliteiten bieden gedetailleerde inzichten.
- Deze methode vergroot het begrip van de kankercellbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Deze methode stelt biofarmaceutische R&D in staat om het angiogene potentieel van complexe factorpools, uitgescheiden door tumorcellen, te evalueren in een fysiologisch relevante in vivo-omgeving. Door kwantitatieve echografie te combineren met hoge-resolutie endomicroscopie, biedt het mechanistische inzichten in de vasculaire functionaliteit en morfologie, wat bijdraagt aan targetvalidatie en het verminderen van risico's bij angiogenese-modulerende therapeutica. De assay faciliteert een vroege beoordeling van de balans tussen pro- en anti-angiogene factoren, wat helpt bij portfoliobeslissingen en het biologische risico in een laat stadium van oncologische geneesmiddelenontwikkeling verlaagt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de netto angiogene output van pools met uitgescheiden factoren uit kankercellen te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via real-time meting van de bloedvatdichtheid en perfusie in een tumor-mimetische matrix.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door factorensecretieprofielen te correleren met vasculaire fenotypes, wat helpt bij de prioritering van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Prepareert gestandaardiseerde, reproduceerbare biologische systemen voor het screenen van angiogene of anti-angiogene verbindingen met gebruik van geconditioneerde media als input.
- Kwantitatieve outputs: Genereert meetbare eindpunten, waaronder bloedvatdichtheid, percentage functionele vaten en de gemiddelde vatdiameter voor screeningscampagnes van verbindingen.
- Schaalbaarheid & Hergebruik: Ondersteunt longitudinale monitoring op meerdere tijdstippen, wat kinetische analyse en hergebruik van het platform over factorbibliotheken of genetische perturbaties mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de angiogene micro-omgeving van snelgroeiend glioblastoom, wat een translationele brug slaat naar preklinische effectiviteitsstudies.
- Afstemming van biomarkers: Maakt correlatie mogelijk tussen vasculaire morfologie (bijv. lekke, vergrote vaten) en functionele read-outs, wat de ontdekking van translationele biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Faciliteert go/no-go-beslissingen door de angiogene respons in de tijd te kwantificeren, waardoor onzekerheid in de preklinische progressie wordt verminderd.
Integratie van pijplijn en workflow
De assay is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische validatie, en biedt een functionele readout die biochemische en fenotypische screening aanvult.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen door het angiogene potentieel van complexe factor mengsels te onthullen, waardoor effecten op routeniveau in de regulatie van angiogenese worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve vasculaire read-outs (vatdichtheid, functionaliteit) die een betrouwbare vergelijking van testcondities tussen wells of tijdspunten mogelijk maken.
- Analytica: Biedt multimodale gegevens — op ultrasone metingen gebaseerde perfusiemetrieken en morfometrische analyse via endomicroscopie — ter ondersteuning van vergelijkende analyses en structuur-activiteitsrelaties.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro factorsecretie aan in vivo vasculaire uitkomsten, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking tot preklinische validatie met behulp van ziekterelevante vasculaire fenotypes.
- Bedrijfsbrede Herutilisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van angiogene of anti-angiogene activiteit van factor pools, antilichamen of kleine moleculen binnen oncologieprojecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door secretieprofielen van factoren te koppelen aan functionele vasculaire uitkomsten, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de modulatie van angiogenese wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling via reproduceerbare plugvorming, gestandaardiseerde beeldvormingsprotocollen en kwantificeerbare eindpunten over verschillende operators en locaties heen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van kandidaten die zich richten op angiogenese mogelijk te maken, waardoor investeringen in biologisch inactieve benaderingen worden geminimaliseerd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door direct bewijs van angiogene activiteit te leveren, wat de differentiatie tussen pro- en anti-angiogene mechanismen ondersteunt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in in vivo imagingtechnieken, waaronder het hanteren van ultrasone contrastmiddelen en het bedienen van vezeloptische confocale endomicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot hoogfrequente echografiesystemen met 3D-gemotoriseerde tafels en microbel-contrastmiddelen, همچنین endomicroscopieplatforms met mogelijkheden voor fluorescerende dextraanmarkering.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van pluggen, imagingparameters en workflows voor beeldanalyse om reproduceerbaarheid tussen studies te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van het model op verschillende cellijnen, tumortypes of stromale co-culturen om de fysiologische relevantie te behouden.
- Wordt beperkt door het eindpuntkarakter van de assay, waarbij dieren op elk tijdstip moeten worden geofferd, wat longitudinale bemonstering in individuele proefpersonen beperkt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
