Name: Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een matrigel plug-assay om angiogenese door kankercellen te evalueren met behulp van echografie en endomicroscopie in muizen. Deze methode biedt inzicht in bloedvatdichtheid en morfologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Satchi-Fainaro onderzoekslaboratorium wordt gedeeltelijk ondersteund door The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, en door subsidies van de Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) programma: Nanomedicine for Personalized Theranostics, en door The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Universiteit van Tel Aviv Sackler School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Geconditioneerd Mediavoorbereiding <ol><li> Seed 2 x 10 6 U-87 MG cellen in een 10 cm kweek plaat in een volume van 8 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / nystatine oplossing. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C; 5% CO 2 tot stand brengen van volledige samenvloeien op 48 uur. </li><li> Met behulp van een injectiespuit 10 ml, trekken alle medium uit de plaat en filteren door een 0,45 pm filter in een 15 ml buis. </li><li> Zonder de cellen te wassen plaat, voeg 1 ml trypsine-oplossing (0,25%) en incubeer. </li><li> Wanneer alle cellen losgemaakt, inactivatie van het trypsine met ten minste 5 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en voorvormen een celgetal. </li><li<html> &gt; Tel het aantal cellen met een hemocytometer of andere cel-telinrichting en bereken het aantal cellen volgens de telling methode. Opmerking: Het zal later teneinde CM concentratie normaliseren gebruikt. </li><li> Breng de CM een glazen rondbodemkolf en concentreer onder hoog vacuüm roterende verdamper. Om het proces te versnellen, verhogen de badtemperatuur tot 37 ° C, indien gewenst. Ga door tot de CM behaalt een pasta-achtige textuur. </li><li> Resuspendeer de CM van elke cultuur plaat in 400 ul zoutoplossing. Bij gebruik van meer dan één plaat, gebruiken equivalent volume. Bijvoorbeeld voor 2 kweekplaten Gebruik 800 ul. Gebruik elke plaat voor 4 muizen. </li><li> Om verschillende cellijnen of behandelingen vergelijken, het volume volgens de celverhouding ontvangen in stap 1.6. Als bijvoorbeeld een plaat is 1.5x meer cellen, voeg 200 ul van zoutoplossing om de bestaande 400 pl. Dit zal de aangepaste cm </li></ol>titel &quot;&gt; 2. ECM-mimische Gel Plug enting in Muizen <ol><li> Vóór het inenten van de ECM-mimische gel in muizen, de voorbereiding van de volgende materialen: <ol><li> Groeifactoren verlaagde fenolvrij ECM-nabootsende gel (ontdooien nachts, een dag voor het experiment bij 4 ° C op ijs). </li><li> Elektrisch scheerapparaat. </li><li> Ketamine en xylazine om de muizen verdoven. </li><li> Ijskoude 1.000 III steriele tips. </li><li> Ijskoude 1 ml spuit en 27 G naalden. </li></ol></li><li> Bereid je voor op elke muis een 1,5 ml Eppendorf buis met 80 pi aangepast CM en blijf op ijs. </li><li> Aan elke buis, voeg 600 ul ijskoude groeifactoren verlaagde fenolvrij ECM-nabootsende gel overnacht ontdooid bij 4 ° C, op ijs. De ECM-nabootsende gel vloeistof 4 ° C en stolt bij lichaamstemperatuur; om te voorkomen dat de ECM-mimic gel stollen Gebruik ijskoude 1.000 III tips. Meng buizen zorgvuldig zonder de vorming van bellen en te houden op het ijs. </li><li> Verdoven van 6 weken oude BALB / c muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg). Bevestig de juiste verdoving volgens de institutionele verzorging van dieren en het gebruik comité, dat wil zeggen voor het begin van het experiment. Dieren hebben hun juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer ze niet meer reageren op een stevige teen knijpen. </li><li> Scheer de buikstreek van de muizen en desinfecteren met behulp van een chirurgische scrub / alcohol. </li><li> Gebruik een koud 1 ml injectiespuit en een 27 G naald om de inhoud van de Eppendorf buis subcutaan injecteren. Voer de injectie zeer langzaam belvorming te voorkomen. Zodra alle volume wordt toegediend, niet uitwerpen van de naald gedurende enkele minuten, tot stolling optreedt. </li></ol> 3. Evaluatie van de ECM-mimische Gel Plug Vascularisatie met behulp van echografie LET OP: Dit deel van het protocol vereist voorkennis van de exploitatie van een echografie systeem, of de hulp van een erkende technicus. <ol><li> Voordat u begint, hebben de fadat materialen en instrumenten klaar: <ol><li> Elektrisch scheerapparaat. </li><li> Ontharingscrème. </li><li> Ketamine en xylazine om de muizen verdoven. </li><li> Niet-gerichte microbellen. </li><li> Activering apparaat. </li><li> US beeldvormend systeem met een 55 MHz probe 708 en een 3D-acquisitie micromanipulator. </li></ol></li><li> Meet vascularisatie binnen de stekkers drie weken na de inenting: OPMERKING: In de U-87-MG gebaseerd diermodel, werd 3 weken gevonden om het ideale tijdstip voor beeldvorming te vertegenwoordigen. Onder verschillende instellingen, kalibreren vascularization kinetiek vanaf een paar dagen na inoculatie van stekkers. <ol><li> Verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg). Bevestig de juiste verdoving volgens de institutionele verzorging van dieren en het gebruik comité, dat wil zeggen voor het begin van het experiment. Dieren hebben hun juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer ze niet meer reageren op een stevige teen knijpen. </li><li> Scheer deabdominale gebied van de muizen en behandel met ontharingscrème. </li><li> Bevestig de muizen achterover op het podium van de micro-manipulator. </li><li> Met behulp van een 1 ml spuit met zoutoplossing en een 30 G naald, plaats de naald in de staart ader, bevestig de naald stevig vast en draai de spuit. </li><li> Opgezet voor de Contrast 3D-beeld-stand overname sessie: <ol><li> Druk &quot;3D&quot; om de 3D motor stadium initialiseren en plaats de transducer in het midden van het gewenste aftastgebied. </li><li> Druk op &quot;3D&quot; en voer de scan afstand en de stapgrootte, druk dan op &quot;Scan&quot;. </li><li> Zorg ervoor dat de gehele plug werd gescand in de beeldgegevens 3D weergegeven. Zo niet, stel de transducer, zodat de hele stekker is zichtbaar in de scan en herhaal stap 3.5.2. </li><li> Druk op &quot;Contrast&quot; en druk op de tijdwinst compensatie (TGC) stuurt naar links om de afbeelding donkerder te maken. </li></ol></li><li> Activeer de microbellen met een flesje mixer die is desineerd voor de activering van microbellen 45 sec. </li><li> Meng in een 1 ml spuit 50 ui van microbellen met 50 pi zoutoplossing. </li><li> Vervang de-zoutoplossing die losgemaakte spuit met een spuit met geactiveerde microbellen. Spuit de verdunde microbellen in de staartader van de muizen, wacht een paar seconden voor het bellen naar een steady state te bereiken, en vervolgens te verwerven 3D-contrast-versterkte cine lus van de stekker, het gebruik van de 3D-acquisitie motor: <ol><li> Druk op &quot;3D&quot; en selecteer &quot;Scan&quot; om 3D-contrast-versterkte beelden te verwerven en vervolgens op &quot;Cine Store&quot; om het beeld op te slaan. </li><li> Druk op &quot;3D&quot; en klik op &quot;Destroy 3D&quot; om de microbellen vernietigen. </li><li> Druk op de &quot;3D&quot; opnieuw en selecteer &quot;Scan&quot; om een ​​post-vernietiging cine lus verwerven, druk dan op &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Genereren van de overlay-afbeelding frames pre- en post-vernietiging van microbellen: <ol><li> In de &amp;# 8220; Reference Instellingen &quot;aan de linkerzijde van het scherm klikt u op&quot; Create Reference &quot;. </li><li> Druk op &quot;Studie Management&quot; aan de pre-vernietiging cine lus verworven openen. </li><li> Klik op &quot;Proces Cine&quot; om de groene contrast overlay genereren en klik op &#39;laden in 3D &quot;. </li></ol></li><li> Gebruik de Amerikaanse imaging software om de resulterende 3D-beeld voor het bloedvolume in de pluggen te kwantificeren: <ol><li> Druk op &quot;Scan / Freeze&quot; en vervolgens op &quot;Mode instellingen&quot;. </li><li> Klik op &quot;Volume&quot; en selecteer &quot;Parallel&quot;. </li><li> Een 3D-volume van het doelweefsel door segmentering een reeks contouren. </li><li> Klik op &quot;Finish&quot; om de segmentatie te voltooien. OPMERKING: Het volume van het contrastmiddel wordt op de linker kant van het scherm worden weergegeven. </li></ol></li><li> Aan het einde van de procedure, plaats muizen in een warme, schone, droge en rustige omgeving, weg vanandere dieren. Zorgen voor warmte met behulp van een in de handel verkrijgbaar chirurgische verwarming pad of een gloeilamp (50-75 watt), geplaatst 12-14 centimeter afstand van knaagdieren. Monitor muizen continu tot het handhaven van een rechte houding en normaal lopen. </li></ol></li></ol> 4. Evaluatie van de ECM-mimische Gel Plug vaatstelsel morfologie behulp Fibered confocale endomicroscopy LET OP: dit deel van het protocol wordt uitgevoerd onmiddellijk na de Amerikaanse beeldvorming en het vereist voorkennis van de bediening van de fibered confocale endomicroscopy imaging-systeem, of de hulp van een erkende technicus. <ol><li> Voordat u begint, moet u de volgende materialen en instrumenten klaar: <ol><li> Chirurgie tools zoals een tang, schaar en absorbeerbare naaigaren. </li><li> FITC-geconjugeerd dextraan (70 KDa). </li><li> Ijkoplossingen (drie buisjes met elk waterstofperoxide, water of TL-oplossing). </li><li> Het beeldvormingssysteem en eenprobe geschikt voor beeldvorming van bloedvaten volgens fabrikant. </li></ol></li><li> Verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg). </li><li> Dien iv, via de staartader, 200 ui 10 mg / ml FITC-gelabelde dextran. </li><li> Ontsmet de buikstreek met behulp van een chirurgische scrub / alcohol en een kleine incisie van toepassing op ongeveer 1 cm van de stekker. </li><li> Plaats de endomicroscopy sonde boven de plug voorzichtig terwijl de stekker intact. </li><li> Acquisitie: <ol><li> Zodra de sonde is ingesteld op de stekker, drukt u op &quot;Start laser&quot; met behulp van het voetpedaal. De fluorescentie moet worden getoond op het scherm. </li><li> Verwerven korte films (tot 30 sec) door op &#39;Record&#39; op het scherm of &#39;Select&#39; met behulp van het voetpedaal. </li><li> Tussen films, was de sonde door het plaatsen van de tip in een buis met water. </li><li> Wanneer u klaar bent, verwijdert u de sonde en het reinigen van de tip met een wattenstaafje. </li></ol></li><li> Te analyseren gemiddelde veSSEL diameter: <ol><li> Klik op het pictogram &quot;Detect microvessels&quot; in het bovenste paneel om het schip detectie module te openen. </li><li> Klik op &quot;Voorkeuren&quot; en markeer &quot;Mean vatdiameter&quot; in de &quot;Statistiek van belang&quot; en &quot;Display histogrambalken&quot; in de &quot;Weergavemodus&quot;. </li><li> Klik op &quot;Detect&quot; om de geselecteerde metingen weer te geven. </li></ol></li><li> Om het fluorescentiesignaal intensiteit grenzend aan bloedvaten geanalyseerd: <ol><li> Klik op &quot;Create cirkel ROI&quot; in het linkerpaneel en maak een cirkel in het gebied van belang. </li><li> Klik op &quot;Compute histogram binnen ROI&quot; om de waarden met betrekking tot deze regio te berekenen. </li></ol></li></ol> 5. Postprocedurele Behandeling van Muizen <ol><li> Aan het einde van elke imaging procedure, plaats muizen in een warme, schone, droge en rustige omgeving, weg van andere dieren. Zorgen voor warmte met behulp van een in de handel eenvailable chirurgische verwarming pad of een gloeilamp (50-75 W), geplaatst 12-14 in de buurt van knaagdieren. Monitor muizen continu tot het handhaven van een rechte houding en normaal lopen. </li><li> Voor verdere analyse van vascularisatie pluggen &#39;op extra tijd punten, gelden de volgende herstel voorwaarden: <ol><li> Hechten de kleine incisie met behulp van absorbeerbare hechtingen. </li><li> Geef muizen analgesie zoals buprenorfine (1 mg / kg) subcutaan en terugkeren naar individuele kooien. </li><li> Neem alle dieren om te bepalen of verdere pijnstillende behandeling nodig is en re-evalueren dagelijks te volgen en te beoordelen voor nood. </li></ol></li><li> Aan het eindpunt van het experiment, inslapen muizen door eerst isofluraan, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Als aanvullende beeldvorming in de weken na de eerste beeldvormende stappen worden uitgevoerd, moeten alle procedures zo steriel mogelijk gehouden. Een chirurgische huid scrub moet worden uitgevoerd, steriel water en steriele wattenstaafjes worden gebruikt om de endomicroscopy probe reinigen, en de probe wordt gedesinfecteerd tussen elk dier met steriel water. </li></ol>

<ol><li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth%3A+an+in+vivo+Matrigel+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li>
<li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane%2C+heparin%2C+and+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+assays%3A+a+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li>
<li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+cytometry%3A+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li>
<li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Compelmentaire beeldvormende methoden maakt het verwerven van informatie over verschillende angiogenese componenten &#39;microvessel dichtheid, functionaliteit en morfologie. Loading CM on ECM-nabootsende gel pluggen genereert een tumor micro-omgeving, die gescheiden is van andere celpopulaties, zoals endotheelcellen, die worden gerekruteerd en extravaseren in de plug. Door het uitvoeren, in parallel, microbellen contrast-versterkte Amerikaanse beeldvorming en Fibered confocale endomicroscop...

De Matrigel plug angiogenese assay werd eerst beschreven door Kibbey et al. In 1992, waar het gebruikt werd om angiogenese stimulatie evalueren van de peptide SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. In tegenstelling tot andere in vivo angiogenese assays, zoals de muis corneale angiogenese of kuiken chorioallantoïsmembraan assays deze test is relatief gemakkelijk uit te voeren 2. De geïnjecteerde ECM-nabootsende gel cellen pro-angiogene en anti-angiogene verbindingen en / of factoren bevatten. Bij de beoordeling van de activiteit van een anti-angiogene samenstelling, de plug bevat gewoonlijk een mengsel van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor (FGF), en de anti-angiogene stof direct in de stekker of systemisch 3 worden toegediend 4. De ECM-nabootsende gel wordt subcutaan geïnjecteerd waar het stolt binnen minuten. Beoordeling van recruitment bloedvat in de resulterende plug is typically uitgevoerd door het meten van hemoglobine niveaus binnen de stekker, met behulp van fluorescentie signaal meting na injectie van fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) gelabelde dextran, door immunokleuring van histologie secties voor endotheel-specifieke markers of door fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) 2,5, 6. Echter, deze beoordeling staat alleen eindpunt analyse en mist over de functionaliteit en morfologie van bloedvaten. Bovendien metingen van plasmavolume, hetzij door hemoglobinewaarden of met dextran-FITC als indicator, misleidend omdat inhoud bloed wordt beïnvloed door de grootte van de bloedvaten en de omvang van stilstaand plassen bloed. Dit is vooral belangrijk wanneer de aangeworven vaatstelsel wordt gekenmerkt door verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect 7. Wij stellen hierin een nieuwe, nauwkeuriger, methode voor het visualiseren van de aangeworven bloedvaten door het combineren van twee complementaire beeldvormende modaliteiten. High resolutie microbellen contrast-versterkte ultrageluid (US) gecombineerd met intravitale fibred-confocale endomicroscopy kan informatie niet alleen bloedvat dichtheid, maar ook van hun morfologie en functionaliteit. Bovendien kan deze analyse worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen waardoor het mogelijk controle van angiogenese kinetiek. VS is een veel gebruikte beeldvormingstechniek die een hoge ruimtelijke resolutie voor bloedvaten beeldvorming na intraveneuze (iv) injectie van microbellen die uitsluitend blijven de vasculaire compartiment 8-11 bezit. De microbellen zijn met gas gevulde microbellen die een sterke echogeen signaal te produceren wordt opgewekt met een Amerikaanse puls en dus dienen als een goede contrastmiddel. 3D-beelden van de stekker worden verkregen met behulp van de Amerikaanse imaging systeemsoftware volgende microbellen vernieling. De resulterende beelden zijn opgebouwd uit beeldframes vóór en na vernietiging van microbellen en weerspiegelen het verschil in video intensiteit van kleur. Deze overlaybeelden worden automatisch door de software. Bijgevolg kan het percentage van functionele schepen binnen de stekker worden gekwantificeerd. Hoge resolutie Fibered confocale endomicroscopy dient als een aanvullende beeldvormende modaliteit door de rapportage over de bloedvaten morfologie. In deze minimaal invasieve methode, worden de beelden verkregen na intraveneuze toediening van FITC-geconjugeerd dextran 12. De fluorescerende polymeer verft de bloedbaan en dus dient als een &#39;contrastmiddel&#39; voor bloedvaten morfologie en de doorbloeding. Aangezien de geïnjecteerde polymeer op een formaat van 70 KDa, kan slechts lekkende vaten zoals in tumorvasculatuur steken. Dit resulteert in hoge achtergrond van de FITC-gelabelde dextran buiten de bloedvaten. Bijgevolg kan Fibered confocale endomicroscopy worden gebruikt om de typische kenmerken van de EPR-effect te visualiseren in de tumor neovasculature- vergroot, lekkende, zeer verwarde schepen, met stompe uiteinden. Dit systeem model werd described in de vergelijking van de angiogene potentieel van U-87 MG humane glioblastoma en slapende kloon 13. Vascularisatie binnen de stekkers werd geëvalueerd drie weken na de ECM-mimische gel inenting. Er werd aangetoond dat de vascularisatie binnen stekkers met CM U-87 MG snel groeiende tumor genererende cellen was significant verhoogd in aantal, dichtheid en functionaliteit in vergelijking met vascularisatie binnen stekkers met CM van de slapende tumor genererende cellen. Derhalve waren de auteurs concluderen dat CM geïsoleerd uit U-87 MG snel groeiende tumor genererende cellen bevat hogere niveaus van pro-angiogene factoren, vergeleken met de CM van slapende tumor genererende cellen. Deze factoren stimuleren de vorming van functionele bloedvaten door actief die alle stappen van de angiogene cascade (dwz proliferatie, kiemen, migratie en tenslotte vorming van buisvormige structuren van endotheelcellen).

<table><tbody><tr><td>Rotary Vacuum Evaporator</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>FAL356231</td><td>Ontdooi een nacht, bij 4 &deg;C op ijs</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vevo2100 US imaging system</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>Vereist voorkennis in het bedienen of de hulp van een erkende technicus</td></tr><tr><td>55 MHz 708 probe</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vevo2100 imaging software</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>VialMix</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>VMIX</td><td>-</td></tr><tr><td>DEFINITY microbubbles</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>DE4</td><td>Activeer gedurende 45 seconden met VialMix voor gebruik</td></tr><tr><td>CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>Vereist voorkennis in het bedienen of de hulp van een erkende technicus</td></tr><tr><td>ProFlex MiniO/30 probe</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>70 kD FITC-labeled dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageCell software</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Calibration Kit</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Gibco Life Tecchnologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin/nystatin solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door snelgroeiende tumor genererende cellen

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

De subcutane Matrigel plug bij muizen is een voorkeursmethode voor de in vivo evaluatie van pro- en anti-angiogene factoren. In deze werkwijze worden gewenst factoren geïntroduceerd in koude vloeistof ECM-nabootser gel na subcutane injectie, stolt tot een omgeving nabootsen van kanker milieu vormen. Deze matrix maakt de penetratie van gastheercellen, zoals endotheliale cellen, en derhalve de vorming van bloedvaten. Hierin stellen we een nieuwe gewijzigde Matrigel plug assay die kan worden benut angiogene potentieel van een pool factoren uitgescheiden door kankercellen illustreren, in plaats van een specifieke factor (bijvoorbeeld bFGF en VEGF) of middel. De plug met ECM-mimische gel wordt gebruikt om de gastheer (muizen) te introduceren met een pool van gesekreteerd aan de CM van snelgroeiende tumor genereren glioblastoma cellen. We hebben eerder beschreven uitgebreide vergelijking van de angiogene potentieelU-87 MG humane glioblastoma en slapende afgeleide kloon in dit systeemmodel, met geïnduceerde angiogenese in de U-87 MG oudercellen. De CM wordt bereid door het filteren van verzamelde media uit samenvloeiende weefselkweek platen van beide cellijn na 48 uur incubatie. Vandaar, het bevat slechts factoren uitgescheiden door de cellen, zonder de cellen zelf. Hier beschreven is de combinatie van twee beeldvormende modaliteiten, microbellen contrast-versterkte echografie en intravitale fibered-confocale endomicroscopy, voor een accurate, real-time karakterisering van de omvang, de morfologie en functionaliteit van de nieuw gevormde bloedvaten in de stekkers.

Implanteren van ECM-mimische gel stekkers met CM uit snelgroeiende angiogene tumor genereren cellijn U-87 MG, resulteert in een uitgebreide angiogenese. Dit vaatstelsel kan uitgebreid worden onderzocht met behulp van twee complementaire beeldvorming. Microbellen contrast-versterkte Amerikaanse beeldvorming onthult uitgebreide werving van functionele bloedvaten in de plug door het illustreren uitgebreide bloedstroom binnen U-87 MG CM geladen stekkers, in tegenstelling tot niet-detecteerbare b...

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium (C.M.).

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om echografie en endomicroscopie te gebruiken om het angiogene potentieel van een verzameling factoren te illustreren die door kankercellen worden uitgescheiden. Dit wordt bereikt door eerst een plug te implanteren om een tumorachtige omgeving in de muis te creëren in afwezigheid van tumorcellen. Vervolgens worden de bloedvatdichtheid en het percentage functionele bloedvaten binnen de plug beoordeeld.In de laatste stap wordt de morfologie van de bloedvaten gevisualiseerd. Uiteindelijk kan de balans tussen de pro- en anti-angiogene factoren die door de cellen worden uitgescheiden en hun effecten op angiogenese in vivo worden beoordeeld op verschillende tijdstippen met behulp van de twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de conventionele matrigel-plug-assay, is dat het de analyse mogelijk maakt van een pool van door cellen uitgescheiden factoren, terwijl er gebruik wordt gemaakt van complementaire intravitale beeldvormingsmodaliteiten.Deze procedure wordt gedemonstreerd door F Andra, promovendi uit mijn laboratorium. Om echografie te gebruiken voor het evalueren van de vascularisatie van een extracellulaire matrix of ECM-mimic gelplug, begint u met het plaatsen van één 1,5 milliliter eppendorfbuisje met 80 µL vers bereid geconditioneerd medium op ijs. Het meest uitdagende deel van de procedure is het injecteren van de gel zonder luchtbellen met ijskoude tips. Voorzichtig mengen en een langzame injectie zorgen voor een optimale toediening van de gel.Meng vervolgens met ijskoude 1000 µL tips 600 µL ijskoude (4 °C) overnacht ontdooide ECM-mimic gel in het medium, waarbij u erop let dat er geen bellen ontstaan. Nadat de sedatie via een knijptest bij de teen is bevestigd, scheert u de buik van elke muis en gebruikt u een ijskoude spuit van 1 mL, voorzien van een naald met maat 27 G, om langzaam subcutaan te injecteren.Inject de inhoud van één EEND DPH-buis per dier. Zodra het volledige volume is toegediend, houdt u de naald enkele minuten op zijn plaats totdat stolling optreedt. Drie weken later scheert u het buikgebied van de muizen opnieuw, verwijdert u eventueel resterend haar met ontharingscrème en fixeert u de muizen vervolgens in rugligging op de tafel van de micromanipulator.Vul vervolgens een spuit van één milliliter, uitgerust met een naald van gauge 30, met fysiologische zoutoplossing. Plaats daarna de naald in de staartvene. Zet de naald stevig vast en maak de spuit los.Plaats nu de transducer in het midden van het gewenste scangebied en klik op 3D om de 3D-motortafel te initialiseren. Klik op 3D. Voer vervolgens opnieuw de scandistantie en stapgrootte in en druk op scan.Bevestig dat de gehele plug is gescand in de weergegeven 3D-beeldgegevens. Zo niet, pas dan de transducer aan zodat de gehele plug zichtbaar is en scan het gebied opnieuw zoals zojuist gedemonstreerd. Selecteer vervolgens contrast en pas de tijdgaincompensatie of tgc-regelaars aan om het beeld te verdonkeren; gebruik een vialmixer om de microbubbels 45 seconden te activeren.Meng vervolgens 50 µL van de microbubbels met 50 µL fysiologische zoutoplossing in een spuit van 1 mL. Vervang de spuit met fysiologische zoutoplossing door de spuit met de geactiveerde microbubbels en injecteer de verdunde microbubbels in de staartвена van elke muis. Wacht enkele seconden tot de bubbels een stabiele toestand hebben bereikt, klik vervolgens op 3D en selecteer scan om de 3D-opname te maken.Contrastversterkte beelden. Klik op 'save' om de beeldgegevens op te slaan, en selecteer vervolgens '3D' en 'destroy 3D'. Om de microbellen te vernietigen, klikt u opnieuw op '3D' en selecteert u 'scan' om een cine-loop na destructie vast te leggen.Klik vervolgens opnieuw op de winkel. Klik daarna in de referentie-instellingen op 'referentie maken' en selecteer vervolgens studiebeheer om de loop voor pre-destructie cena te openen.Klik nu op process cena om een groene contrastoverlay te genereren. Selecteer vervolgens load into 3D in de echografie-software. Klik daarna op mode settings, klik op volume en selecteer parallel.Segmenteer vervolgens een reeks contouren om een 3D-volume van het doelweefsel te creëren en klik op finish om de segmentatie te voltooien. Om met vezelconfocale endomicroscopie de vasculatuurmorfologie van de ECM-mimic gelplug te evalueren, injecteert u 200 µL van 10 mg/mL FITC-gelabelde dextran in de staartvene van elk proefdier. Maak vervolgens een kleine incisie op ongeveer één centimeter van de plug en plaats de endomicroscopie-probe voorzichtig bovenop de plug, terwijl u de plug intact houdt.Zodra de probe is geplaatst, gebruikt u het voetpedaal om de laser te starten. Zodra de fluorescentie op het scherm verschijnt, drukt u met het voetpedaal op select om korte en tot 32 lange films op te nemen; spoel tussen de films door de probe-tip af in een buisje met water. Wanneer de opname is voltooid, reinigt u de tip met een wattenstaafje om de gemiddelde vatdiameter te analyseren.Klik vervolgens op detect micro vessels om het venster van de module voor vaatdetectie te openen en klik op preferences. Zorg ervoor dat mean vessel diameter in het venster statistic of interest en display histogram bars in de display mode zijn aangevinkt.Klik op detecteren om de geselecteerde metingen weer te geven. Om de fluorescentiesignaalintensiteit in de gebieden naast de bloedvaten te analyseren, selecteert u 'cirkel ROI maken' en maakt u een cirkel in het gebied van interesse. Selecteer ten slotte 'histogram binnen ROI berekenen' om de waarden voor het omcirkelde gebied te berekenen.Hier wordt de uitgebreide rekrutering van functionele bloedvaten binnen plugs geladen met U 87 mg geconditioneerd medium onthuld door microbel-contrastversterkte echografie. Omgekeerd is de bloedstroom binnen de plugs die geconditioneerd medium van slapende tumorgenererende cellen bevatten, nagenoeg ondetecteerbaar. De morfologie van deze nieuw gevormde bloedvaten wordt verder benadrukt door vezelconfocale endomicroscopie van de vaten na toediening van fit c dextran, zoals aangetoond in deze representatieve beelden; let op hoe de bloedvaten binnen de plugs geladen met het U 87 mg geconditioneerd medium een typische lekkende, stomp-eindige, vergrote vaatmorfologie vertonen.De vergrote en sterk vervlochten bloedvaten vertonen daarnaast een niet-continue en trage stroom, en er is lekkage van bloed waarneembaar in het omliggende gebied, wat wordt aangetoond door het sterke fluorescente signaal buiten de bloedvaten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen enkele uren op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd om de kinetiek van de angiogenese te optimaliseren.

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een buis formatie test wordt gebruikt om de vasculaire activiteit van tumorcellen te evalueren.

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.

In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

Door het gebruik van transgene reportermuizen en injecteerbare fluorescerende labels, maakt langdurige intravitale spinning disk confocale microscopie directe visualisatie mogelijk van het gedrag van myeloïde cellen in darmadnomen in het ApcMin/+ colorectaal kankermodel.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.

Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Leer een matrigel plug-assay om angiogenese door kankercellen te evalueren met behulp van echografie en endomicroscopie in muizen. Deze methode biedt inzicht in bloedvatdichtheid en morfologie.

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen (Video) | JoVE Journal

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

Meer video's verkennen