Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd

Het algemene doel van het volgende experiment is om aan te tonen waar een specifiek gen tot expressie komt binnen een intact embryo. Dit wordt bereikt door in een tweede stap het RNA dat gelokaliseerd moet worden, in situ in het embryo te fixeren. Een antisense RNA-probe die specifiek is voor het gen van interesse wordt gehybridiseerd met het doel-RNA binnen het embryo.

Deze probe bevat een epitoop, gewoonlijk digoxenine, dat vervolgens gedetecteerd kan worden. Vervolgens wordt een antilichaam dat gekoppeld is aan alkalische fosfatase gehybridiseerd met het epitoop op de RNA-probe, gevolgd door het gebruik van een colorimetrische kleuring. Om te visualiseren waar het RNA zich in het embryo bevindt, worden resultaten verkregen die precies laten zien waar het gen van belang tot expressie komt, op basis van de kleurreactie en de kennis van de anatomie van het embryo.

Het belangrijkste voordeel van het protocol van ons instituut ten opzichte van bestaande protocollen is dat het sneller is en minder reagentia gebruikt, zonder enig merkbaar kwaliteitsverlies. Deze methode kan cruciale vragen in de embryologie beantwoorden, zoals hoe weefsels worden gespecificeerd en gevormd. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de ontwikkeling van opus, kan deze ook worden toegepast op veel andere kleine embryo's, zoals die van zebravisjes en vroege muisembryo's.

We zijn aanvankelijk gestart met de ontwikkeling van deze methoden omdat de oorspronkelijke methoden zeer tijdrovend waren, en we zijn gaan experimenteren met het weglaten van Ed-stappen om de efficiëntie van de procedure te verhogen zonder de kwaliteit in gevaar te brengen. De fixatie van embryo's wordt in fasen uitgevoerd. Bereid eerst de glazen vials voor die voor alle stappen worden gebruikt, inclusief de uiteindelijke opslag van embryo's, om monitoring van de embryo's tijdens alle stappen van het proces mogelijk te maken.

Gebruik heldere vials met een goede Teflon-afdichting in de dop; label de vials met een permanente marker met de juiste experimentele informatie. Bedek het label met transparante plakband om te voorkomen dat de etikettering tijdens de procedure verloren gaat. Vanwege het gebruik van alcoholen en andere oplosmiddelen dient de MFA-fixatieoplossing te worden bereid zoals beschreven in de protocoltekst.

Vul elk gelabeld glazen flaconnetje met drie tot vier milliliter van de MFA-oplossing. Bewaar een oplossing van 100% methanol bij minus 20 graden Celsius. Maak een gesleten glazen pipette en gebruik deze om embryo's over te brengen naar de glazen flaconnetjes die Memphis-oplossing bevatten voor fixatie.

Voeg de embryo's toe met een minimale overdracht van vloeistof uit het embryo-medium. Fixeer maximaal 20 tot 30 embryo's per vial. Laat de embryo's gedurende twee uur bij kamertemperatuur in Memphis-oplossing rusten op een schudmaaier.

Na voltooiing van de paraformaldehydefixatie wordt de Memphis-oplossing vervangen door ongeveer vier milliliter 100% methanol bij -20 °C voor de bewaring van de embryo's. Laat de DNA-water-NTP-mix en de polymerasebuffer opwarmen tot kamertemperatuur voordat de reactie voor de probesynthese wordt samengesteld. Een van de meest kritische stappen voor het succes van deze procedure is het correct samenstellen van de probereactie.

Stel de reactie voor de probesynthese samen bij kamertemperatuur. Voeg de volgende componenten in deze volgorde toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter: template-DNA, water bijgevuld tot een volume dat het totale reactievolume op 20 microliters brengt, NTP-mix, RNA-inhibitor, RNA-polymerase-buffer en RNA-polymerase. Incubeer de transcriptiereactie gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.

Incubaties die iets langer dan twee uur duren, hebben geen nadelige effecten, maar vertonen ook weinig verhoging van de opbrengst; bij incubatie gedurende één uur zal de opbrengst afnemen, hoewel deze nog steeds voldoende is om een goede probe te maken. Wanneer de transcriptiereactie voltooid is, neem dan één microliter van het reactiemengsel af om dit te controleren op een 1% agarose TAE-gel, en voeg de resterende reactiemix toe.

Voeg 80 µL 1% SDS in TE-buffer, 10 µL vijf molar ammoniumacetate en 220 µL koude ethanol toe. Vortex het mengsel krachtig en zet het op ijs tot de resultaten van de RNA-kwaliteitscontrole bekend zijn. Nadat water en standaard laadkleurstof zijn toegevoegd aan de ene µL RNA die vóór de precipitatie is weggenomen, wordt het RNA gescheiden op een 1% agarose TAE-gel met ethidiumbromide.

Bekijk het met ethidiumbromide gelabelde RNA op de gel met een UV-transilluminator om de kwaliteit van de probe te controleren. Er moet een enkele band zichtbaar zijn zonder uitsmering erboven of eronder. Zodra de kwaliteit van het RNA is geverifieerd, wordt het resterende RNA dat op ijs was gezet, neergeslagen door dit 10 tot 15 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge te centrifugeren.

Verwijder het supernatant met een glazen pipette en laat het RNA kortstondig drogen. Vervolgens wordt de probe resuspendeerd in RNA-hybridisatiebuffer en bewaard in een polystyreen schroefnaaldbuis van 15 milliliter bij -20 °C. Om met deze procedure te beginnen, haalt u de embryo's die bewaard zijn in methanol bij -20 °C uit de vriezer en laat u ze opwarmen tot kamertemperatuur.

De gehele procedure wordt in glazen vials uitgevoerd. Als verschillende embryo's van één groep met verschillende probes onderzocht gaan worden, houd ze dan in een enkele vial tot vlak voordat de probes worden toegevoegd. Om de variabiliteit en de arbeid op de eerste dag ter voorbereiding op de toevoeging van de probe te verminderen, worden de embryo's gerehydrateerd via een methanolserie zoals beschreven in deze tabel; gebruik glazen pipetten om elke oplossing voorzichtig te verwijderen en toe te voegen, aangezien de embryo's tijdens deze stap gemakkelijk beschadigd kunnen raken.

Controleer bij het overbrengen van de vloeistoffen de binnenkant van de doppen om er zeker van te zijn dat er geen embryo's zijn blijven plakken. Draai de embryo's na elke stap voorzichtig rond om te voorkomen dat ze aan de wanden of aan elkaar kleven. Schud de embryo's door de vials op een rotator te plaatsen; voorafgaand aan het gebruik moeten de RNA-hybridisatiebuffer en de probe worden voorverwarmd tot 65 °C.

Hybridiseer de embryo's gedurende de nacht in de sonde-oplossing bij 65 °C onder voortdurend schudden. Verwijder de volgende dag de sonde-oplossing en bewaar deze in een polystyreen schroefnaaldbuisje van 15 ml, voorzien van de datum en het aantal keer dat de sonde is gebruikt. Bewaar de sonde-oplossing bij -20 °C.

Zodra de probe is verwijderd, bereidt u de embryo's voor op antilichaamskleuring tegen de probe via een reeks wasstappen zoals hier beschreven; pas de temperatuur naar behoefte aan door de mutator met de bevestigde vials embryo's direct in hybridisatieovens te plaatsen die op de juiste temperatuur zijn ingesteld. Terwijl de embryo's worden geïncubeerd in de blokkeringsoplossing, bereidt u het juiste volume blokkeringsoplossing plus anti-D dig-antilichaam voor, zodat het antilichaam wordt geblokkeerd voordat het aan de embryo's wordt toegevoegd. Incubeer de embryo's overnight in de antilichaamoplossing met schudden bij vier graden Celsius op de volgende dag.

Verwijder de antilichaamsoplossing en was met mab, een oplossing die maleïnezuur en natriumchloride bevat. Voer ten minste 1230 minuten aan wasbeurten uit bij kamertemperatuur onder schudden. Vervang de laatste wasoplossing door het alkalische fosfatasesubstraat.

Voer de kleuringsreactie uit bij kamertemperatuur met schudden gedurende de nacht op de volgende dag. Stop de kleuringsreactie en bereid de embryo's voor op bewaring en beeldvorming door de vloeistoffen te vervangen zoals beschreven in deze tabel. Fixeer de kleuring na rehydratatie van de embryo's gedurende 30 minuten met MFA.

Verwijder na fixatie de MFA en was de embryo's met 25% methanol. Indien de verwijdering van endogeen pigment vereist is, verwijder dan de 25% methanol en voeg de bleekoplossing toe. Houd het bleekproces nauwlettend in de gaten aangezien dit relatief snel verloopt; de mate van bleking kan worden gevarieerd voor verschillende effecten.

Voor langdurige bewaring worden embryo's gedehydrateerd via een methanolserie tot 100% methanol; na het bleken voor kortstondige bewaring en daaropvolgende beeldvorming worden de embryo's overgebracht naar PBS. Ongeklaarde embryo's kunnen het beste worden bekeken en afgebeeld tegen een achtergrond van 1% aros. Om de aros-oplossing te bereiden, wordt aros aan water toegevoegd en tot kookpunt gebracht totdat het aros is opgelost. Nadat het aros is afgekoeld tot 50 degrees Celsius, wordt het in een Petrischaal gegoten tot een diepte van ongeveer twee millimeter.

Zodra de aros-schaal gereed is, plaatst u de niet-geklaarde embryo's in de schaal en gaat u over tot beeldvorming. De aros zorgt voor een blauwgrijze achtergrond die goed contrasteert met het embryo en de blauwe kleur van de kleuringsreactie. Het helpt bovendien om storende schaduwen en reflecties te diffunderen, waardoor de aandacht niet van het embryo wordt afgeleid bij het maken van beelden vanuit alternatieve hoeken, zoals vanaf de ventrale zijde.

Gebruik een fijne pincet om inkepingen in de aros te maken zodat het embryo past. Plaats de embryo's in deze kanalen voor de oriëntatie. Wees voorzichtig bij het manipuleren van de embryo's, aangezien ze gemakkelijk beschadigd raken.

Gebruik de glasvezellichtbron om het embryo vanuit een flauwe hoek te belichten, waardoor er schaduwen op het embryo ontstaan die diepte aan het beeld geven en helpen bij het onderscheiden van oppervlaktestructuren, aangezien bleken pigment kan verwijderen dat nuttige oriëntatiepunten biedt. Gebruik schaduwwerking voor sterk gebleekte embryo's. Geklaarde embryo's worden gebruikt om kleuringen vast te leggen die diep in het embryo liggen, zoals in de navelstreng, de longen of regio's van de hersenen.

In dit protocol worden verschillende graden van bleken gebruikt om kleuring in het embryo te visualiseren. Als de kleuring sterk is, maakt een lichtere bleking, waarbij enige pigmentatie overblijft, een betere stadiëring en oriëntatie van het embryo mogelijk. Echter, als de kleuring zich bevindt in een gebied met een hoge mate van pigmentatie, zoals de nier, geeft een intensere bleking een beter resultaat.

Manipulatie van de ARO-basis kan helpen bij de oriëntatie van het embryo. Door bijvoorbeeld een fijn kanaal in de aros te snijden, kan een embryo in het kikkervisjestadium dat op zijn zij ligt, vanuit de ventrale zijde worden bekeken met voldoende stabiliteit om een goede afbeelding vast te leggen. Dit embryo werd in een klein gaatje geplaatst dat de positie stabiliseerde met de ventrale zijde naar boven, waardoor het expressiepatroon van het gen van belang volledig kon worden bekeken.

Interne organen kunnen worden bekeken in zowel niet-geklaarde als geklaarde embryo's in een niet-geklaard opaak embryo dat is gekleurd voor PAX2. In stadium 34 kunnen de optic stalk en de neurale buis worden gevisualiseerd. De details zijn echter niet scherp. Door het embryo te klaren, worden de grenzen van de expressieplaatsen, inclusief de optic stalk, scherper.

De mate van transparantie wordt aangetoond door het feit dat beide ogen in dit embryo zichtbaar zijn. Een veelvoorkomend probleem bij transparante embryo's is echter dat er kleuring ophoopt in de interne holtes. Na het bekijken van deze video heeft u een goed idee van hoe u een whole mount in situ snel kunt uitvoeren met minder reagentia en hoe u beelden van hoge kwaliteit kunt vastleggen.