-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale Drosophila Weefsels In Situ
14 augustus 2014
Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.
Het algemene doel van deze procedure is om weefsels in C twee te visualiseren of te verzadigen met behulp van fluorescentiemicroscopie na sonicatie. Dit wordt bereikt door eerst embryonale en larvale monsters te verzamelen en vervolgens deze te fixeren met behulp van formaldehyde, heptaan en methanol. De tweede stap is om het gefixeerde monster te sonificeren om de cuticula te verwijderen en antilichaampenetratie mogelijk te maken.
Vervolgens wordt het monster geïmmunokleurt met primaire en fluorescerende secundaire antilichamen. De laatste stap is om het monster in een glycerolgebaseerde Antifa-oplossing te monteren. Uiteindelijk wordt confocale of epifluorescentiemicroscopie gebruikt om het zich ontwikkelende weefsel, evenals eiwitexpressie en -lokalisatie, te visualiseren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden zoals weefseldissectie, is dat het de visualisatie van een verscheidenheid aan zich ontwikkelende weefsels mogelijk maakt. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de sonicatiestap afhankelijk is van een aantal factoren om maximale efficiëntie te bereiken, inclusief de juiste positionering van de sonica-sonde. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Ashley Fiddler en Lauren Bole, twee getalenteerde onderzoekers van mijn lab.
Om het experiment te beginnen, verwijdert u voorzichtig embryo's die zijn verzameld op een agarplaat met behulp van een kleine penseel met fosfaatbuffer Triton X 100 of PBTX-oplossing. Veeg vervolgens de monstersladen penseel tegen de binnenkant van de rand van een celzeven. Plaats een petrischaaldeksel onder de celzeven.
Spoel vervolgens de penseel en de wanden van de celzeven met een spuitfles met PBTX. Nadat het monster op de zeven is overgebracht, giet u voldoende PBTX in de zeven om het monster van het gaas te tillen. Herhaal deze stap drie keer om gist en vliegsafval te verwijderen, verwijder PBTX.
Giet vervolgens 50% bleekvloeistof in de zeven en laat de larven vijf minuten in de oplossing zitten. Verwijder vervolgens de oplossing. Was vervolgens het monster met PBTX en laat het monster drie minuten in de oplossing zitten.
Herhaal de stap vijf keer, droog de bodem van de celzeven. Gebruik vervolgens een penseel met PBTX om het monster over te brengen naar een scintillatieglas met 1,75 milliliter pems. Voeg in een afzuigkap 250 microliter 37% formaldehyde en acht milliliter reagens toe.
Heptaan toe aan het scintillatieglas en schud het glas gedurende 20 minuten op 200 RPM. Voeg vervolgens 10 milliliter methanol toe aan het scintillatieglas zonder de waterige fase te verwijderen en schud krachtig op 500 RPM. Giet na het schudden de inhoud onmiddellijk in een celzeven boven een vloeibaar afvalcontainer.
Voeg extra methanol toe aan het glas en laat de inhoud door de celzeven lopen. Om ervoor te zorgen dat het hele monster is verwijderd. Probeer de bodem van de celzeven met laboratoriumweefsel.
Breng vervolgens een penseel aan om het monster van de zeven over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 0,5 milliliter methanol. Wacht tot het monster is bezonken. Verwijder vervolgens het methanol met een pipet en vervang het door een verse 0,5 milliliter methanol-aliquot.
Herhaal deze stap drie keer en voeg een laatste 0,5 milliliter methanol toe aan het buisje voordat het wordt opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Voor later, haalt u het opgeslagen monster uit de vriezer en verwijdert u het methanol met een pipet. Voeg vervolgens een milliliter van een 50% methanol fosfaat buffer tween of PBTW-oplossing toe aan het buisje en schudt het drie minuten lang rond.
Spoel vervolgens het monster twee keer met een milliliter PBTW en laat het monster bezinken voordat u het PBTW aftrekt met een pipet, voeg 1,0 milliliter bovien serum albumine fosfaat gebufferd tween of BBTW toe aan het glas en schud het drie minuten lang rond. Laat het monster bezinken en verwijder het BBTW met een pipet. Herhaal deze stap twee keer.
Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk BBTW verwijdert zonder enig monster te verliezen. Voeg vervolgens 0,5 milliliter BBTW toe aan het buisje en plaats het op ijs. Stel vervolgens de sonica in op 10% maximale amplitude en een runtime van twee seconden met constante ation, reinig de ator-sonde door de sondespit in een 50 milliliter conisch buisje te plaatsen dat is gevuld met gedeïoniseerd water en laat de sonica draaien.
Droog vervolgens de sonica-sonde af met een laboratoriumdoekje. Dompel de sonde onder in het buisje, drie tot vier millimeter boven het monster en start de sonicatie. Verwijder vervolgens het buisje en plaats het op ijs gedurende 30 seconden om oververhitting door de sonicatie te voorkomen en om het monster op de bodem van het buisje te laten bezinken.
Herhaal deze stap zoals vereist door de leeftijd van het monster nadat de sonicatie is voltooid. Spoel het monster twee keer met een milliliter BBTW. Laat na elke spoeling het monster bezinken voordat u BBTW aftrekt met een pipet, voeg een milliliter BBTW toe aan het glas en plaats het op een rocker.
Laat na drie minuten het monster bezinken en verwijder BBTW met een pipet. Herhaal dit vervolgens. Stap twee keer, blokkeer het monster met 0,5 milliliter 5% normaal serum verdund in BBTW naar het buisje en plaats het monster gedurende een uur op een rocker op kamertemperatuur.
Voeg vervolgens 0,5 milliliter primaire antilichaamoplossing toe en schudt het monster gedurende een nacht op vier graden Celsius, laat het monster naar de bodem van het buisje bezinken. Trek vervolgens primaire antilichamen af met een pipet en spoel twee keer met een milliliter BBTW. Voeg een milliliter BBTW toe aan het glas en plaats het vervolgens drie minuten op een rocker.
Verwijder vervolgens BBTW met een pipet en herhaal dit. Stap vijf keer, blokkeer het monster met 5% normaal serum BBTW-oplossing en schudt het gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de op
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor immunokleuring van Drosophila melanogaster-weefsels met behulp van sonicatie. De methode maakt de visualisatie van specifieke celtypen en eiwitten mogelijk zonder dat dissectie nodig is, wat de efficiëntie bij het bestuderen van ontwikkelende weefsels verhoogt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Immunostaining is essentieel voor het visualiseren van eiwitten in weefsels.
- Traditionele methoden vereisen vaak dissectie, wat tijdrovend kan zijn.
- Sonicatie kan de penetratie van antilichamen vergemakkelijken door de cuticula te verwijderen.
- Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de lokalisatie van eiwitten te observeren.
Doel van de studie
- Om een efficiënt immunostaining-protocol te bieden voor hele larven.
- Om eiwitexpressie in Drosophila-weefsels te visualiseren.
- Om de toegankelijkheid van antilichaampenetratie in gefixeerde monsters te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van embryonale en larvale monsters.
- Fixatie met formaldehyde, heptaan en methanol.
- Sonicatie om de cuticula te verwijderen.
- Immunokleuring met primaire en fluorescerende secundaire antilichamen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van ontwikkelende weefsels middels fluorescentiemicroscopie.
- Effectieve antilichaampenetratie bereikt door middel van sonicatie.
- Duidelijke lokalisatie van eiwitten binnen de monsters.
- Het protocol verhoogt de efficiëntie van immunokleuringsprocedures.
Conclusies
- De beschreven methode vereenvoudigt het proces van immunostaining.
- Sonicatie is een waardevolle techniek voor het prepareren van Drosophila-weefsels.
- Dit protocol kan breed worden toegepast voor soortgelijke studies in de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze door sonicatie gefaciliteerde immunofluorescentiemethode pakt een belangrijke knelpunt in het onderzoek naar ontwikkelingsbiologie aan: de ondoordringbare cuticula in laatstadium Drosophila-embryo's en larven die de penetratie van antilichamen belemmert. Door whole-mount immunostaining zonder dissectie mogelijk te maken, verbetert het protocol de doorvoer en wordt de weefselmorfologie behouden, wat betrouwbare target-validatie ondersteunt in genetische en fenotypische screens. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste eiwitexpressiegegevens te verschaffen die cruciaal zijn voor het mechanistische verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door visualisatie van proteinlokalisatie in intacte weefsels, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Operationele waarde: Ondersteunt high-throughput verwerking van grote aantallen monsters, wat de efficiëntie in targetvalidatie-workflows verbetert.
- Strategische waarde: Faciliteert fenotypische screening door gelijktijdige analyse van meerdere weefseltypen (bijv. testikels, eierstokken, neurale weefsels) over verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die een gestandaardiseerde beoordeling van antigeenexpressieniveaus mogelijk maken.
- Operationele waarde: Behoudt de in situ weefselarchitectuur, wat de reproduceerbaarheid van de assay waarborgt en variabiliteit door dissectie-artefacten vermindert.
- Strategische waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door target-engagement en expressiepatronen te bevestigen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt ziekterelevante cellulaire resolutie in Drosophila-modellen, wat de ontdekking van translationele biomarkers voor neurodevelopmentale en reproductieve pathways ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door consistente weefselpreparatie- en kleuringsprotocollen te handhaven.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door betrouwbare, ruimtelijk opgeloste proteïnelokalisatiedata te leveren.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, met name wanneer fenotypische screening analyse van intact weefsel en kwantitatieve eiwitlokalisatie vereist.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door visualisatie van specifieke celtypen en eiwitexpressie in ontwikkelende weefsels mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, reproduceerbare immunostaining met kwantitatieve fluorescentie-outputs die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert meetbare read-outs (fluorescentie-intensiteit, lokalisatiepatronen) waarmee teams experimentele condities kunnen vergelijken en target-modulatie kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door weefselgegevens te leveren die in lijn liggen met ontwikkelingsfenotypes die relevant zijn voor menselijke ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor monstervoorbereiding die toepasbaar is op meerdere projecten binnen de ontwikkelingsbiologie en genetische screening.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door het aantal fout-negatieven als gevolg van gebrekkige antilichaampenetratie te verminderen en de nauwkeurigheid van de targetvalidatie te verbeteren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid via een gestroomlijnd protocol zonder dissectie, dat compatibel is met verwerkingen van grote volumes.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare mechanistische inzichten te verschaffen, waardoor biologische risico's in een late fase van de targetontwikkeling worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde expressiepatronen en functionele relevantie in ziekterelateerde systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de optimalisatie van sonicatieparameters (positie van de probe, amplitude, duur) om beschadiging van het monster te voorkomen terwijl de verwijdering van de cuticula wordt gewaarborgd.
- Is afhankelijk van toegang tot sonicatieapparatuur met nauwkeurige amplitude- en tijdregelingen, samen met standaard reagentia voor immunofluorescentie en fluorescentiemicroscopie.
- Maakt cross-team standaardisatie van sonicatie- en kleuringsprotocollen noodzakelijk om reproduceerbaarheid tussen gebruikers en laboratoria te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende Drosophila-weefseltypen en ontwikkelingsstadia, aangezien de sonicatie-efficiëntie kan variëren afhankelijk van de leeftijd van het monster en de dikte van de cuticula.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak voor optimalisatie van antilichaam-incubatietijden voor targets met een lage abundantie en zorgvuldige hantering van gevaarlijke reagentia (formaldehyde, heptaan, methanol).
