Name: -Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale Drosophila Weefsels In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer een efficiënte sonificatieprotocol voor immunofluorescentiekleuring van Drosophila melanogaster embryo's en larven zonder dissectie. Deze methode verbetert antilichaampenetratie voor visualisatie van eiwitexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Ruth Lehman en Dorthea Godt die zo vriendelijk geleverd Vasa en Traffic Jam antilichamen. We willen graag de Bloomington Stock Center aan de Universiteit van Indiana erkennen voor het onderhoud van de voorraden en de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa. Wij danken alle leden van de Wawersik lab voor hun advies en ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Monroe Scholars Program Grant (naar AF en LB) en NSF verlenen IOS0823151 (op MW).

1 Voorbereiding van een collectie Cage <ol><li> Verdoven jonge, vruchtbare vliegen met CO 2. Transfer verdoofde vliegt naar een kooi. Om optimale opbrengst te verkrijgen, gebruik 100-120 volwassen vliegen variëren van 2-7 dagen oud op een 4: 1 verhouding vrouwtjes mannetjes. Laat vliegt een passende acclimatiseringsperiode, ~ 24 uur voorafgaand aan het verkrijgen monster voor fixatie. Als de kooi werd opgezet met maagdelijke vrouwtjes gepaard met mannen, een gebruik van een 36 - hr acclimatiseringsperiode 48. </li><li> Aan het open uiteinde van de kooi, plaats een voorbereide appelsap agarplaat met een dime-sized druppel gistpasta in het midden over de opening van de kooi. Dan, stevig met tape. Dicht de kruising tussen de appelsap agar plaat en de kooi met Parafilm. </li><li> Plaats de kooi in een secundaire container met appelsap agar plaat als de basis en laat de vliegen te reproduceren bij een bepaalde temperatuur gedurende een passende periode van tijd, zoals bepaald door het experiment. Opmerking: Monsterneming keer will variëren. Bijvoorbeeld, bij het verzamelen late stadium embryo / vroege L1 larven (17-24 uur), laten vliegen eieren op appelsap agarplaten gelegd voor 7 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 17 uur bij 25 ° C. Ook voor een verzameling van larven mid-late eerste instar (36-48 uur) laten vliegen eieren leggen gedurende 12 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 36 uur bij 25 ° C. </li><li> Zodra de tijd is voltooid, tikt u op de kooi op een tafel, zodat vliegen vallen weg van de appelsap agarplaat zonder verdoving. Sluit meteen de gebruikte plaat met een verse met een druppel gistpasta. Bevestig de verse plaat met tape en parafilm en bewaar de kooi met appelsap agar plaat als basis. </li><li> Verwijder de gist daling van de gebruikte plaat met een metalen spatel voorzichtig. Plaats het deksel op de gebruikte appelsap plaat en laat gelegd embryo&#39;s leeftijd als experimenteel nodig. Opmerking: Tijdens het verouderingsproces monsters, kunnen de platen bij 25 ° C worden bewaard, tenzij hogere temperaturen zijn experimenlly vereist. Voorbeelden van hoe embryo&#39;s voor de collectie zijn hierboven beschreven ouder (zie toelichting voor stap 1.3). Verwijdering van gist deeg voorafgaand aan veroudering proeven uitgevoerd om de larven te voorkomen kruipen in de gist en het opbreken van de agar eronder. De resterende appelsap agar en gist Lijmresten voedingsstoffen voor larvale groei. Terwijl rechtstreeks volgens de gistpasta embryo verloren gaan gistpasta verwijderen, dit verlies de voorkeur gist en agar residu in het monster die kleuring efficiëntie verminderen. Indien men kiezen de gistpasta niet te verwijderen, kan gist worden vloeibaar gemaakt met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx), gemengd met een kwast en daarna uit het monster met een cel zeef voor fixatie. </li></ol> 2 Fixatie <ol><li> Eenmaal gelegd op de appelsap agarplaat&#39;s naar de gewenste tijdstip zijn gerijpt, met een kleine penseel bevochtigd met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx) oplossing om zorgvuldig uit th verwijderen monstere plate. Opmerking: Oudere larven zijn mobiel en kan kruipen naar de binnenkant van het deksel. Dit monster kan op dezelfde manier worden verzameld door het verwijderen met een penseel. </li><li> Veeg de sample-beladen penseel tegen de binnenkant gerichte nok van een cel zeef. Daarna spoel de muren van de zeef en de penseel met een spuit fles met PBTx oplossing. Plaats een petrischaal deksel onder de zeef om de PBTx oplossing vast te leggen. </li><li> Na al het monster is overgedragen aan de zeef, giet genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas te verhogen. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container. </li><li> Herhaal stap 2.3 drie keer om gist te verwijderen en vliegen afval die mogelijk zijn overgedragen, samen met het monster. </li><li> Giet genoeg 50% bleekwater (NaOCl) / water (DDH 2 O) oplossing in de zeef om de larven van de maas te tillen. Laat larven zitten in oplossing gedurende 5 minuten. Til de zeef en giet thij de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container. Opmerking: Bleach is alleen nodig in embryonale samples 0 t - 22 uur teneinde het chorion membraan te verwijderen. De toepassing van bleekwater om oudere monsters kunnen worden weggelaten, maar de opname is niet schadelijk. Als omissie is gewenst, vervang het bleekmiddel in deze stap met PBTx. Verdund bleekwater moet worden gebruikt binnen 24 uur van de oplossing voorbereiding. </li><li> Was monster in de zeef met PBTx door gieten genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas verhogen. Laat monster te zitten in oplossing voor 3 minuten. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container. </li><li> Herhaal stap 2.6 vijf keer. </li><li> Dep de onderkant van de cel zeef droog, daarna monster over in een scintillatieflesje met 1,75 ml PEMS oplossing met behulp van een penseel. </li><li> Werken in een geventileerde zuurkast, voeg 250 ul van 37% formaldehyde en 8 ml van reagenskwaliteit heptaan de scintillatieflesje. <br/&gt; Let op: Formaldehyde en heptaan zijn gevaarlijk. Voor de veiligheid, blijven werken in een geventileerde zuurkast en draag geschikte handschoenen voor stappen 2,9-3,3. </li><li> Laat het flesje te schudden bij 200 rpm of soortgelijke matige snelheid gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 10 ml methanol scintillatieflesje zonder de voorafgaande waterfase en laat de flacon krachtig schudden bij 500 rpm gedurende 1 minuut. Opmerking: Methanol is gevaarlijk. Blijven werken in een geventileerde zuurkast en draag geschikte handschoenen. </li><li> Verwijder de flacon uit shaker en giet onmiddellijk inhoud in een cel zeef boven een vloeibaar afval container in de kap. Voeg extra methanol aan de flacon en lopen door de cel zeef als nodig is om ervoor te zorgen alle monster is genomen. Opmerking: Cell filters kan langzaam leeglopen. Om dit te verhelpen, drukt een laboratorium weefsel onderaan de cel zeef om de oplossing door de zeef sneller trekken. Methanol moet formaldehyde en heptaan zijnopgeslagen in daarvoor bestemde containers tot het weggooien volgens de institutionele richtlijnen. </li><li> Droge bodem van cel zeef met een klinisch weefsel vervolgens een penseel monster meegenomen in de zeef overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,5 ml methanol. Opmerking: Als er meerdere scintillatieflesjes in gebruik zijn, voert u stap 2.12 en 2.13 een flesje op een moment om monster te voorkomen uitdrogen op mobiele filters. </li><li> Nadat het monster is toegevoegd aan de microcentrifugebuis verwijderen methanol met een pipet. Zorgen monster is neergedaald op de bodem van de buis. </li><li> Spoel monster in de microcentrifugebuis door toevoeging van ongeveer 0,5 ml methanol buis. Wachten voor het monster om vervolgens genoegen te verwijderen methanol met een pipet. </li><li> Herhaal stap 15 drie keer. </li><li> Voeg 0,5 ml methanol aan de buis, en vervolgens op te slaan in een -20 ° C vriezer voor later gebruik. </li></ol> 3 Rehydratie en Voorbereiding van de Steekproef voor Immunokleuring <ol><li> Verwijder methanol uit de microcentrifugebuis met een pipet, waardoor het monster in de buis. Store methanol afval naar de daarvoor bestemde container op het moment van weggooien. Opmerking: sonicatie efficiëntie, gebruik niet meer dan 3 mm monster zich op de bodem van 1,5 ml microcentrifugebuis. Excess monster worden overgebracht naar een afzonderlijke buis met een pipet, alvorens met de rehydratatietrap hierboven. Het snijden van de pipetpunt met een schone scheermesje kunnen worden gebruikt om verstopping van de pipetpunt voorkomen. </li><li> Voeg 1,0 ml van een 50% methanol / fosfaatbuffer Tween (PBTw) oplossing aan de buis en rock gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder methanol oplossing voor de juiste afvalbak en spoel af met 1,0 pi PBTw tweemaal. Na elke spoeling de sample te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet. </li><li> Voeg 1,0 ml van Bovine serum albumine / fosfaat gebufferde Tween (BBTw) mixen om de flacon en rock. Na 3 min op een rocker, laat de sample om zich te vestigen en te verwijderen van de BBTw met pipet. </li><li> Herhaal stap 3.4 tweemaal zorg zoveel BBTw mogelijk verwijderen zonder na de laatste wasbeurt verlies monster. </li><li> Voeg 0,5 ml van BBTw aan de buis en plaats de buis op ijs. </li></ol> 4 Sonicatie van Monster <ol><li> Stel de sonicator tot 10% maximale amplitude en wijst een looptijd van 2 sec constant geluidsgolven. Opmerking: Deze instellingen zijn specifiek voor de in de materialen en apparatuur Tabel sonicator en kan optimalisatie voor verschillende sonicators vereisen. </li><li> Voorafgaand aan ultrasoonapparaat van het monster, het reinigen van de sonicator sonde door het plaatsen van de sonde in een 50 ml conische buis gevuld met gedemineraliseerd water en run sonicator om de sonde te reinigen. Droog sonicator sonde met laboratorium weefsel na run. </li><li> Dompel de sonde in de microcentrifugebuis bevattende monster zodat het zich ongeveer 3-4 mm boven het monster en begin sonicatie. </li><li> Verwijder de microcentrifuge buis en plaats op ijs gedurende ten minste 30 seconden om warmte van sonificatie en laat monster bezinken op de bodem van de microcentrifugebuis. </li><li> Herhaal de stappen 4.3 en 4.4 als nodig is gebaseerd op leeftijd monster wordt verwerkt. Opmerking: Voor een optimale sonicatiebuffer monstervolume, embryo&#39;s die jonger zijn dan 17 uur hoeft geluidsgolven niet nodig, maar die tussen 17 en 24 uur (stadium 17 / vroege-L1) vereisen twee sonications. Larven tussen de 24 - 36 (vroege / midden-L1), 36-48 (half / eind-L1), 48 - 60 (vroege / midden-L2), 60-72 (half / eind-L2), 72-84 ( begin-L3), 84-96 (vroege / mid-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr vereisen 5, 9, 11, 13, respectievelijk 15, 18 en 22 sonications. Zie de bespreking voor het verder uitwerken van geluidsgolven tijden. </li><li> Spoelen met 1,0 ml BBTw tweemaal. Na elke spoeling laat het monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet. </li><li> Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de BBTw met pipet. &lt;/ Li&gt; <li> Herhaal stap 4.7 twee keer. </li></ol> 5 Immunokleuring <ol><li> Blokkeer monster door toevoeging van 5% normaal serum verdund in BBTw de microcentrifugebuis. Verwijder blok na schommelen gedurende 1 uur. Opmerking: Gebruik een normale serum van de soorten waarbij de secundaire antilichamen worden opgewekt. </li><li> Verdunnen primaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing. </li><li> Rock monster primaire antilichaamoplossing O / N bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C. Opmerking: Antibody incubatie tijden en temperaturen kunnen variëren. O / N incubatie bij 4 ° C of 3 uur bij kamertemperatuur is meestal voldoende. Er kan evenwel een tweedaagse incubatie afgevend verbeteren, vooral bij oudere monsters of wanneer lage affiniteit primaire antilichamen gebruikt. Langere incubaties worden typisch uitgevoerd bij 4 ° C. Soortgelijke overwegingen moeten wordt opgenomen met secundaire antilichamen (zie 5.10). </li><li> Laat monster om zich te vestigen opbodem van microcentrifugebuis. Tap primaire antilichamen met pipet. Besparen indien gewenst antilichamen voor hergebruik. </li><li> Spoelen met 1,0 ml van BBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet. </li><li> Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, zodat monster om zich te vestigen en te verwijderen BBTw met pipet. </li><li> Herhaal stap 5.6 vijf keer. </li><li> Vak monster door toevoeging van 5% normaal serum / BBTw oplossing voor de microcentrifugebuis. Verwijder blok Schud gedurende 30 minuten tot 1 uur. Noot: de extra blokkering stap is niet vereist, maar kan afgevend specifieke antilichamen te verbeteren. </li><li> Verdunnen secundaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing. </li><li> Wikkel microcentrifugebuis in aluminiumfolie te verminderen verkleuring door blootstelling aan licht. Rock monster secundair antilichaam oplossing 12 tot 48 uur bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C. </li><li> Laat monster te regelen tot de onderkant van microfugebuis. Tap secundaire antilichamen met pipet. </li><li> Spoelen met 1,0 ml van PBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet. </li><li> Voeg 1,0 ml van PBTw aan de flacon en rock. Na 5 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de PBTw met pipet. </li><li> Herhaal stap 5.13 drie maal. </li><li> OPTIONEEL: Voeg DAPI- verdund 1: 1.000 in PBTw. Rock monster gewikkeld in aluminiumfolie gedurende 3 minuten; verwijder vervolgens DAPI oplossing met een pipet. Spoel vijf keer met 1,0 ml van PBTw, waardoor sample te regelen voordat PBTw verwijderen met pipet. </li><li> Toevoegen 80-100 gl 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) oplossing microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C. Opmerking: Een andere-glycerol gebaseerde anti-fade middel kan worden vervangen. </li></ol> 6 Analyse <ol><li> Voor de montage van monster op dia&#39;s, een extra 5 - 10 ul van DABCO / p-phenyleendiamine (PPD) antifade oplossing voor microcentrifugebuisje. Opmerking: De steekproef kan tot dia&#39;s worden toegevoegd zonder dissectie. Monstervolume toegevoegd aan een dia varieert met dekglas grootte. Bij het pipetteren monster op dia, kan de pipet worden afgesneden met een scheermesje om monster scheren voorkomen. Het is vaak handig om monster line-up in rijen voor eenvoudige analyse. De toevoeging van PPD als extra antifade middel kan niet vereist, maar kan voorkomen fotobleken wanneer monsters worden bewaard op lange termijn. </li><li> Plaats voorzichtig glazen afdekplaat slip of een monster. Dan, veilige dekglas op zijn plaats met behulp van nagellak. </li><li> Bekijk gemonteerde monster met behulp van fluorescentie microscopie. </li></ol>

<ol><li>Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+controlling+germ+cell+migration+and+embryonic+gonad+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila.</a> Development. 125, 667-678 (1998).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothwell%2C+WF+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).</li>
<li>Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+E-cadherin+is+essential+for+proper+germ+cell-soma+interaction+during+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis.</a> Development. 130, 4417-4426 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+SS+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).</li>
<li>Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+N+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Dev Biol. 294, 92-103 (2006).</li>
<li>Sheng, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+male+germline+stem+cell+establishment+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis.</a> Dev Biol. 334, 335-344 (2009).</li>
<li>Sinden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+cyst+stem+cell+development+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis.</a> Dev Biol. 372, 5-16 (2012).</li>
<li>DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonautonomous+sex+determination+controls+sexually+dimorphic+development+of+the+Drosophila+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad.</a> Dev Cell. 14, 275-286 (2008).</li>
<li>Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((raw+Functions+through+JNK+signaling+and+cadherin-based+adhesion+to+regulate+Drosophila+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis.</a> Dev Biol. 367, 114-125 (2012).</li>
<li>Fuller, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).</li>
<li>Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+Lessons+from+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Williamson, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in Drosophila.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).</li>
<li>Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+gonadal+cells%3A+the+supporting+cast+for+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline.</a> Genesis. 49, 753-775 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).</li>
<li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovary+morphogenesis%3A+Analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).</li>
<li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li>
<li>Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+niche+and+stem+cell+precursors+by+hormonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling.</a> PLoS Biol. 9, e1001202(2011).</li>
<li>Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+controls+the+size+of+the+stem+cell+precursor+pool+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary.</a> Mech Dev. 130, 241-253 (2013).</li>
<li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila.+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li>
<li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li>
<li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li>
<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol verschaft een werkwijze succesvol immunostain richten Drosophila embryonale en larvale weefsels in situ, waardoor de noodzaak voor dissectie. Als per eerdere protocollen voor het kleuren van de vroege embryo&#39;s 1,2,3, is het chorion membraan verwijderd met behulp van 50% bleekwater (NaOCl). Monsters worden gefixeerd in formaldehyde en methanol. Omdat de larvale cuticula veroorzaakt oudere monster drijven, wordt het gehele monster vervolgens door een cel-zeef om larvale retent...

Drosophila embryo&#39;s en larven bieden een uitstekend model om ontwikkelingsprocessen te studeren in veel organen en weefsels. Beeldvorming van afzonderlijke cellen is vaak noodzakelijk in deze studies om de complexe omgevingen waarin cellen ontwikkelen bepalen. Visualisatie van cellen in weefsels kunnen worden bereikt door immunokleuring. Goed beschreven immuunkleuring protocollen bestaan ​​voor embryonale Drosophila weefsels &lt;17 uur na de eileg (AEL) 1-3. Echter, een beschermende cuticula vormt tegen het einde van embryogenese voorkomende effectieve antilichaam permeatie. Aldus zijn deze immunokleuring protocollen inefficiënt in de analyse van weefsels in late-stadium embryo en in latere fasen van larvale ontwikkeling (1e instar (L1), 2e instar (L2) en 3e instar (L3)). Deze inefficiëntie legt een barrière voor ons begrip van de dynamische processen die optreden tijdens deze uitgebreide ontwikkelingsperiode 4. Tissue dissectie is een uitgebreid toegepast techniek om deze barrière 5-7 omzeilen. Echter, dissectie ondoeltreffend. Extractie kan worden bezwaard door de moeilijkheden bij het lokaliseren of het isoleren van embryonale en larvale weefsels. Verder kan de fysieke verwijdering van doelwitweefsels schade veroorzaken door scheuren hen of door niet uitpakken in hun geheel. Sonicatie is een methode die geluidsgolven maakt gebruik van intermoleculaire interacties te verstoren. Het is gebruikt om de integriteit van de Drosophila larven cuticula verstoren om immunostain ontwikkelen neurale celtypes 6. Dit protocol is aangepast om late-fase embryonale en larvale geslachtsklieren, van slechts 50 urn diameter 8-10 kan immunostain. Door middel van deze studies, is het proces van de mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) niche-formatie werd gekenmerkt in een vergevorderd stadium Drosophila embryo&#39;s 8-10 en mechanismen tot regeling van stamcellen ontwikkeling en differentiatie in een vergevorderd stadium embryonale gonaden en larven zijn opgehelderd 9-12. Aldus sonicatie biedt een efficiënt alternatief voor weefsel dissectie die kan moeilijk zijn vanwege weefselgrootte. Bovendien maakt immunokleuring van Drosophila weefsels in situ, waardoor cellen in de context van het hele organisme en handhaven situ morfologie. Hier is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie immunokleuring van late-fase embryonale beschrijven we door vroege / midden-L3 weefsels in situ. Analyse van Drosophila gonadale en neuraal weefsel in de Representatieve resultaten voor de werkzaamheid van dit protocol aangetoond. Bovendien kan dit immunokleuring protocol worden aangepast aan andere Drosophila weefsels en weefsels in andere organismen te analyseren met een buitenste cuticula.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabel 1: Reagentia en buffers</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Voor 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Bewaren bij RT.</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferzoutoplossing 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Voor 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Componenten toevoegen en aanvullen tot het juiste volume. Bewaren bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Voor 50 ml: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Schudden om te mengen. Bewaren bij RT.</td></tr><tr><td>PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 M Pipes (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Bewaren bij RT.</td></tr><tr><td>Pipes</td><td></td><td></td><td>Voor 400 ml van een 0,25 M oplossing (pH 6,9): 30,24 g Pipes dH20 NaOH. Pipes oplossen in 300 ml dH2O en vervolgens aanpassen naar pH 6,9 met NaOH. Het totale volume brengen naar 400 ml met dH2O en autoclaveren. Bewaren bij RT.</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td></td><td></td><td>37% formaldehyde naar gewicht in methanol. Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.</td></tr><tr><td>Heptaan</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptaan. Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Voor 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter steriliseren na het toevoegen van alle componenten. Bewaren bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Voor 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Schudden om te mengen. Bewaren bij RT.</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine/fosfaatbuffer Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Voor 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g rundserumalbumine (BSA). BSA toevoegen en vervolgens steriliseren met behulp van een 0,2 μm vacuümfilterunit. Bewaren bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Voor 10 ml: normaal geitenserum 10 ml ddH2O. ddH2O toevoegen aan flesje NGS en steriliseren met behulp van een 0,2 μm spuitfilter. Aliquots bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>Voor 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g DABCO-solid, 3,5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beker met roerstaaf, ddH2O, Tris HCl en DABCO toevoegen. Roeren en vervolgens 6N HCl, 10 N NaOH en glycerol toevoegen. Vervolgens 10N NaOH druppelsgewijs toevoegen totdat de oplossing pH 7,5 bereikt. Aliquots. Aliquots bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>DABCO + p-fenyleendiamine (PPD)-oplossing</td><td></td><td></td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD oplossen in NaHCO3 en NaCO3-oplossing. Voeg 60 μl PPD-oplossing toe aan 500 μl DABCO. Aliquots bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Appelsapplaten</td><td></td><td></td><td>Voor ~200 platen: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g kristalsuiker (in de winkel gekocht), 500 ml appelsap (in de winkel gekocht), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Agar toevoegen aan ddH2O in 4 L fles en vervolgens 30 min autoclaveren. Appelsap en suiker mengen op een verwarmde roerplaat. Geleidelijk appelsapmengsel toevoegen aan geautoclaveerde agar. Mengen op een verwarmde roerplaat en vervolgens 10 ml volumes verdelen in 35 mm petrischalen en laten staan bij RT om te stollen. Bewaren bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Voor 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Aliquots bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Gistpasta</td><td></td><td></td><td>~50 g droge actieve gist. Geleidelijk ddH2O toevoegen aan beker met gist onder roeren tot paste-achtige consistentie bereikt is. Bewaren bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2: Materiaal voor kleuring</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, voorraad bij 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Konijn anti-Vasa</td><td></td><td></td>

-sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van late-fase embryonale en larvale<em&gt; drosophila</em&gt; weefsels<em&gt; in situ</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies uitgevoerd in Drosophila melanogaster embryo&#39;s en larven leveren cruciale inzicht in ontwikkelingsprocessen zoals lot van de cel specificatie en organogenese. Immunokleuring maakt de visualisatie van ontwikkelende weefsels en organen. Echter, een beschermende cuticula die zich vormt aan het eind van embryogenese voorkomt permeatie van antilichamen in late-embryo&#39;s en larven. Terwijl dissectie voor immunokleuring wordt regelmatig gebruikt om Drosophila larvale weefsels analyseren inefficiënt sommige analyses blijkt omdat kleine weefsels moeilijk kan zijn te lokaliseren en te isoleren. Sonicatie biedt een alternatief voor dissectie in larvale Drosophila immunostaining protocollen. Het maakt een snelle, gelijktijdige verwerking van grote aantallen late-embryo&#39;s en larven en onderhoudt in situ morfologie. Na fixatie in formaldehyde, wordt een monster gesonificeerd. Monster wordt vervolgens onderworpen aan immunokleuring met antigen-specifiek primair antibodies en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen aan doelcel types en specifieke proteïnen te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. Tijdens het proces van sonicatie, juiste plaatsing van een sonicatie sonde boven het monster, alsmede de duur en intensiteit van sonicatie, kritisch. Additonal kleine wijzigingen standaard immunokleuring protocollen die noodzakelijk zijn voor hoge kwaliteit vlekken. Op antilichamen met een lage signaal-ruisverhouding, langere incubatietijden zijn typisch noodzakelijk. Als een proof of concept voor deze-geluidsgolven gefaciliteerd protocol, laten we immunostains van drie soorten weefsel (testikels, eierstokken, en zenuwweefsel) op een afstand van ontwikkelingsstadia.

Om de werkzaamheid van sonicatie gebaseerde immunokleuring in analyse van laat-stadium embryonale en larvale weefsels in situ aantonen, werden wildtype embryo&#39;s en larven bewerkt voor immunokleuring van testes, ovaria en zenuwweefsel. Monsters werden afgebeeld via confocale microscopie en representatieve resultaten worden getoond (Figuur 1 en Figuur 2). Resultaten blijkt dat het beschreven protocol is effectief voor het visualiseren van morfologische kenmerken als individue...

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Het algemene doel van deze procedure is om weefsels in C two te visualiseren of te kleuren met behulp van fluorescentiemicroscopie na sonicatie. Dit wordt bereikt door eerst embryonale en larvale monsters te verzamelen en deze vervolgens te fixeren met formaldehyde, heptaan en methanol. De tweede stap is om het gefixeerde monster te soniceren om de cuticula te verwijderen, zodat antilichamen kunnen penetreren.Vervolgens wordt het monster immunogekleurd met primaire en fluorescente secundaire antilichamen. De laatste stap is het mounten van het monster in een op glycerol gebaseerde Antifa-oplossing. Ten slotte wordt confocale of epifluorescentiemicroscopie gebruikt om het ontwikkelende weefsel, evenals de eiwitexpressie en lokalisatie, te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals weefseldissectie, is dat het de in vivo visualisatie van diverse ontwikkelende weefsels mogelijk maakt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de sonicatiestap afhankelijk is van een aantal factoren om maximale efficiëntie te bereiken, waaronder de juiste positionering van de sonicatieprobe. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ashley Fiddler en Lauren Bole, twee getalenteerde bachelorstudenten uit mijn laboratorium.Om het experiment te starten, verwijdert u voorzichtig de embryo's die op een agarplaat zijn verzameld met behulp van een klein schilderspenseel bevochtigd met fosfaatbuffer Triton X 100 of PBTX-oplossing. Veeg vervolgens het penseel met het monster tegen de binnenzijde van de rand van een cellzeef. Plaats een Petrischaaldeksel onder de cellzeef.Spoel vervolgens de kwast en de wanden van de cellzeef af met een knijpfles met PBTX. Nadat het monster naar de zeef is overgebracht, giet u voldoende PBTX in de zeef om het monster van het gaas te tillen. Herhaal deze stap drie keer om gist en vliegenuitwerpselen te verwijderen en verwijder vervolgens de PBTX.Giet vervolgens een 50% bleekoplossing in de zeef en laat de larven vijf minuten in de oplossing rusten. Verwijder daarna de oplossing. Was het monster vervolgens met PBTX en laat het monster drie minuten in de oplossing rusten.Herhaal deze stap vijf keer en droog de onderkant van de celzeef. Gebruik vervolgens een penseel bevochtigd met PBTX om het monster over te brengen naar een scintillatiebuisje met 1,75 milliliters pems. Voeg in een zuurkast 250 microliters 37%formaldehyde en acht milliliters reagenskwaliteit toe.Voeg heptaan toe aan het scintillatiebuisje en schud het buisje 20 minuten lang bij 200 RPM. Voeg vervolgens 10 milliliters methanol toe aan het scintillatiebuisje zonder de waterfase te verwijderen en schud krachtig bij 500 RPM. Giet na het schudden onmiddellijk de inhoud door een cell strainer in een container voor vloeibaar afval.Voeg extra methanol toe aan het vial en filter de inhoud door de celzeef. Om er zeker van te zijn dat het volledige monster is verwijderd, kan de onderzijde van de celzeef worden afgedroogd met laboratoriumpapier.Gebruik vervolgens een penseel om het monster van het zeefje over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 0,5 milliliter methanol. Wacht tot het monster is bezonken. Verwijder daarna de methanol met een pipet en vervang deze door een nieuw aliquot van 0,5 milliliter methanol.Herhaal deze stap drie keer en voeg een laatste 0,5 milliliter methanol aan de buis toe voordat deze bij -20 °C wordt bewaard. Haal voor later het bewaarde monster uit de vriezer en verwijder de methanol met een pipet. Voeg vervolgens één milliliter van een 50% methanol fosfaatbuffer tween- of PBTW-oplossing toe aan de buis en schud de buis drie minuten lang.Spoel het monster vervolgens twee keer met één milliliter PBTW, waarbij u het monster telkens laat bezinken voordat u de PBTW met een pipet afzuigt; voeg 1,0 milliliter bovine serum albumine fosfaatgebufferde tween, of BBTW, toe aan het vial en schud dit drie minuten voorzichtig.Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk BBTW verwijdert zonder enig deel van het monster te verliezen. Voeg vervolgens 0,5 milliliters BBTW toe aan de buis en plaats deze op ijs. Stel daarna de sonicator in op 10% maximale amplitude en een looptijd van twee seconden met constante actie, reinig de sonicator-probe door de probe-tip in een conische buis van 50 milliliter gevuld met gedeïoniseerd water te plaatsen en activeer de sonicator.Droog vervolgens de sonicatieprobe af met een laboratoriumdoekje. Dompel de probe in de buis, drie tot vier millimeter boven het monster, en start de sonicatie. Verwijder daarna de buis en plaats deze 30 seconden op ijs om oververhitting door de sonicatie te voorkomen en om het monster naar de bodem van de buis te laten zakken.Herhaal deze stap indien nodig, afhankelijk van de ouderdom van het monster, nadat de sonicatie is voltooid. Spoel het monster twee keer met 1 mL BBTW. Laat het monster na elke spoeling bezinken voordat de BBTW wordt afgevoerd. Voeg met een pipet 1 mL BBTW toe aan het vial en plaats dit op een rocker.Laat het monster na drie minuten bezinken en verwijder de BBTW met een pipet. Herhaal deze stap twee keer. Blok vervolgens het monster door 0,5 milliliters 5% normaal serum, verdund in BBTW, aan de buis toe te voegen, en plaats het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur op een rocker.Voeg vervolgens 0,5 milliliters primaire antilichaamoplossing toe en laat het monster een nacht schudden bij vier graden Celsius, waarbij het monster naar de bodem van de buis mag bezinken. Pipetteer daarna de primaire antilichamen weg en spoel twee keer met één milliliter BBTW. Voeg één milliliter BBTW toe aan het flacon en plaats deze vervolgens drie minuten op een rocker.Verwijder vervolgens de BBTW met een pipet en herhaal dit. Na vijf herhalingen wordt het monster geblokkeerd met een BBTW-oplossing met 5% normaal serum en 30 minuten lang geschud. Verwijder daarna de oplossing.Voeg secundaire antilichamen toe, verdund in een 5% normaal serum BBTW-oplossing, en wikkel de buis in aluminiumfolie. Laat het monster vervolgens een nacht schudden bij vier graden Celsius. Verwijder de secundaire antilichamen met een pipet en spoel het monster twee keer met één milliliter PBTW.Voeg vervolgens één milliliter PBTW toe aan het vials en plaats deze vijf minuten op een rocker. Laat het monster daarna bezinken en verwijder de PBTW met een pipet. Herhaal deze stap.Herhaal deze stap drie keer. Voeg 80 tot 100 µL DAB co-oplossing toe aan de buis en bewaar deze bij -20 °C. Gebruik ten slotte 5 tot 10 µL dab BCO p-fenyleendiamine, of PPD anti-fade, om het monster te monteren.Bekijk het vervolgens met fluorescentiemicroscopie. Deze Z-projecties van vier confocale coupes tonen de effectiviteit van het protocol voor het visualiseren van morfologische kenmerken alsofzonder individuele cellen in C2 tijdens de late embryonale fase tot en met de vroege en midden L3-stadia van de drosophila-ontwikkeling. De ontwikkeling van de testes is een bijzonder geschikt systeem om de effectiviteit van het protocol te illustreren, omdat de rijping van de testes dynamisch verloopt gedurende de larvale ontwikkeling.Deze afbeeldingen tonen kiemcellen in het rood en hubcellen en FU-zones in het groen in enkele confocale secties van hersenen in het midden van het L3-stadium. Immunokleuring voor ganglionmoedercellen, ongedifferentieerde neuronen in het groen en onrijpe en primaire neuronen in het rood tonen een sterke kleuring met duidelijke expressiepatronen in de hersenkwabben en het ventrale zenuwstreng; afhankelijk van de oriëntatie bij het monteren maakt de beeldvorming visualisatie van het hersenweefsel mogelijk vanaf het dorsale oppervlak, het ventrale oppervlak of in een sagittale dwarsdoorsnede.Deze in situ-techniek stelt biologen in staat om orgaanontwikkeling en weefselmorfogenese te onderzoeken in organismen waarbij een beschermende cuticula de penetratie van antilichamen verhindert. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u laat-embryonale en larvale slokdarmmonsters moet soniceeren en immunokleuren om ontwikkelende weefsels in C two te visualiseren. Vergeet niet dat het werken met formaldehyde, heptaan en methanol uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, noodzakelijk zijn.Tijdens het uitvoeren van deze procedure dient altijd rekening te worden gehouden met het dragen van geschikte handschoenen en een laboratoriumjas.

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Een protocol van gehele immuunkleuring op bladluisembryo's wordt gepresenteerd, waarin kritieke omstandigheden voor het verminderen van achtergrondkleuring en het verhogen van weefseldoorlaatbaarheid worden behandeld. Deze omstandigheden zijn specifiek ontwikkeld voor effectieve detectie van eiwitexpressie in de embryonale weefsels van bladluizen.

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo&#39;s: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer een efficiënte sonificatieprotocol voor immunofluorescentiekleuring van Drosophila melanogaster embryo's en larven zonder dissectie. Deze methode verbetert antilichaampenetratie voor visualisatie van eiwitexpressie.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale

Meer video's verkennen