Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in Arabidopsis

Het algemene doel van deze procedure is om Arabidopsis Vues voor te bereiden voor gehele mount hybridisatie en immunokleuring. Dit wordt bereikt door eerst verse bloemknoppen te fixeren in de fixeervloeistof. De tweede stap is om zorgvuldig vues te dissecteren en in miniatuur acrylamide pads direct op microscoopglazen in te bedden.

Vervolgens maakt weefselverwerking weefselklaring en permeatie mogelijk. De laatste stap is om de behandelde monsters te incuberen met een antilichaamoplossing voor immunokleuring of een gelabelde sonde voor fluorescente in C twee hybridisatie. Uiteindelijk maakt hoge resolutie confocale beeldvorming gevolgd door driedimensionale reconstructie, kwantitatieve analyse mogelijk in gehele mount op het niveau van één cel.

Deze methode werd aanvankelijk gebruikt om inzicht te verkrijgen in CT-organisatie in de view, maar het zou ook kunnen worden toegepast om andere celcompartimenten in andere weefsels van de duik en in andere modelorganismen te analyseren In micro fuge buisjes gevuld met vers gemaakte BBO-buffer gekoeld op ijs bij 20 tot 30 carpale per buisje, zet de buisjes zachtjes te wiegen bij kamertemperatuur gedurende een half uur. Draai vervolgens de buisjes een minuut lang bij 400 Gs naar beneden. Zuig vervolgens voorzichtig de supernatanten af, gooi ze weg en voeg een milliliter PBT toe aan de carpale. Plaats de buisjes op ijs voor elke buis met carpale om te monteren.

Heb voorbereid op ijs. Vijf buisjes met 200 microliter. Een vers gemaakt 5%acrylamide mix.

Vijf schone super frost glijbanen gelabeld met een potlood, een gedachte Eloqua van 20%a PS en een gedachte Eloqua van 20%NAPS van één buisje van carpale. Neem er vier of vijf met een gesneden eindpunt op en plaats ze elk op een glijbaan. Verwijder het overtollige vocht door voorzichtig te pipetteren met behulp van fijne naalden.

Maak longitudinale sneden in de carpale en verwijder de carpale wanden om de rijen vues vrij te maken. Deze stap vereist oefening. Voorkom dat de vues uitdrogen door tot 10 microliter PBS toe te voegen, vervolgens naar een micro fuge buisje met de acrylamide mix.

Voeg snel 12 microliter NAPS en 12 microliter a PS toe.Meng de oplossing goed door te pipetteren en voeg snel 30 microliter van deze geactiveerde acrylamide toe. Meng op een glijbaan met gedissekteerde vues. Plaats voorzichtig een klein dekglas op de voorbereiding en laat de oplossing ongeveer een uur bij kamertemperatuur polymeriseren.

Bereid elke glijbaan later op deze manier voor. Gebruik een scheermes om de dekglazen af te chippen. De monsters kunnen worden bewaard overnacht bij vier graden Celsius in een coplan-pot met PBS of direct doorgaan met de verwerking.

Verwerking moet over het algemeen worden uitgevoerd in coplan potten met 80 milliliter oplossing. En onder de afzuigkap. Begin met het klaren van het weefsel door incubatie in een oplossingsreeks van methanol ethanol, een een-op-een ethanol xyleen oplossing, en weer in ethanol en vervolgens methanol.

Elke bad is vijf of 30 minuten. Zie de tekstprotocol. Gebruik vervolgens een een-op-een methanol PBT oplossing met 2,5% formaldehyde gedurende 15 minuten.

Spoel vervolgens het weefsel twee keer in PBT gedurende 10 minuten per bad. Hierna kunnen de glijbanen indien nodig worden bewaard overnacht bij vier graden Celsius. Neem vervolgens tot zes glijbanen uit de pot en laat het overtollige vocht weglopen.

Plaats ze op een papieren doek en voeg snel 100 microliter van een gekoelde celafbraak enzym toe. Meng op de pads. Bedek vervolgens de glijbanen met grote dekglazen.

Incubeer de glijbanen gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Het is belangrijk om de CO-verteringstemperatuur voor elke nieuwe enzymatische oplossing te optimaliseren, omdat deze stap cruciaal is voor een homogene kleuring later. Was de glijbanen twee keer met PBT gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Draai de glijbanen nu af naar elke glijbaan. Voeg 100 microliter RNAs A in PBS toe, aangevuld met 1% tween en incubeer de glijbanen gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Na de incubatie, was de glijbanen twee keer met PBT zoals eerder, en fixeer vervolgens het weefsel opnieuw door de glijbanen 20 minuten in een bad met vers gemaakt PBTF te incuberen. Spoel de PBTF af met één wasbeurt in PBT gedurende 10 minuten.

Ga vervolgens verder met weefselpermeatie door de glijbanen gedurende twee uur bij vier graden Celsius in PBS met 2% tween te incuberen. Gebruik twee wasbeurten in PBT van elk vijf minuten om de permeabele oplossing te verwijderen. Ga vervolgens verder met immunokleuring.

Begin met het incuberen van de glijbanen in het primaire antilichaam van belang. Breng 100 microliter aliquots van het antilichaam verdund in PBS en met 0,2% tussen op elke glijbaan aan. Breng de glijbanen over naar een vochtige kamer en incubeer ze gedurende 12 tot 24 uur bij vier graden Celsius.

Was de glijbanen in een bad van PBT gedurende twee tot vier uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 100 microliter secundair antilichaam toe, verdund een op 200 in PBS met 0,2% tussen 20, en incubeer de glijbanen gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Een bad van een uur in PBT met zacht schudden is voldoende om de glijbanen van ongebonden secundair antilichaam te wassen.

Vervolgens tegenkleuren het DNA met een oplossing van 10 microgram per milliliter propidiumjodide in PBS. Laat de kleuring 15 minuten doorgaan en was vervolgens de glijbanen met PBT met zacht schudden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Monteer nu de glijbanen met een anti-vervagen medium aangevuld met 10 microgram per milliliter propidiumjodide.

Laat het een uur staan en beeld de glijbanen af op een confocale microscoop met behulp van een 63 x glycerol-immersielens. Dus