Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in

Het algemene doel van deze procedure is om Arabidopsis-bloemen voor te bereiden voor hele montage-hybridisatie en immunokleuring. Dit wordt bereikt door eerst verse bloemknoppen te fixeren in de fixatieoplossing. De tweede stap is om de bloemen zorgvuldig te dissekeren en in miniatuur acrylamidepads direct op microscopische glaasjes in te bedden.

De daaropvolgende weefselverwerking maakt weefselklaring en permeatie mogelijk. De laatste stap is het incuberen van de behandelde monsters met een antilichaamoplossing voor immunokleuring of een gelabelde probe voor fluorescentie in situ hybridisatie. Uiteindelijk maakt confocal imaging met hoge resolutie, gevolgd door driedimensionale reconstructie, kwantitatieve analyse in whole mount mogelijk op enkelcelniveau.

Deze methode werd aanvankelijk gebruikt om inzicht te krijgen in de organisatie van CT in het gezichtsveld, maar deze kan ook worden toegepast om andere celcompartimenten in andere weefsels van de plunge en in andere modelorganismen te analyseren. Voeg 20 tot 30 carpals per buis toe aan microcentrifugebuisjes gevuld met vers bereide BBO-buffer, gekoeld op ijs, en laat de buisjes een half uur zachtjes roteren bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buisjes vervolgens gedurende één minuut bij 400 Gs. Aspireer daarna voorzichtig de supernatanten, gooi deze weg en voeg één milliliter PBT toe aan de carpals. Plaats de buisjes op ijs voor elke buis carpals die gemonteerd moet worden.

Op ijs klaargezet. Vijf buisjes bevattende 200 µL van een vers bereid 5% acrylamidemengsel.

Vijf schone super frost-objectglazen gelabeld met een potlood, een oplossing van 20% PS en een oplossing van 20% NAPS uit één buisje carpals. Neem vier of vijf met een afgesneden tip en plaats deze elk op één objectglas. Verwijder het overtollige vloeistof door voorzichtig te pipetteren met fijne naalden.

Maak longitudinale incisies in de carpalia en verwijder de carpale wanden om de rijen vues vrij te maken. Deze stap vereist oefening. Voorkom dat de vues uitdrogen door maximaal 10 µL PBS toe te voegen, en breng ze vervolgens over naar een microcentrifugebuis met het acrylamide-mengsel.

Voeg snel 12 µL NAPS en 12 µL PS.Mix toe. Meng de oplossing goed door te pipetteren en voeg snel 30 µL van dit geactiveerde acrylamide toe. Meng dit op een objectglas met gedisseceerde vues. Plaats voorzichtig een klein dekglas op het preparaat en laat de oplossing ongeveer een uur polymeriseren bij kamertemperatuur.

Bereid elke slide later op deze manier voor. Gebruik een scheermesje om de dekglasjes af te chippen. De monsters kunnen overnight bij vier graden Celsius in een coplan-pot met PBS worden bewaard of direct worden verwerkt.

Over het algemeen dient de verwerking plaats te vinden in coplan-potjes met 80 milliliters oplossing, onder de zuurkast. Begin met het klaren van de weefsels door incubatie in een reeks oplossingen van methanol, ethanol, een ethanol-xyleenoplossing in een verhouding van één-op-één, en vervolgens opnieuw in ethanol en daarna in methanol.

Elk bad duurt vijf of 30 minuten. Raadpleeg het tekstprotocol. Gebruik vervolgens gedurende 15 minuten een methanol-PBT-oplossing in een verhouding van één-op-één met 2,5% formaldehyde.

Spoel het weefsel vervolgens tweemaal 10 minuten per bad in PBT. Hierna kunnen de coupes indien nodig gedurende de nacht bij vier graden Celsius worden bewaard. Neem vervolgens tot zes coupes uit de pot en laat het overtollige vloeistof weglopen.

Plaats ze op een stukten weefselpapier en voeg snel 100 µL van een gekoeld celwandverteringsenzym toe. Meng dit op de kussentjes. Dek de objectglaasjes vervolgens af met grote dekglasjes.

Incubeer de coupes gedurende twee uur bij 37 °C in een vochtige kamer. Het is belangrijk om de temperatuur van de CO-digestie te optimaliseren voor elke nieuwe enzymatische oplossing, aangezien deze stap cruciaal is voor een homogene kleuring later. Was de coupes twee keer met PBT gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Laat de coupes nu vervolgens uitlekken. Voeg 100 µL RNAse A in PBS aanvullend met 1% Tween toe en incubeer de coupes gedurende een uur bij 37 °C in een vochtige kamer. Was de coupes na de incubatie tweemaal met PBT zoals voorheen, en fixeer het weefsel vervolgens opnieuw door de coupes 20 minuten te incuberen in een bad van versbereid PBTF. Spoel het PBTF af met één wasbeurt in PBT gedurende 10 minuten.

Ga vervolgens over tot weefselpermeabilisatie door de coupes twee uur lang te incuberen in PBS met 2% tween bij vier graden Celsius. Gebruik twee wasstappen in PBT van elk vijf minuten om de permeabilisatie-oplossing te verwijderen. Ga daarna verder met de immunokleuring.

Begin met het incuberen van de coupes in het primaire antilichaam van interesse. Breng 100 µL aliquots van het antilichaam, gedilueerd in PBS en met 0,2% tussenin, aan op elke coupe. Plaats de coupes in een vochtige kamer en incubeer ze bij 4 °C gedurende 12 tot 24 uur.

Was de objectglazen gedurende twee tot vier uur in een bad van PBT met zachte schudbewegingen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 100 µL secundair antilichaam toe, verdund 1:200 in PBS met 0,2% tussen 20 en incubeer de objectglazen gedurende 24 uur bij 4 °C. Een bad van één uur in PBT met zachte schudbewegingen is voldoende om de objectglazen te wassen en ongebonden secundair antilichaam te verwijderen.

Kleur vervolgens het DNA tegen met een oplossing van 10 µg/mL propidiumjodide in PBS. Laat de kleuring 15 minuten inwerken en was de preparaten daarna met PBT gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtige schommeling. Monteer de preparaten nu met een anti-fade medium aangevuld met 10 µg/mL propidiumjodide.

Laat de preparaten een uur lang uitharden en beeld them vervolgens met een confocale microscoop met behulp van een 63 x glycerol-immersielens. Tijdens de beeldacquisitie is het essentieel om de scaninstellingen tussen de monsters identiek te houden om comparatieve kwantificering mogelijk te maken en om een lineaire detectiemodus te gebruiken. Reconstrueer later de seriële beelden tot driedimensionale structuren, segmenteer elke relevante nucleus en gebruik 3D-beeldverwerkingssoftware om de signalen te kwantificeren.

Door gebruik te maken van dit robuuste preparatieprotocol op grote schaal, behouden whole mount views hun driedimensionale structuur. Subcellulaire structuren worden zichtbaar met een hoge detaillering, zoals te zien is bij chromatine. Bij het kleuren van DNA verschijnt heterochromatine als heldere en scherp gedefinieerde foci zonder dat deconvolutie hoeft te worden toegepast.

Dit protocol maakt parallelle immunokleuring met verschillende antilichamen in één ronde mogelijk. Bijvoorbeeld, de met euchromatine geassocieerde permissieve marker, H3K4me3, en de met heterochromatine geassocieerde marker H3K27me1 werden beide in één experiment gedetecteerd op afzonderlijke replica-dia's om chromatinedynamiek te analyseren. Een andere compatibele techniek is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor 45S rRna.

DNA-herhalingen werden gebruikt om nucleaire organisatiegebieden te definiëren. De probe werd direct gelabeld met Alexa 488 en het DNA werd tegengekleurd. Voor identificatieanalyse is het zeer belangrijk om verschillende antilichaamverdunningen en incubatietijden te testen om de condities te bepalen die een robuust en homogeen signaal geven met de laagst mogelijke antilichaamconcentratie.

Aangezien deze methode een uitstekende behoud van het weefsel en een optimale permeatie voor enkelcelanalyse van de chromatinestructuur bereikt, baant het de weg voor wetenschappers in het veld van de plantencelbiologie of plantenepigenetica om de nucleaire of subcellulaire organisatie op enkelcelniveau en in de context van de volledige plant te onderzoeken.