Name: Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer een efficiënte methode voor immunokleuring en FISH in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. Deze techniek maakt kwantitatieve single-cel analyse van chromatine modificaties en nucleaire architectuur mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken ons bij Ueli Grossniklaus (Universiteit van Zürich) voor technische en financiële ondersteuning. We zijn dankbaar aan Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos en Peter Kopf voor algemene labondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Universiteit van Zürich, subsidies van de Zwitserse Nationale Stichting aan CB (31003A_130722) en Ueli Grossniklaus (31003A_141245 en 31003AB-126006), en de Agence Nationale de la Recherche aan DG (Programma ANR-BLANC-2012).

De procedure wordt beschreven in de workflow in figuur 1, en ​​de opstelling voor dissectie en inbedding van weefsels zijn weergegeven in figuur 2. 1. Tissue Fixation <ol><li> Verzamel 20-30 carpels in een microfugebuis met vers gemaakte BVO fixatief buffer op ijs. </li><li> Bevestig het weefsel 30 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Draai de buisjes met de carpels in fixeermiddel in een tafelmodel microcentrifuge 1 min bij 400 x g. </li><li> Verwijder voorzichtig het fixatief buffer en voeg 1 ml van PBT, plaatst de buizen op ijs. </li></ol> 2. Dissection and Embedding <ol><li> Bereid vijf Eppendorf buizen met elk 200 pl van een vers bereide, 5% acrylamide mix. </li><li> Bereid vijf Superfrost dia vooraf gereinigd met 70% ethanol en gelabeld met een potlood. </li><li> Dooi een hoeveelheid van 20% APS en 20% dutjes elk, op ijs. </li><li> Neem 4-5 carpels met een cut-end tip, plaatsze op een schoon objectglas, verwijder de overtollige vloeistof. </li><li> Maak sneetjes die met een fijne naald en verwijder de carpel muren om rijen van eitjes los zoals getoond Figuur 2, voorkomen dat ze uitdrogen door afdekken met PBS (niet meer dan 10 pl). </li><li> Voeg snel en meng 12 pl dutjes, 12 pi APS met een portie van 200 pl acrylamide mix. </li><li> Voeg 30 ul van de geactiveerde acrylamide op de eitjes ontleed. </li><li> Bedek met een dekglaasje 20 mm x 20 Laten polymeriseren bij kamertemperatuur 45-60 min. </li><li> Verwijder het dekglaasje met een scheermesje. In dit stadium kan de monsters overnacht bewaard bij 4 ° C in een Coplin pot met PBS. </li></ol> 3. Weefsel bewerken OPMERKING: alle stappen behalve 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 en 3.4.3 zijn opgenomen in Coplin potten uitgevoerd met 80 ml oplossing onder de chemische kap bij kamertemperatuur. Dia&#39;s worden overgebracht met een flatscreen-tip pincet. <ol><li> Tissue verduidelijking enfixatie: <ol><li> Incubeer 5 min in methanol. </li><li> Incubeer 5 min in ethanol. </li><li> Incubeer 30 min in ethanol: xyleen (1:1). </li><li> Incubeer 5 min in ethanol. </li><li> Incubeer 5 min in methanol. </li><li> Incubeer 15 min in methanol en PBT (01:01), aangevuld met 2,5% formaldehyde. </li><li> Spoel 2 x 10 min in PBT. In dit stadium kan dia nachts bewaard bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Celwand spijsvertering: <ol><li> Dooi een hoeveelheid van de celwand spijsvertering mix op ijs. </li><li> Neem een ​​dia uit de Coplin pot, afvoer van de overtollige vloeistof door het plaatsen van het verticaal op een papieren handdoek. </li><li> Voeg 100 ul van celwand spijsvertering mix over de acrylamide pad en dek af met een 23 x 46 mm dekglaasje. Herhaal dit voor de andere dia&#39;s. Incubeer 2 uur bij 37 ° C in een vochtige kamer (beschreven in Materials). </li><li> Was de dia&#39;s 2 x 5 min in PBT. </li></ol></li><li> RNase A behandeling: <ol><li> Neem een ​​dia uit de Coplin pot, afvoer the overmaat vloeistof als voorheen. </li><li> Incubeer elk glaasje met 100 ul RNAse bij 100 ug / ml in PBS met 1% Tween-20 gedurende 1 uur bij 37 ° C in een vochtige kamer. </li><li> Was de dia&#39;s voor 2 x 5 min in PBT. </li></ol></li><li> Post-fixatie en permeabilisatie: <ol><li> Post-fix voor 20 min in vers gemaakte PBT-F. </li><li> De dia&#39;s spoelen gedurende 10 minuten in PBT. </li><li> Doorlaatbaar voor 2 uur in PBS met 2% Tween-20 bij 4 ° C. </li><li> De dia&#39;s Spoel voor 2 x 5 min in PBT. </li></ol></li></ol> 4. Immunokleuring OPMERKING: Voor deze stap de optimale concentratie van het primaire antilichaam worden getest met behulp van verschillende verdunningen (1:200, 1:500, 1:1000) van de antilichamen. <ol><li> Incubeer elke dia met 100 ul van primair antilichaam verdund in PBS met 0,2% Tween-20 gedurende 12-24 uur bij 4 ° C. </li><li> Was de dia&#39;s in PBT gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur onder rustig schudden. </li><li> Breng desecundair antilichaam 1:200 in PBS + 0,2% Tween-20 gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Was de glaasjes in PBT gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder rustig schudden. </li><li> Tegenkleuring met 10 ug / ml propidiumjodide in PBS gedurende 15 minuten, spoel dan 15 min in PBS onder voorzichtig schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Mount in anti-fading vloeistof inbedmiddel aangevuld met 10 ug / ml propidiumjodide. Laat de montage medium verharden voor 1 uur voor het ophalen van afbeeldingen door CLSM. </li></ol> 5. Quantitative Imaging <ol><li> Beeldopname: <ol><li> Acquire hoge resolutie beelden met behulp van CLSM, idealiter met een resonantie scan mode, die beter behoud van fluorescerende signalen over langere beeldvorming 23, en een 63X glycerol immersie lens maakt. </li><li> Test de acquisitie parameters zoals laser intensiteit, gain, pinhole, voxelgrootte en zoomfactor aan het begin van het experiment om een ​​standaard procedure voor opname definiëren strikt op te volgen gedurendealle dia&#39;s voor een consistente kwantitatieve metingen. </li><li> Controleer de afwezigheid van overspraak tussen fluorochromen. Indien aanwezig, het opzetten van een sequentiële scan. Acquire transmissie beelden afzonderlijk en niet gelijktijdig. </li><li> Voer seriële drie-dimensionale beeldacquisitie met de hoogst mogelijke resolutie in de x en y afmetingen en met 2x oversampling in de z dimensie (voorschrift Nyquist). </li></ol></li><li> Beeldverwerking: <ol><li> Reconstrueren seriële afbeeldingen in drie dimensies met behulp van commerciële of open source software. </li><li> Definieer contouroppervlakken rond elke kern (of cel) van belang zijn in 3D. </li><li> Kwantificeer fluorescentie in elk kanaal als de som van de pixelintensiteiten in elk object. </li><li> De gegevens te exporteren naar Excel voor statistische analyses. Normaliseren antilichaam signalen tegen bijvoorbeeld DNA vlekken signalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+introduction+to+the+embryology+of+angiosperms%22">An introduction to the embryology of angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li>
<li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li>
<li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li>
<li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li>
<li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li>
<li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li>
<li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development%3A+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li>
<li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li>
<li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li>
<li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li>
<li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li>
<li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+%28Zea+mays%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li>
<li>Niedojadło, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li>
<li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+%28Illiciaceae%3B+Austrobaileyales%29%3A+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots%2C+eumagnoliids%2C+and+eudicots%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li>
<li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis%3A+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li>
<li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li>
<li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li>
<li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li>
<li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li>
<li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li>
<li>Lysak, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLysak%2C+M+%22Cytogenetic+analyses+of+Arabidopsis+In+Arabidopsis+Protocols%3A+Methods+in+Molecular+Biology%2C+2nd+ed%22">Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).</li>
<li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feulgen+reaction+75+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Procedures+for+In+Situ+Hybridization+to+Chromosomes%2C+Cells%2C+and+Tissue+Sections.+Nonradioactive+in+situ+hybridization+application+manual%22%5BJournal%5D)">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In bloeiende planten, wordt het vrouwelijke reproductieve lineage omgeven door verschillende cellagen waaronder de nucellus en de eicel Zaadhuiden, dus waardoor cytologische kleuring in whole-mount technisch uitdagend. Hier geven we een efficiënt protocol waarvan de bereiding en verwerking van een groot aantal eicellen voor cytologische kleuring als immunokleuring, DNA-kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie geheel-mount. Wij hebben met succes gebruikt voor de analyse van het vrouwelijk voortplantingssys...

In bloeiende planten, de oprichting van reproductieve geslachten begint met de differentiatie van SMC, MMC vrouwelijke en mannelijke microspore moeder cel. De MMC ontwikkelt zich uit een sub-epidermale nucellar cel aan het distale uiteinde van de eicel primordium, en de microspore moeder cel ontwikkelt zich vanuit sporogenous weefsel in de helmknop locule, die zich diep in de bloemen organen 1. SMC ondergaan meiose tot haploïde sporen, die vervolgens leidt tot de gametofyten bij mitose produceren. Het vrouwtje gametofyt of embryozak, bestaat uit een eicel, een centrale cel, twee synergiden en drie antipodals. De mannelijke gametofyt, of pollen, bestaat uit een vegetatieve cel en twee spermacellen. Terwijl de mannelijke gametofyt blijft een relatief toegankelijke object-van-studie, wordt de vrouwelijke gametofyt ingebed in de eicel, zelf ingesloten in de bloem carpel, en vormt daarmee specifieke uitdagingen aan moleculaire en cytologische analyses. Onlangs echter, laser-geassisteerdemicrodissection bood een elegante oplossing waarmee transcriptomische analyseert in het MMC en vrouwelijke gametofytische cellen 2-4. Naast kandidaat genexpressie-analyses, met behulp van bijvoorbeeld RNA in situ hybridisatie of reportergen assays, cytologische analyses maakt het onderzoek naar de dynamiek van endogene cellulaire componenten met behulp van specifieke, directe cellulaire kleuring of indirecte immunostaining. Bijzonder, cytogenetische kleuring met behulp van FISH en DNA-kleuring, samen met immunokleuring van chromatine modificaties of chromatine onderdelen staan ​​centraal benaderingen van de dynamiek van chromatine en nucleaire organisatie te ontrafelen in Arabidopsis 5. Typisch, meiose houdt specifiek chromosoom dynamiek die is goed bestudeerd in plantencellen mannelijke meiocytes 6,7; verdere grootschalige, cel-specifieke chromatine reorganisatie, waarschijnlijk als gevolg van dynamische epigenetische herprogrammering is beschreven tijdens pollenontwikkeling 8-10. Daarentegen, als gevolgde relatieve ontoegankelijkheid van vrouwelijke meiocyte en gametophyte, deze onderzoeken blijven technisch moeilijk toe te passen en vereisen vaak snijden of handmatige dissectie en enzymatische digestie (zie hieronder). Daarnaast is het heersende gebrek aan optische helderheid in whole-mount is een belemmering voor hoge-resolutie beeldvorming van geslachtscellen in intacte eitjes. Een klassieke methode voor cytologische analyse van chromosoom organisatie in zijn geheel-mount ovules gebruikt Feulgen&#39;s kleuring 11-13. Het gaat zure hydrolyse (met hypochloorzuur) van het DNA waardoor eiwitdenaturatie en daarmee veroorzaakt vernietiging van de chromatinestructuur. Als alternatief kan chromosoom organisatie in vrouwelijke meiocytes en gametophytic cellen worden waargenomen met behulp van DAPI kleuring en immunostaining op semi-dunne secties of ontleed embryozakken en MMC (zie bijvoorbeeld 14-18). Het is echter duidelijk, handleiding dissectie en snijden kan arbeidsintensief zijn enbelemmert de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van een groot aantal epitopen chromatine. Hier geven we een efficiënt protocol voor een groot aantal Arabidopsis eicellen geschikt voor een verscheidenheid van downstream cytologische kleuring in whole-mount te bereiden. In het kort, zijn bloemknoppen geïncubeerd in een fixeeroplossing, zijn rijen eitjes ontleed uit de carpel en ingebed in acrylamide op dia zoals voor pollen meiocytes 19,20. De ingesloten ovules verder verwijderd en gefixeerd in methanol, ethanol en xyleen voor celwand spijsvertering en permeabilisatie. Mogelijke variaties van deze stappen worden besproken. De monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor DNA-kleuring, immunokleuring en FISH. De bereiding modus is efficiënt en maakt parallelle proefopstelling (maximaal 16 objectglaasjes kunnen worden bereid in een dag voor verschillende stroomafwaartse analyse). De beschreven behandelingen mogelijk te maken homogeen signalen in whole-mount en goed bewaard gebleven histologische, cellulair,en nucleaire organisatie in geslachtscellen en de omliggende nucellar cellen die kwalitatieve en kwantitatieve vergelijkingen tussen celtypen profiteren. Gekalibreerd, CLSM-based high-resolution imaging gevolgd door 3-dimensionale reconstructie maakt zinvolle kwantitatieve metingen van fluorescerende signalen. Wij hebben met succes gebruik gemaakt van deze procedure om de dynamiek van chromatine te analyseren in de differentiërende MMC-21 en het ontwikkelen van vrouwelijke gametofyt 22; We presenteren hier representatieve resultaten van heterochromatin analyse, chromatine immunostaining, GFP immunostaining en FISH in hele-mount eitjes. Verder geloven wij dat ons protocol geschikt voor andere plantaardige weefsels en soorten zullen zijn.

<table><tbody><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO Fixatie Buffer (gebaseerd op32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehyde</td></tr><tr><td>30% acrylamid:bisacrylamide</td><td></td><td></td><td>3 g acrylamid, 0,33 g bisacrylamide, 1x PBS (bereid 10 ml, bewaar bij 4 &deg;C)</td></tr><tr><td>200 ml 5% acrylamid mix in PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30% acrylamid:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (maak vers uit 30% stock)</td></tr><tr><td>20% ammoniumpersulfaat</td><td></td><td></td><td>0,2 g ammoniumpersulfaat, 1 ml steriel water (bereid aliquots met 1 ml en bewaar bij -20 &deg;C)</td></tr><tr><td>20% natriumsulfiet</td><td></td><td></td><td>0,2 g natriumsulfiet, 1 ml steriel water (bereid aliquots met 1 ml en bewaar bij -20 &deg;C)</td></tr><tr><td>Celwand enzym mix</td><td></td><td></td><td>0,5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0,5% (w/v) pectolyase</td></tr><tr><td>Reagentia en Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisacrylamide</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>ammoniumpersulfaat</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfiet</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-trimethyl-Histon H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti- monomethyl-Histon H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488~geit~anti~konijn (H+L)</td><td>Molecular Probe</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin pot</td><td>Huber &amp; CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schakelaar</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Vochtige kamer</td><td></td><td></td><td>Een plastic doos met vochtige papieren handdoek binnenin, een plastic ondersteuning wordt in de doos geplaatst om de dia's te ondersteunen en om te voorkomen dat de dia's van het water af blijven.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus schuif</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gläser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en nucleaire architectuur in zijn geheel-mount ovules in<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In bloeiende planten, is de somatische-to-voortplantingscel lot overgang gekenmerkt door de specificatie van spore moeder cellen (SMC) in floral organen van de volwassen plant. De vrouwelijke SMC (megaspore moeder cel, MMC) onderscheidt in het eitje primordium en ondergaat meiose. De geselecteerde haploïde megaspore ondergaat mitose aan de meercellige vrouwelijke gametofyt, die aanleiding zal geven aan de gameten, de eicel en de centrale cel te vormen, samen met accessoire cellen. De beperkte toegankelijkheid van de MMC, meiocyte en vrouwelijke gametofyt in de eicel is technisch uitdagend voor cytologische en cytogenetische analyses op enkel cel niveau. In het bijzonder wordt direct of indirect immunodetectie van cellulaire of nucleaire epitopen aangetast door slechte penetratie van de reagentia in de plantencel en single-cell imaging wordt demised door het gebrek aan optische helderheid geheel-mount weefsels. Aldus wordt een efficiënte manier de Nucl analyseren ontwikkelden weoor organisatie en chromatine modificatie op hoge resolutie van enkele cel in whole-mount ingebed Arabidopsis eitjes. Het is gebaseerd op dissectie en inbedding van vaste eicellen in een dunne laag acrylamide gel op een microscopisch preparaat. De ingesloten eitjes worden onderworpen aan chemische en enzymatische behandelingen ter verbetering weefsel duidelijkheid en permeabiliteit voor de immunokleuring reagentia. Die behandelingen behouden cellulaire en chromatine organisatie, DNA en eiwitten epitopen. De monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse cytologische analyse, waaronder chromatine immunokleuring, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), en DNA kleuring voor heterochromatine analyse. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beeldvorming met hoge resolutie, gevolgd door 3D reconstructie maakt kwantitatieve metingen bij eencellige resolutie.

Wij bieden een robuust protocol voor grootschalige bereiding en verwerking van Arabidopsis eicellen geschikt zijn voor cytologische kleuring in whole-mount. Door de inbedding, de zaadknoppen behouden van een 3-dimensionale structuur (Figuur 3). Bovendien, het weefsel verwerking, met inbegrip van optische verduidelijking stelt beeldvorming subcellulaire structuren op een hoge resolutie. Figuur 4 toont DNA kleuring in whole-mount eitje primordia waar heterochromatin verschijnt zo...

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om Arabidopsis-bloemen voor te bereiden voor hele montage-hybridisatie en immunokleuring. Dit wordt bereikt door eerst verse bloemknoppen te fixeren in de fixatieoplossing. De tweede stap is om de bloemen zorgvuldig te dissekeren en in miniatuur acrylamidepads direct op microscopische glaasjes in te bedden.De daaropvolgende weefselverwerking maakt weefselklaring en permeatie mogelijk. De laatste stap is het incuberen van de behandelde monsters met een antilichaamoplossing voor immunokleuring of een gelabelde probe voor fluorescentie in situ hybridisatie. Uiteindelijk maakt confocal imaging met hoge resolutie, gevolgd door driedimensionale reconstructie, kwantitatieve analyse in whole mount mogelijk op enkelcelniveau.Deze methode werd aanvankelijk gebruikt om inzicht te krijgen in de organisatie van CT in het gezichtsveld, maar deze kan ook worden toegepast om andere celcompartimenten in andere weefsels van de plunge en in andere modelorganismen te analyseren. Voeg 20 tot 30 carpals per buis toe aan microcentrifugebuisjes gevuld met vers bereide BBO-buffer, gekoeld op ijs, en laat de buisjes een half uur zachtjes roteren bij kamertemperatuur.

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Dit immunolokalisatieprotocol in mannelijke maïsmeiocyten behoudt de driedimensionale integriteit van de cellen tijdens de meiose. Het maakt het mogelijk om de intracellulaire lokalisatie van maximaal drie onafhankelijke antilichamen in geconserveerd paraformaldehyde-gefixeerd materiaal dynamisch te volgen, naast DAPI, dat DNA kleurt.

Driedimensionale immunolokalisatie in maïsmeiocyten

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer een efficiënte methode voor immunokleuring en FISH in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. Deze techniek maakt kwantitatieve single-cel analyse van chromatine modificaties en nucleaire architectuur mogelijk.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in

Meer video's verkennen