Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's
17 mei 2014
Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om oestrogeen-responsieve cellen automatisch te detecteren in levende zebravislarven. Dit wordt bereikt door eerst vijf X-E-R-E-G-F-P volwassen vissen te kweken om oestrogeen-reporter zebravis-embryo's te genereren. Vervolgens worden de embryo's in individuele putjes van een 96-wellplaat geplaatst.
Vervolgens worden oestrogenen aan de plaat met embryo's toegevoegd. Ten slotte wordt de plaat gescand op fluorescentie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde stage. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om weefselspecifieke activiteit van oestrogeenreceptoren te tonen.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek boven andere traditionele technieken zoals high throughput of high content screening, is dat weefselspecifieke fluorescentie in zebravislarven kan worden geïmaged met alleen een standaard epifluorescentiemicroscoop. Uitgerust met een gemotoriseerde stage is er geen gespecialiseerde platelezer nodig. Let op: chemicaliën met BPA en oestradiol zijn gevaarlijk en kunnen schadelijke effecten hebben op de menselijke foetus.
Gebruik endocriene verstoorders met zorg en gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. In deze demonstratie zullen zebravissen worden blootgesteld aan de oestrogenen 17 bèta-oestradiol, bisfenol A en genine in verschillende doses, beginnend 48 uur na bevruchting na het kweken van zebravissen, en het verzamelen en gelijkstellen van eieren. Volgens de tekst op de dag van de behandeling, verdunt u ontdooid stamchemische oplossingen, een tot 1000 in één milliliter E drie B plus PTU krachtig vortexen.
Als voertuigcontrole. Gebruik een een tot 1000 verdunning van DMSO in E drie B en PTU met behulp van een grootboorgeplastische overdracht. Pipetteer drie embryo's per putje in een 96-wellplaat en bereid drie putjes per conditie voor.
Vermijd het plaatsen van embryo's in buitenste putjes om verdamping van het medium tijdens langdurige behandeling te voorkomen. Werk snel om uitdroging van de embryo's te voorkomen, verwijder het medium uit elk putje en voeg 200 microliter van een goed gemengde behandelingsoplossing toe. Controleer visueel of alle embryo's in de oplossing zijn ondergedompeld en niet aan de zijkant van het putje vastzitten.
Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius gedurende 72 uur. Na bevruchting verdooft u de embryo's door 10 microliter van vier milligram per milliliter trica toe te voegen. Plaats de 96-wellplaat op een gemotoriseerde stage en gebruik de Zeiss Zen Blue 2011 software.
Kalibreer de stage door de optie monsterdrager te selecteren en multi well 96 te kiezen. Selecteer vervolgens kalibreren voordat u de stapsgewijze aanwijzingen volgt, gebruik een 10 x objectief en de lichtveld- of BF-instelling, identificeer een positieve controle-embryo en stel de belichtinstellingen passend in voor BF en GFP-kanalen, zorg ervoor dat het fluorescentiesignaal de camera niet verzadigd.
Focus vervolgens op een enkele embryo en programmeer de microscoop om in totaal drie Z-secties te verkrijgen die één afbeelding 50 micrometer boven en één 50 micrometer onder het huidige brandpuntsvlak bevatten.
Vervolgens, om de softwareparameters in te stellen om een gekachelde afbeelding te verkrijgen met behulp van GFP- en BF-kanalen. Selecteer onder het tabblad verwerving geavanceerde setup, selecteer tegelregio's, vervolgens tegels. Kies de cirkel.
Optie put selecteer drager en vulfactor 90% om meerdere afbeeldingen van de geselecteerde putjes vast te leggen, zodat 90% van het oppervlak van elk putje zichtbaar is in de samengestelde afbeelding. Selecteer onder opties de gewenste overlap, zoals vijf tot 10% wat een vlotte naad tussen afbeeldingen mogelijk maakt. Start vervolgens met beeldvorming om afbeeldingen handmatig te vangen met behulp van een 20 x objectief en de BF-instelling, identificeer een positieve controle-embryo.
Stel de BF- en GFP-instellingen in zoals eerder en neem afbeeldingen. Deze figuur toont samengestelde afbeeldingen van individuele putjes van een 96-wellplaat. Elke afbeelding bestaat uit 59 individuele afbeeldingen met 5% afbeeldingoverlap.
Merk op dat de levende zebravissen willekeurig gepositioneerd zijn in elk putje. Toch kunnen we fluorescentie in het hart onderscheiden van fluorescentie in de lever. Lichtveldafbeeldingen zijn nuttig als referentie om de oriëntatie van zebravissen te beoordelen en morfologische afwijkingen te visualiseren.
De hier getoonde afbeeldingen zijn gemaakt met een 20 x lange werkafstand objectief voor meer gedetailleerde analyse, en zijn direct na de zojuist getoonde geautomatiseerde scan gemaakt zonder de plaat van de microscoopstand te verwijderen. Met behulp van een 20 x objectief kan de fluorescentie in het hart precies worden gelokaliseerd naar de atriale ventrikelkleppen, aangegeven door de pijlen en de aortakleppen zoals aangegeven door de pijlpunt. Zodra deze techniek is beheerst, kunnen er per dag afbeeldingen van 3 96-wallplaten worden vastgelegd.
Vergeet niet dat het werken met endocriene verstoorders gevaarlijk kan zijn, dus neem altijd de juiste voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefselspecifieke fluorescentie in zebravissenembryo's, met de nadruk op oestrogeen-responsieve cellen. De procedure maakt gebruik van fluorescentiemicroscopie om de activiteit van oestrogeenreceptoren in levende zebravislarven te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Fluorescentie-imaging
Achtergrond
- Oestrogeenreceptoren spelen een cruciale rol in diverse biologische processen.
- Zebravis dient als modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkelingsbiologie.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van specifieke cellulaire activiteiten mogelijk.
- Geautomatiseerde beeldvormingstechnieken verhogen de efficiëntie van de gegevensverzameling.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het detecteren van oestrogeen-responsieve cellen in zebravissen.
- Het verbeteren van de nauwkeurigheid en efficiëntie van beeldvormingstechnieken in levende embryo's.
- Het bijdragen aan het begrip van de activiteit van de oestrogeenreceptor tijdens de ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Fokken van volwassen X-E-R-E-G-F-P zebravissen om embryo's te genereren.
- Plaatsen van embryo's in individuele putjes van een 96-wells plaat.
- Toevoeging van oestrogenen aan de putjes met embryo's.
- Scannen van de plaat op fluorescentie met een epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde tafel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van oestrogeen-responsieve cellen in levende zebravislarven.
- Visualisatie van weefselspecifieke activiteit van oestrogeenreceptoren.
- Demonstratie van de effectiviteit van het semi-geautomatiseerde imaging-protocol.
- Bijdrage aan het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie door verbeterde imaging-technieken.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van de activiteit van de oestrogeenreceptor.
- Geautomatiseerde beeldvorming kan onderzoeksprocessen aanzienlijk stroomlijnen.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrip van hormonale invloeden op de ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze semi-geautomatiseerde beeldvormingsaanpak maakt kosteneffectieve, weefselspecifieke fluorescentiedetectie in zebravissenembryo's mogelijk met behulp van standaard microscopieapparatuur, waardoor de afhankelijkheid van dure high-content screening-systemen wordt verminderd. Door estrogenereceptorligand-screening met ruimtelijke resolutie te ondersteunen, vergroot het de betrouwbaarheid van targetvalidatie in assays voor endocriene disruptie. De methode is geschikt voor vroege discovery-workflows waarbij mechanistische risicovermindering en voorspellende waarde prioriteit hebben boven lead-optimalisatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar weefselspecifieke activatie van de oestrogeenreceptor mogelijk om de functionele target-binding in vivo te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van transgene reporterlijnen om ligand-geïnduceerde GFP-expressie te kwantificeren in gedefinieerde weefsels, zoals hartkleppen versus de lever.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door on-target endocriene activiteit te onderscheiden van off-target of cytotoxische effecten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt zebrafish-embryo's voor in een 96-wells formaat voor blootstelling aan verbindingen en geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming.
- Kwantitatieve output: Genereert getegelde brightfield- en GFP-beelden die handmatige scoring van weefselspecifieke fluorescentiepatronen mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Compatibel met gemotoriseerde tafelbladen op standaard epifluorescentiemicroscopen, waardoor de verwerking van meerdere platen per dag mogelijk is zonder gespecialiseerde readers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert oestrogeen-responsieve weefsels om ontwikkelingsgerelateerde endocriene disruptie te beoordelen, wat relevant is voor screening op reproductieve en metabole toxiciteit.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro receptorbindingsassays en weefselresponsen op het niveau van het hele organisme in een gewerveld systeem.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Helpt bij het prioriteren van verbindingen met selectieve weefselactivatieprofielen voor verdere preklinische evaluatie.
Integratie van pipeline & workflow
De methode ondersteunt een continuüm van ontdekkingen, van targetvalidatie via assayontwikkeling tot mechanistische profilering, in het bijzonder voor nucleaire receptor-modulatoren waarbij weefselselectiviteit informatie verschaft over veiligheidsmarges.
- Ontdekkingsbiologie: Test de transcriptionele activiteit van oestrogene receptoren in levende embryo's, waardoor weefselspecifieke responsen worden verduidelijkt die verder gaan dan eenvoudige bindingsassays.
- Screening: Maakt geautomatiseerde beeldverzameling in 96-wells platen mogelijk, wat de reproduceerbaarheid en doorvoer voor fluorescentiegebaseerde ligandscreening verbetert.
- Analytiek: Levert ruimtelijke fluorescentie-readouts die discriminatie tussen weefsels mogelijk maken, wat een vergelijkende analyse van de effecten van verbindingen ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire initiële gebeurtenissen met uitkomsten op weefselniveau in een ontwikkelend gewerveld dier, waardoor de voorspelbaarheid van ontwikkelingstoxiciteit wordt verbeterd.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform dat toepasbaar is op andere transgene reporters buiten de oestropeensignalering.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door weefselspecifieke signaleringspatronen bloot te leggen die in bulk-assays over het hoofd worden gezien.
- Operationele waarde: Standardiseert de hantering en beeldvorming van embryo's via gemotoriseerde tafelstelsels, wat de reproduceerbaarheid tussen gebruikers en laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Vermindert uitval in een laat stadium door endocrine-disruptieve risico's in een vroeg stadium met ruimtelijke resolutie te identificeren.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen door liganden met gewenste weefselselectieve profielen te highlighten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het houden van zebravissen, het onderhoud van transgene lijnen en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot epifluorescentiemicroscopen met gemotoriseerde tafels en compatibele acquisitiesoftware (bijv. Zeiss Zen Blue).
- Vereist standaardisatie van de embryonale stadia, de timing van chemische blootstelling en focusprotocollen tussen gebruikers.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij toepassing op verschillende weefselspecifieke reporters of ontwikkelingsstadia.
- Bevat praktische beperkingen, zoals handmatige beeldinspectie voor fluorescentiescoring en variabiliteit in de oriëntatie van embryo's binnen de wells.
