Name: Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde beeldvormingsmethode voor weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's. Dit protocol detecteert oestrogeen-responsieve cellen met fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Susan Farmer en het personeel van de UAB zebravis onderzoeksfaciliteit voor zebravis zorg. Financiering verstrekt door start-up fondsen van de afdeling Farmacologie en Toxicologie.

OPMERKING: Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Zebravis Fokkerij en Ei Collecties <ol><li> Drie dagen voor het begin van blootstelling aan chemische stoffen, assembleren kweekbakken met verdelers om aparte mannen en vrouwen. Vul elke tank halverwege met aquacultuur systeem water. Met behulp van een net, overdragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 vis kweekbakken, het plaatsen van 2 reutjes en 3 teefjes in elke tank gescheiden door een scheidingswand. Leg een deksel op elke tank en label met datum en stammen worden overschreden. </li><li> De volgende ochtend, verwijder alle barrières en tilt schotten tot een ondiep gebied te creëren aan de ene kant van de kweekbak. Laat zebravis om te paren, het verzamelen van embryo&#39;s in 10 min. intervallen om precies ontwikkelingsstoornissen enscenering garanderen. Clean eieren door spoelen door een theezeefje behulp E3B medium en voorzichtig spoelen embryo&#39;s in petrischalen. Terug volwassen vissen naar permanentetanks. </li><li> Met behulp van een microscoop ontleden, sorteren, tellen, en verwijder eventuele onbevruchte, abnormale of beschadigde embryo&#39;s. Plaats embryo&#39;s in petrischaaltjes in E3B medium en huis bij 28,5 ° C met een 14:10 licht: donker cyclus. Embryo dichtheid kan beïnvloeden ontwikkeling. Plaats niet meer dan 100 embryo&#39;s in een 100 x 35 mm schaal en niet meer dan 50 embryo&#39;s in een 60 x 15 mm schaal. </li><li> Door 24 HPF, vervang media E3B die 200 uM 1-fenyl 2-thio (PTU). PTU voorkomt pigmentvorming en houdt zebravis embryo&#39;s en larven transparant voor verbeterde beeldhelderheid. LET OP: geconcentreerde PTU voorraad is gevaarlijk; Draag handschoenen bij het maken E3B + PTU oplossing. </li><li> Op 1 dag na de bevruchting (DPF), handmatig de chorion van elk embryo met behulp van fijne pincet verwijderen. De chorion lijkt geen invloed op de penetratie van oestrogenen, maar verwijdering verbetert helderheid van het beeld. Er hoeft chorions van de media te verwijderen. Opmerking: Als alternatief voor manuele dechorionation, partijen embryo kan chemisch dechorionated met 1 mg / ml pronase behandeling, zoals eerder beschreven 11. </li></ol> 2. Chemische behandeling van embryo&#39;s <ol><li> De dag vóór de behandeling, voor te bereiden voorraad oplossingen van elke chemische stof in 1000-voudige concentratie in DMSO (of geschikt oplosmiddel). Bijvoorbeeld, embryo&#39;s blootgesteld aan 10 uM bisfenol A (BPA), bereid in 10 mM BPA voorraadoplossing in 100% DMSO. Dit garandeert een gelijkmatige DMSO-concentratie in elke behandeling en kan een niet-toxisch 1:1000 verdunning van DMSO om te dienen als vehikel controle. Fokvee oplossingen bij -20 ° C. Voor dit protocol, zal embryo&#39;s worden blootgesteld aan 1 uM en 10 uM BPA, 18,5 nM en 1,85 uM genisteïne, 367 nM estradiol (positieve controle) en het voertuig (0,1% DMSO, negatieve controle). WAARSCHUWING: Chemicaliën zoals BPA en estradiol gevaarlijk en kan schadelijke effecten op de menselijke foetus. Handvat endocriene verstoorders met zorg en gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.</li><li> Op de dag van de behandeling, dooi voorbereid voorraad chemische oplossingen. Verdun 1:1000 pipetteren 1 ml E3B + PTU in een 1,5 ml microcentrifugebuis en toevoegen van 1 pl voorraad chemische oplossing. Vortex krachtig. Verdunnen DMSO 1:1.000 in E3B + PTU als een voertuig controle. Gebruik 1 ml E3B + PTE in een 1,5 ml microcentrifuge buis als onbehandelde controle. </li><li> Met behulp van een grote diameter plastic overdracht pipet embryo&#39;s uit petrischaaltjes in elk putje van een 96-well plaat, 3 embryo&#39;s per well, 3 putten per conditie. Verdamping bij langdurige behandeling te voorkomen, weg te laten embryo vanuit de rijen en kolommen van de plaat (rij A en E, kolommen 1 en 12). Buitenste putjes worden gevuld met 300 ul E3B + PTU. Label de plaat deksel op de juiste wijze. </li><li> Verwijder het medium uit elk putje met een fijne getipt plastic overdracht pipet. Werk snel om te voorkomen uitdroging van de embryo&#39;s. </li><li> Voeg 200 ul van de behandeling oplossing in goed overeenkomt. Plaats het deksel underneath de plaat als een leidraad voor toevoeging van behandelingen zorgen in de juiste putten. Vortex elke buis voorafgaand aan het pipetteren om de stof in de oplossing te verdelen. Bevestig visueel elk embryo is in de behandeling oplossing. Als embryo&#39;s zijn aan de kant van de put, gebruik dan een schone overdracht pipet om ze te wassen in de put met de behandeling oplossing. </li><li> Plaats de plaat in de incubator bij 28.5 ° C. Embryo&#39;s worden geanalyseerd op fluorescentie bij 72 hpf. </li></ol> 3. Automatische beeldvorming van embryo&#39;s in 96-well platen <ol><li> Verdoven embryo door 10 gl 4 mg / ml tricaïne aan elk putje. OPMERKING: Verdoven embryo&#39;s voorafgaand aan de beeldvorming. Op 24-96 HPF, zebravis vertonen spontane beweging en een schrikreactie op de veranderende lichtbron tijdens de beeldopname. Verlamming van embryo&#39;s vermindert beweging tijdens de beeldvorming. </li><li> Plaats de plaat met 96 putjes in de gemotoriseerde fase en kalibreer het podium. Met behulp van Zeiss Zen Blauw 2011 software voor microscopie automatischop en controle, selecteer de optie steekproef vervoerder en selecteer multiwell 96. Selecteer kalibreren. Volg de stapsgewijze aanwijzingen om het podium te kalibreren. OPMERKING: vink de knop tegels na deze stap. Als de knop tegels is uitgeschakeld, kan kalibratie-instellingen verloren gaan en de 96-well plaat zal moeten worden gekalibreerd. </li><li> Met behulp van een 10x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en de belichting instellingen adequaat voor BF en GFP-kanalen, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen. Focus op een enkel embryo en programmeer de microscoop om 3 totale Z-profielen, een afbeelding 50 pm boven en een 50 urn onder de huidige focal plane verwerven. OPMERKING: Omdat verschillende weefsels bezetten verschillende brandpunten vliegtuigen, zal dit ervoor zorgen dat voor elk zebravis beelden worden vastgelegd met het hart en de lever in focus. </li><li> Stel de software parameters om een ​​betegelde beeld met behulp van GFP en BF channe verwervenls. Selecteer op het tabblad overname geavanceerde instellingen. Select tegel regio&#39;s, dan tegels. Kies de optie cirkel ook. OPMERKING: Tegels wordt gebruikt om een ​​samengesteld beeld van elke creëren ook. Een field-of-view betreffen slechts een klein gedeelte van elk putje. De tegels functie kan automatisch vastleggen meerdere aangrenzende velden-of-view uit elk putje, het creëren van een samengesteld beeld van het gehele goed. Het is derhalve mogelijk om automatisch vastleggen 96 samengestelde afbeeldingen per plaat, waarbij elke samengestelde beeld omvat tientallen afzonderlijke afbeeldingen in een enkel putje. </li><li> Selecteer vervoerder en vul factor 90%. Een vulfactor van 90% selecteren vastlegt meervoudige afbeeldingen van de geselecteerde putjes zodanig dat 90% van het oppervlak van elk putje wordt zichtbaar in het samengestelde beeld. OPMERKING: Bij het selecteren vulfactor wordt een diagram weergegeven die de ruimte af te beelden. Selecteer een percentage dat onder de oppervlakte van de putdat geschikt is voor het experiment. </li><li> Onder opties, selecteer de hoeveelheid overlapping gewenst. OPMERKING: Bij het aan elkaar plakken van tegels voor een enkel beeld vertegenwoordiger, een overlap van 5-10% zorgt voor een gladde naad tussen de beelden. Echter, als het stiksel is niet nodig, met behulp van een 0% overlap zal beeldvorming verkorten. Met behulp van 90% vulfactor en 5% overlap, een samengesteld beeld van een enkele put bestaat uit 59 afzonderlijke beelden. </li><li> Start beeldvorming. De microscoop zal automatisch beelden te verwerven. </li><li> Handmatig inspecteren samengestelde beelden van elk putje voor weefsel-specifieke fluorescentie (figuur 1). </li><li> OPMERKING: Het is het beste om te beginnen met de positieve controle om te bevestigen dat de blootstelling aan chemische stoffen werkten voorafgaand aan het observeren experimentele behandeling putten. </li></ol> 4. Handmatig Fotolader van embryo&#39;s in 96-well plaat OPMERKING: Om resultaten te bevestigen, gebruik dan een objectief 20x lange werkafstand te ackatern meer gedetailleerde beelden handmatig (figuur 2). <ol><li> Met behulp van een 20x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en stel belichtingsinstellingen voor BF en GFP-kanalen adequaat, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen. </li><li> Identificeer de individuele embryo&#39;s en foto&#39;s maken met de hand. OPMERKING: Nadat de belichtingsinstellingen zijn geselecteerd voor de positieve controle embryo, de instellingen niet wijzigen. Dit maakt een vergelijking van de fluorescentie-intensiteit als elke opname wordt gemaakt onder gelijke voorwaarden. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om het beeld automatisch weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s. Het protocol is ontwikkeld met behulp van een Zeiss Axio Observer. Z1 met Zen Blue 2011-software, maar de techniek kan worden aangepast met behulp van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium en microscoop controle software die tegels kunnen voeren maken van samengestelde afbeeldingen. Het uitrusten van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium kan een praktische...

Transgene zebravis ontwikkeld die het mogelijk maken de directe visualisatie van de activiteit in signaaltransductiewegen zoals fibroblast groeifactoren 1, retinoïnezuur 2 en 3 oestrogenen, in levende embryo. Dergelijke tools kunnen screenen op stoffen die signalerende wegen verstoren (getest als verandering in de fluorescentie-intensiteit) of voor chemische stoffen die moduleren signalering in een weefsel-specifieke wijze (verandering in de fluorescentie lokalisatie) 4. Geautomatiseerde beeldopname verhoogt de doorvoer van chemische schermen dramatisch 5,6. Schermen die automatisch assay fluorescentie in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur. Zogenaamde high content levert het voordeel van hoge resolutie kwantitatieve beeldvorming maar ten koste van het gebruik van gespecialiseerde plaatlezers ingericht voor confocale microscopie 7,8. Het doel van deze methode is automatisch assay weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryoin een 96-wells plaat met een standaard epifluorescentiemicroscoop. Weefsel-specifieke fluorescentie kan worden onderscheiden met behulp van deze techniek en kan een redelijke benadering voor laboratoria die de toegang tot gespecialiseerde plaat lezers of high content apparatuur ontbreekt zijn. In dit protocol gebruiken we geautomatiseerde beeldvorming om weefselspecifieke oestrogeenreceptor (ER) agonisten in levende zebravis detecteren 3 dagen na de bevruchting (dpf). De transgene lijn Tg (5xERE: GFP) c262/c262 bevat 5 tandem oestrogeen respons element DNA-sequenties (ERE) stroomopwaarts van groen fluorescerend eiwit (GFP) 3. Bij afwezigheid van ligand, ERs gewoonlijk inactief. Ligandbinding veroorzaakt een conformationele verandering waardoor receptoren ERE DNA te binden en transcriptie te reguleren 9. 5xERE: GFP vis kan worden gebruikt om chemische bibliotheken te screenen ER modulatoren en kan worden gebruikt om de milieu watermonsters oestrogene verontreinigingen screenen.

<table><tbody><tr><td>Kunststof overdrachtpipetten; groot diameter</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof overdrachtpipetten; fijne punt</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96-wells, rond, platte bodem platen</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 x 35 mm platen</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 x 60 mm platen</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>punt afmetingen 0,05 x 0,01 mm, voor het handmatig verwijderen van chorions van embryo's</td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>zie Zebrafish Book voor recept (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenyl 2-thioureum (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Bereid 20 mM stock (100x) en gebruik bij 200 &mu;M in E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protocol vereist een omgekeerd fluorescerend microscoop met een gemotoriseerde stage</td></tr><tr><td>20x lange werkafstand objectief</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>We gebruiken een objectief met 0,4 NA en 8,4 mm werkafstand</td></tr><tr><td>Axiocam HRm digitale camera</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 microscoop controle software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protocol vereist microscopie automatisering en controle software om het vastleggen van betegelde beelden met behulp van een gemotoriseerde stage mogelijk te maken</td></tr><tr><td>Methyleen Blauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 gram</td><td>maak 2% oplossing in RO water voor gebruik in E3B (hieronder)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 OPLOSSING: NaCl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; - 17,2 gram KCl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; - 0,76 gram CaCl2-2H2O&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; - 2,9 gram MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 gram of MgSO4 - 2,39 gram Oplossen in 1 liter Milli-Q water; bewaar in steriele 1 liter fles. 1X E3B OPLOSSING VOOR ZEBRAVIS: 60X E3&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 150 ml 2% methyleenblauw&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 100 &mu;l&nbsp; Breng tot 9 liter met Milli-Q water &nbsp;</td></tr></tbody></table>

semi-geautomatiseerde beeldvorming van tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebravis embryo&#39;s zijn een krachtig hulpmiddel voor grootschalige screening van kleine moleculen. Transgene zebravis dat fluorescente reporter eiwitten tot expressie worden vaak gebruikt om chemicaliën die genexpressie moduleren. Chemische schermen die fluorescentie assay in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur voor hoge gehalte screening. We beschrijven een procedure met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde podium om het beeld automatisch zebravis embryo&#39;s en detecteren weefsel-specifieke fluorescentie. Met behulp van transgene zebravis dat oestrogeen receptor-activiteit via expressie van GFP melden, we een semi-geautomatiseerde procedure ontwikkeld voor het screenen op oestrogeen receptor liganden die de verslaggever in een weefsel-specifieke wijze te activeren. In deze video beschrijven we procedures arraying zebravis embryo 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in een 96-well plaat en het toevoegen van kleine moleculen die oestrogeenreceptoren binden. Op 72-96 HPF, beelden van elk putje vande hele plaat worden automatisch verzameld en handmatig gecontroleerd op weefsel-specifieke fluorescentie. Dit protocol toont het vermogen aan oestrogenen die receptoren in hartkleppen inschakelen, lever detecteren.

Figuur 1 toont samengestelde beelden van afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Elk beeld composiet bestaat uit 59 afzonderlijke foto&#39;s met 5% afbeelding overlap. Merk op dat de levende zebravis willekeurig georiënteerd zijn in elk putje, maar we kunnen onderscheiden fluorescentie in het hart van de lever. Helderveld beelden zijn bruikbaar als verwijzingen naar de zebravis oriëntatie te beoordelen en te visualiseren morfologische afwijkingen (figuren 1A en 1C). Geautomatiseerd...

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Het algemene doel van deze procedure is om automatisch oestrogensensitieve cellen te detecteren in levende zebravissenlarven. Dit wordt bereikt door eerst vijf volwassen X-E-R-E-G-F-P vissen te kruisen om oestrogen-reporter zebravissenembryo's te genereren. Vervolgens worden de embryo's in individuele putjes van een 96-wells plaat geplaatst.Vervolgens worden oestrogenen toegevoegd aan de plaat met embryo's. Ten slotte wordt de plaat gescand op fluorescentie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde tafel. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de weefselspecifieke activiteit van oestrogenereceptoren aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek ten opzichte van andere traditionele technieken, zoals high-throughput- of high-content-screening, is dat weefselspecifieke fluorescentie in zebravislarven kan worden afgebeeld met enkel een standaard epifluorescentiemicroscoop. Wanneer deze is uitgerust met een gemotoriseerde tafel, is er geen gespecialiseerde platenlezer nodig. Waarschuwing: chemicaliën met BPA en estradiol zijn gevaarlijk en kunnen schadelijke effecten hebben op de menselijke foetus.Ga zorgvuldig om met hormoonverstorende stoffen en gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. In deze demonstratie worden zebravisjes blootgesteld aan de oestrogenen 17 bèta-estradiol, bisfenol A en genine in verschillende doses, beginnend 48 uur na bevruchting, nadat de zebravisjes zijn gepaard en de eieren zijn verzameld en gelijkgesteld. Volg de tekst op de dag van behandeling: verdun ontdooide voorraadchemische oplossingen 1 op 1000 in één milliliter E3 B plus PTU en vortex krachtig.Als voertuigcontrole. Gebruik een verdunning van 1 op 1000 van DMSO in E3 en PTU met behulp van een plastic overbrengpipet met een grote opening. Breng drie embryo's per putje over naar een 96-wellplaat, waarbij drie putjes per conditie worden voorbereid.Vermijd het plaatsen van embryo's in de buitenste wells om verdamping van het medium tijdens langdurige behandeling te voorkomen. Werk snel om uitdroging van de embryo's te vermijden, verwijder het medium uit elke well en voeg 200 µL goed gemengde behandelingsoplossing toe. Bevestig visueel dat alle embryo's ondergedompeld zijn in de oplossing en niet aan de wand van de well kleven.Incubeer de embryo's gedurende 72 uur bij 28,5 °C. Anestheseer de embryo's na de bevruchting door 10 µL trica van 4 mg/mL toe te voegen. Plaats de 96-wells plaat met de embryo's in elke well op een gemotoriseerde tafel en gebruik hiervoor de Zeiss Zen Blue 2011-software.Kalibreer de tafel door de optie voor de monsterdraaghouder te selecteren enmulti well 96 te kiezen. Selecteer vervolgens kalibreren en volg de stapsgewijze instructies; identificeer met behulp van een 10 x objectief en de bright field- of BF-instelling een positieve controle-embryo en stel de belichtingsinstellingen voor de BF- en GFP-kanalen zo in dat het fluorescentiesignaal de camera niet verzadigt. Focus op een enkel embryo en programmeer de microscoop om in totaal drie Z-secties vast te leggen, bestaande uit één beeld 50 micrometers boven en één beeld 50 micrometers onder het huidige brandvlak.Stel vervolgens de softwareparameters in om een tegelbeeld op te nemen met GFP- en BF-kanalen. Selecteer onder het tabblad acquisitie 'advanced setup', selecteer 'tile regions' en vervolgens 'tiles'. Kies voor de cirkel.Selecteer bij de optie 'Well' de dragers en een vulfactor van 90% om meerdere afbeeldingen van de geselecteerde wells vast te leggen, zodat 90% van het oppervlak van elke well zichtbaar zal zijn in het samengestelde beeld. Selecteer onder opties de gewenste overlap, zoals 5 tot 10%, wat zorgt voor een naadloze overgang tussen de afbeeldingen. Start vervolgens de beeldvorming om handmatig afbeeldingen vast te leggen met een 20 x objectief en de BF-instelling, en identificeer een embryo dat als positieve controle dient.Stel de BF- en GFP-instellingen opnieuw in zoals voorheen en neem beelden op. Deze figuur toont samengestelde beelden van afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Elk beeld is opgebouwd uit 59 individuele beelden met een beeldoverlap van 5%.Let op dat de levende zebravisjes willekeurig georiënteerd zijn in elke put. Desondanks zijn we in staat om fluorescentie in het hart te onderscheiden van fluorescentie in de lever. Brightfield-beelden zijn nuttig als referentie om de oriëntatie van de zebravisjes te beoordelen en morfologische afwijkingen te visualiseren.De hier getoonde beelden zijn vastgelegd met een 20 x objectief met een grote werkafstand voor een gedetailleerdere analyse, en zijn direct na de zojuist getoonde automatische scan genomen zonder de plaat van de microscoopplaat te verwijderen. Met behulp van een 20 x objectief kan de fluorescentie in het hart nauwkeurig worden gelokaliseerd tot de atrioventriculaire kleppen, aangewezen door de pijlen, en de aortakleppen, zoals aangegeven door de pijlpunten. Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen beelden van 3 96-well platen per dag worden vastgelegd.Vergeet niet dat het werken met hormoonverstorende stoffen gevaarlijk kan zijn, neem daarom altijd de juiste voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Source: Zhang, X., et al. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates fluorescence imaging of zebrafish embryos injected with Staphylococcus aureus, enabling quantification of infection progression and bacterial distribution to assess the impact of biomaterial microspheres on host-pathogen interactions in vivo.

 Fluorescence Imaging of Biomaterial-Associated Bacterial Infection in Zebrafish Embryos

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer een semi-geautomatiseerde beeldvormingsmethode voor weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's. Dit protocol detecteert oestrogeen-responsieve cellen met fluorescentiemicroscopie.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's

Meer video's verkennen