Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

Het algemene doel van deze procedure is om kwartelklier-chimeren te gebruiken als een middel om mechanismen te onderzoeken waardoor neurale korstcellen soortspecifieke patronen genereren tijdens de ontwikkeling van het schedelgezicht. Dit wordt bereikt door eerst een strook van de neurale vouw te dissecteren en verwijderen uit de middelste en voorste achterhersenregio van een kwartelembryo in stadium 9,5. De tweede stap omvat het overbrengen van de kwarteldonderneurale vouw naar het eendengastereembryo.

De derde stap omvat het dissecteren en verwijderen van de equivalente regio van een eendengastereembryo in stadium 9,5. De laatste stap is om de spiraalvormige neurale vouw in de eend te plaatsen, in de middelste en voorste achterhersenregio. Uiteindelijk kunnen de resulterende chimere embryo's neurale krestgemedieerde veranderingen in genexpressie aanwijzen door in C twee hybridisatie, en kunnen ook morfologische veranderingen onthullen door histologische analyses.

Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik bruine pelikanen zag vliegen boven Ocean Beach in San Francisco. Ik realiseerde me dat neurale krestcellen de bron moeten zijn van het soortspecifieke patroon, omdat ze aanleiding geven tot de botten en kraakbeen van hun lange snekkorfskelet. Hoewel ik geen bruine pelikaaneieren kon traceren, was ik in staat om witte Pekingeend te vinden.

Aangezien San Francisco de grootste Chinatown heeft buiten Azië Door de verschillen in de snelheid van rijping en morfologie tussen kwartels en eenden te benutten. Deze methode kan ons helpen antwoorden te geven op belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het begrijpen van de oorsprong van soortspecifiek patroon, Het uitvoeren van de operatie zal worden gedaan door Dr. Jennifer Fish, die een postdoctoraal onderzoeker is in mijn laboratorium, assisterend zal zijn Kate Ovitz, die een afgestudeerde student is Gebruik een buns en brander verwarm de smalle kant van een pastapipet tot het glas langs de tapsheid begint te smelten. Verwijder het uit de vlam en trek aan het uiteinde tot de pijp afgesloten is.

Zorg ervoor dat een deel van het tapse gedeelte een buitendiameter heeft tussen 0,7 en één millimeter. Breek vervolgens het afgesloten uiteinde ongeveer vier centimeter van de tapsheid af. Bevestig vervolgens ongeveer twee voet rubberen buis aan de open kant van de pijp en blaas aan de andere kant.

Er mag geen lucht door de verbinding of het andere uiteinde van de pijp gaan terwijl u zachte druk uitoefent door op de buis te blazen. Gebruik een propaanpen, vlambrander om een ovale ruimte aan één kant van de pijp net onder het begin van de tapsheid te verwarmen. Zodra het glas naar buiten begint te buigen, verwijdert u de pijp uit de vlam en blaast u voorzichtig door de rubberen buis.

Dit zal ervoor zorgen dat het verwarmde deel van het glas een worstvormige bel vormt. Te veel druk zal ervoor zorgen dat de glazen bel openbarst, en dit moet worden vermeden. Het resulterende venster in de pijp moet ongeveer een centimeter breed en anderhalve tot twee centimeter lang zijn.

Richt nu de tapse kant naar boven en schraap de bel in een glazen afvalcontainer terwijl u voorzichtig door de buis blaast om te voorkomen dat glasscherven in de pijp komen. Gebruik vervolgens de propaanvlam om voorzichtig de resterende randen van de bel af te branden en de zijden van het open venster te polijsten. Houd vervolgens de diamantpuntpen in een verticale positie, gebruik een diamantpuntpen om het tapse uiteinde van de pijp te scoren op één centimeter vanaf het begin van de tapsheid.

Gebruik pincetten om de pijp voorzichtig te breken op de gescoorde lijn. Om de punt te verwijderen, controleer onder een dissectiemicroscoop om er zeker van te zijn dat de breuk schoon en niet ruw is. Houd de pijp zoals men een potlood zou vasthouden met een wijsvinger over het open venster op ongeveer 9,5 millimeter van de punt.

Verzachten het glas op de pijp door het naast de rand van de vlam van een alcoholbrander te houden. Oefen druk uit op de punt met pincetten om het smalle uiteinde van de pijp onder een dissectiescoop met een hoek van 60 graden naar beneden te buigen. Snel en voorzichtig, polijst de punt met de alcoholbrander.

De voltooide opening moet afgerond en onbelemmerd zijn. Merk op dat de punt vernauwd en onbruikbaar zal worden als deze te lang in de vlam wordt gehouden. Smeer nu een 2,5 centimeter lang stuk rubberbuis met 70% ethanol.

Schuif het over de schacht van de pijp van onderop om het open venster te bedekken. Plaats vervolgens een latex bulb van twee milliliter op het open uiteinde van de pijp. Om de interne luchtdruk te behouden, bereidt u eerst het gastere ei voor.

Snijd de Vitale-membraan met een met vlam geslepen wolfraamnaald en trek de membraan over het embryo. Verzegeld het ei vervolgens opnieuw met tape zoals voor het donorei is gedaan. Verwijder de tape van het venster op het donorei om de neurale vouw van het donorembryo te snijden.

Maak sleuven aan beide zijden van de neurale buis met een met vlam geslepen wolfraamnaald. Snijd vervolgens over de neurale buis op de gewenste voorste en achterste niveaus van de graft en scheid de graft van de rest van de neurale buis. Let op eventuele specifieke anatomische details zoals de voorste versus achterste vorm van de graft, waardoor het donorweefsel op de juiste manier zal worden georiënteerd.

Zorg er bij het plaatsen in de gastheer voor dat de wolfraamnaald extreem scherp is. Gebruik snelle en bewuste slagen om het weefsel volledig en in één stuk te verwijderen, Verwijder de neurale vouw van het donorembryo met behulp van een sjamaanpijp. Trek zo weinig vloeistof mogelijk op, anders zou het weefsel tijdens het overbrengen kunnen zweven.

Verwijder nu de tape van het venster op het gastere ei en gebruik de sjamaanpijp om de donorneurale vouw naast het gasterebryo te plaatsen naast de regio van de neurale buis die de transplantatie zal ontvangen. Scheid nu de neurale vouw van de neurale buis