Name: Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer hoe kwartel-eend chimeras soortspecifieke bijdragen van neurale kamcellen aan craniofaciale ontwikkeling onderzoeken. Deze methode onthult mechanismen van skeletpatronering en evolutionaire biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een National Institute of Dental en Craniofacial Onderzoek (NIDCR) F32-subsidie ​​(DE021929) naar JLF en een NIDCR R01 subsidie ​​DE016402 RAS

1. Bereid Tungsten Naalden <ol><li> Snijd een wolfraamstaaf in de helft gebruik draadsnijders zodat de stang niet buigt. </li><li> Rijg de stang door de taps toelopende einde van een 5 3/4 in borosilicaatglas Pasteur pipet. </li><li> Laat ongeveer 3/4 van de staaf steken van het glas, hechten de stang om de pipet tip met een kleine kraal van &quot;smeltlijm&quot; (HMA), dat is de lijm stok gebruikt voor een lijmpistool. De HMA moet snel worden gesmolten in een alcohol vlam, let op dat de lijm niet te branden en het genereren van zwarte rook. </li><li> Met een pincet, buig de punt van de wolfraamstaaf (ongeveer 1/4 vanaf de bovenkant) tot 45 ° wordt bereikt. </li><li> Houd de Pasteur pipet, plaats ongeveer 1/8 in de punt van de wolfraam staafje in de vlam van een propaantoorts. Houd de tip stabiel en precies loodrecht op de vlam. </li><li> Trek de naald uit de vlam het moment dat een klein oranje stipje wolfraatien vliegen af ​​van de naald. </li></ol> 2. Bereid Spemann pipetten <ol><li> Tot het glas iets voorbij de conische smelt behulp van een Bunsen brander verhit het dunne uiteinde van een Pasteur pipet. Verwijderen uit vlam en trek de punt totdat de pipet wordt verzegeld. Wees er zeker van dat er nog een deel van de taps toelopende deel dat een OD van ongeveer 0,7-1,0 mm heeft. Breek de verzegelde einde uit ongeveer 4 cm van de conus. </li><li> Bevestig ongeveer 2 voet (60 cm) rubber slang aan de brede (open) uiteinde van de pipet. Blaas het andere uiteinde van de rubber slang zodat er geen lucht door het tapse gedeelte van het Pasteur pipet. </li><li> Met behulp van een propaan brandstof cilinder met een aangrenzende pen vlamtoorts Verhit een ovaal gebied aan een zijde van de pipet net onder het begin van de conus. Blaas zachtjes en voortdurend door de rubber buis met een kleine hoeveelheid druk (ongeveer hoeveelheid druk nodig is om het begin van de lette zeggenr &quot;P&quot; op conversatie niveau). Wanneer het glas wordt zacht enerzijds en begint naar buiten knikken, snel van de vlam verwijder de pipet en blaas hard en stabiel door de rubber slang. Hierdoor wordt het verwarmde uiteinde van de glazen een worst-vormige bel die pop, wat fijn vormen. Als de luchtbel te klein is, probeer smelten en opnieuw blazen het glas. De laatste open raam in het glas moet rond 0.25 in (6,35 mm) breed en 0.5 inch (12,7 mm) lang. </li><li> Wijzend het taps toelopende einde omhoog, schraap de bel in een glazen afvalcontainer terwijl waait zachtjes door de slang om te voorkomen dat glasscherven in het invoeren van de pipet. </li><li> Met behulp van de propaan vlam, branden de resterende randen van de zeepbel en de brand-Pools de zijkanten van het open raam. Zorg de as van de pipet niet smelten. </li><li> Met behulp van een diamant punt potlood, scoren het taps toelopende einde van de pipet ongeveer 1.25 in (30 mm) uit het raam en afbreken van de tipmet een pincet zodat de pipet opening wordt netjes afgesneden (discard pipetten met gebroken of oneffen tips). </li><li> Gebruik tang en de rand van een vlam uit een alcohol brander, buig het smalle gedeelte van de pipet 0,375 cm (9,5 mm) van het uiteinde een hoek van ongeveer 60 ° zodat het gebogen gedeelte in een verticaal vlak wanneer de vensteropening is bij de 1:00 positie voor rechtshandig gebruik en 11:00 voor linkshandig gebruik. Deze stap wordt het best uitgevoerd in een tochtvrije behuizing. </li><li> Brand-polish de punt met behulp van de alcohol vlam onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat u niet te dicht langs de punt, maar houden de openingsronde en glad zonder vernauwing. </li><li> Snij een 1 in (25 mm) stuk rubber slang, spuit het stuk slang met 70% ethanol, en schuif de slang over de as van de pipet tot de raamopening geheel bedekt is. Dit functioneert als het &quot;membraan&quot; van de Spemann pipet. </li><li> Plaats een latex rubber 2 ml bulbboven de open bodem van de pipet. De lamp handhaaft negatieve druk in de Spemann pipet. </li><li> Oefenen met een Spemann pipet chromatografie kralen van ongeveer 100-200 micrometer in diameter van een gemarkeerde plaats in een petrischaal op een gemarkeerde plaats in een andere onder een microscoop. </li><li> Om de Spemann pipet schoon, verwijder de rubberen bol en plaats pipet tip naar beneden, in een hoog bekerglas gevoerd met katoen of gaas op de bodem en gevuld met gedestilleerd water en glaswerk detergent. </li></ol> 3. Steriliseren en Incubate Eieren <ol><li> Veeg eieren met 70% ethanol en leg de eieren op plastic eiertrays. </li><li> Stel eieren in een verwarmde incubator bij 37,5 ° C en 85-87%. </li><li> Uitbroeden eieren totdat ze HH9.5, ongeveer 26 uur voor kwartels en 48 uur voor de eend te bereiken. </li></ol> 4. Window Eggs <ol><li> Verwijderen van een klein stukje van de buitenste schil van de bovenkant van het ei met een pincet, het verzorgen van de binnenste schil m niet te doorborenembrane. </li><li> Met behulp van een spuit met een 18 G met 1-inch naald, prik een gat op het smalste punt van het ei en ongeveer 1-2 ml albumine in te trekken. </li><li> Plaats transparante tape over het gat en punctie merk in de schelp. </li><li> Snij een &quot;venster&quot; langs het bovenoppervlak van het ei (via de transparante tape) met gebogen schaar. </li></ol> 5. Visualiseer Embryo&#39;s en voorbereiden voor Heelkunde <ol><li> Met behulp van een glasstaaf voorzichtig borstelen een kleine hoeveelheid neutraal rood (0,02 g / ml in Hank&#39;s BSS) via embryo. </li><li> Snijd de vitelline membraan en trek hem over de embryo met behulp van een vlam geslepen wolfraam naald. </li><li> Opnieuw verzegelen het ei door het plaatsen van transparante tape over het raam. </li></ol> 6. Scheid de donorweefsel van de Donor Embryo <ol><li> Verwijder tape van het venster op het ei van de donor embryo. </li><li> Om de neurale plooi gesneden uit de aangrenzende ectoderm van de donor embryo, maken sleuven aan beide sides van de neurale buis, met behulp van een vlam geslepen wolfraam naald (vervaardigd zoals boven beschreven). </li><li> Vervolgens dwars door de neurale buis op de gewenste voorste en achterste lagen van de graft en scheiden het transplantaat van de rest van de neurale buis. </li><li> Verwijder de neurale plooi van de donor embryo behulp van een Spemann pipet of ander type micropipet. </li><li> Verwijder dan de tape van het venster op de host ei en gebruik Spemann pipet om de donor neurale vouw langs de ontvangende embryo grenst aan de regio van de neurale buis die de transplantatie ontvangen. </li></ol> 7. Scheid de Host Tissue en Transplant het donorweefsel <ol><li> Scheid de neurale plooi van de neurale buis van de gastheer embryo, zoals gedaan met de donor. Zorg ervoor dat een ent van gelijke grootte te verwijderen als het donorweefsel. </li><li> Duw zachtjes deze host weefsel ver weg van het embryo. </li><li> Dan, met een stompe wolfraam naald of de afgeronde top van een micropipette, beweeg de donor neurale vouwen in de gastheer neurale buis, handhaven van de juiste antero-posterior en dorso-ventrale oriëntaties. Zorg ervoor dat het transplantaat is verscholen in langs de zijkanten, maar zeker niet te porren of schade aan de onderliggende weefsels. Om u te helpen bijhouden van de oorspronkelijke oriëntatie noot eventuele asymmetrie in het donorweefsel of differentiële kleuring van de Neutrale Red. We hebben ook foto-document de donor embryo met het bijbehorende uitgesneden weefsel, evenals de chimere onmiddellijk na chirurgie. </li><li> Steriele zoutoplossing worden toegevoegd aan het ei als de ontvangende embryo tekenen van uitdroging. </li><li> Nu voorzichtig terug afdichting en label het ei, en voorzichtig terug te sturen naar een hoge luchtvochtigheid incubator (70-80%), waar het chimere embryo kan ontwikkelen om de gewenste fase voor analyse. </li></ol> 8. Collectie van Chimeras <ol><li> Zorg ervoor dat chimere embryo&#39;s in vers gemaakte koude Serra&#39;s fixatief verzamelen en plaatsen ze direct op een rocker bij 4 ° C gedurende een O / N fixatie. Dit zal zorgen voor meer gevoelige detectie van kwartel cellen met de anti-kwartel antilichaam. </li><li> Voor genexpressie-analyses via RT-qPCR, bevriezen embryo&#39;s rechtstreeks in vloeibare stikstof voorafgaand aan RNA-extractie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De neurale een voorbijgaande embryonale celpopulatie die uitgebreid migreert hele embryo en differentieert in diverse celtypen, waaronder chondrocyten en osteoblasten, die bijdragen aan het craniofaciale skelet. Het transplanteren van de neurale lijst in de kwartel-eend chimere systeem heeft veel bijgedragen aan ons begrip van het weefsel interacties en signaalwegen in de ontwikkeling van het craniofaciale skelet reguleren. Echter, gezien de enorme mogelijkheden van neurale lijst te genereren ook gladde spiercellen, adipocyten, melanocyten, Schwann-cellen en neuronen, de kwartel-eend chimera systeem heeft een enorm potentieel voor toekomstige toepassingen, met name in combinatie met de snelle vooruitgang van de biologie van de stamcel en regeneratieve geneeskunde. Sinds kwartel en eend zijn zowel commercieel gekweekt soorten, een klaar levering van relatief goedkope bevruchte eieren is beschikbaar uit een verscheidenheid van bedrijven. Daarom moet deze techniek toegankelijk zijn researchare die binnen een breed scala van budgetten en facilitaire ruimte. Hoewel deze techniek zeer krachtig, blijven er verscheidene beperkingen. Net als andere chirurgische technieken, de kwaliteit en de houdbaarheid van kwartel eend chimeren vertrouwen op de chirurgische vaardigheden van de onderzoeker, en daarom zal er meer inter-en intra-individuele variatie tussen experimenten in vergelijking met andere modellen, zoals gebruik muis te genetica. Bovendien is er ook variatie in het ontwikkelingstempo en stadia van individuele embryo dat tot de reproduceerbaarheid en het succes van elk transplantaat. Vogelembryo&#39;s zijn ook zeer gevoelig voor uitdroging en dus kritische stappen tijdens chirurgie inhouden dat de lage lichtniveaus, de tijd onder de microscoop minste de gesloten met plakband zoveel mogelijk eieren en hoge vochtigheid in de postoperatieve incubator voorkomen uitdroging. In termen van de levensvatbaarheid van de hersenschimmen, usually tussen 50-75% overleven, hoewel deze percentages de oudere kan verminderen de collectie podium. In een typische 4-6 uur zitting van de operatie, kan een ervaren chirurg 10-15 hersenschimmen genereren. Het succes van de transplantatie hangt ook sterk af van de kwaliteit van het gereedschap. Goed gereedschap leiden tot een meer consistente, reproduceerbare resultaten. Met behulp van een propaantoorts om wolfraam naalden maken laat zeer scherpe naalden worden gemaakt. Het type toorts maakt een groot verschil omdat het bepaalt de grootte van de vlam. Elektrolytisch slijpen kan ook worden gebruikt, maar deze aanpak niet eens in de buurt aan het produceren van naalden zo scherp. Gebruik wolfraam staven in plaats van wachtrij draad zodat de naalden direct kan worden gemaakt. De Spemann micropipet, terwijl tijdrovend en moeilijk te maken, is een ideaal instrument voor weefsel-overdracht. De pipet kan worden aangepast met verschillende grootte openingen, en kan meerdere malen worden gebruikt. Een kritische factor voor usinga Spemann micropipet is om wat vloeistof in de pipet voordat u met de punt naar het oppervlak van het embryo. Een deel van de vloeistof zal altijd vloeien wanneer contact wordt gemaakt met de meniscus over de embryo. Drukken op het membraan laat vloeistof en graft weefsel heel precies worden uitgeworpen, terwijl iets te laten op het membraan voorzichtig zuigt de donor transplantaat weefsel in de pipet. Handhaving wat positieve druk op het membraan blijft de donor transplantaat weefsel aan het uiteinde van pipet tijdens de overdracht, en een beetje extra druk op het membraan kan de donor transplantaat weefsel opzettelijk geplaatst in dezelfde gastheer. Ter bescherming van de Spemann pipet tijdens opslag en sterilisatie, verwijder de lamp uit het brede uiteinde en plaats voorzichtig de taps toelopende tip in de lamp. Plaats de Spemann pipet in een glazen reageerbuis, bedek de bovenkant met aluminiumfolie, en autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Na meerdere pipetten zijn ready opnieuw worden gesteriliseerd voor een operatie, keren de pipetten, verwarm ze bijna aan de kook in een zelfde oplossing van gedestilleerd water en glaswerk wasmiddel, en vervolgens herhaaldelijk spoelen met gedistilleerd water. Autoclaaf pipetten in hun individuele buizen. De rubberen slangen die het middenrif en de rubberen peertje vormt moet worden vervangen na een aantal sterilisaties of wanneer ze verduisterd en stijf. Veel van de onderdelen van dit protocol te betrekken gevaarlijke apparatuur. Bijvoorbeeld, de procedure om een ​​Spemann Micropipet omvat drie soorten vlammen en verwarming, trekken, blazen, buigen, snijden en polijsten glas. Daarom is het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), dat de veiligheid verhoogt, zoals een veiligheidsbril en een laboratoriumjas is van cruciaal belang. Bovendien, omdat veel mensen last van, of hebben het potentieel om te ontwikkelen, ei allergie, altijd handschoenen bij het hanteren van eieren. Met deze voorzorgsmaatregelen in het achterhoofd, de kwartel-eend chimere systeem isa veilig, efficiënt en relatief toegankelijke methode die veel toekomstige toepassingen heeft.

Het gezicht skelet ontwikkelt zich uit de groei en fusie van meerdere gezicht processen die zijn samengesteld uit de neurale lijst en mesodermal mesenchym omgeven door ectodermale en endodermale epitheellagen 1-11. Morfogenetische gebeurtenissen binnen elk proces worden beheerst door duidelijke signalering interacties tussen de mesenchym en de omliggende epitheel 12-16. Wijzigingen in deze signalering interacties en / of de stroomafwaartse effectoren bijdragen aan de ziekte fenotypes en kan ook de ontwikkeling van craniofaciale skelet 17, 18 relevant zijn. Daarom is het ophelderen van de timing en de aard van het weefsel interacties heeft een groot potentieel om ons begrip van de ontwikkelings-en evolutionaire biologie van het gezicht skelet verhogen. Het gebruik van chimere embryo&#39;s om weefsel interacties te onderzoeken heeft een lange geschiedenis in de ontwikkelingsbiologie. Deze aanpak is ontwikkeld door Hans Spemann en zijn labdie embryonale &quot;organisatoren&quot; ontdekt door het transplanteren van weefsels tussen de embryo&#39;s van verschillende soorten amfibieën. Spemann was een meester van micro-chirurgische technieken wiens hand-vaardigheden werden aangevuld door zijn ontwikkeling van gespecialiseerde tools, met name de Spemann pipet. Viktor Hamburger was een afgestudeerde student in het laboratorium van Hans Spemann in Freiburg tijdens de jaren 1920, dat is wanneer de oorspronkelijke transplantatie experimenten die leidden tot Spemann de Nobelprijs werden uitgevoerd. Bij Hamburger verhuisde naar Washington University in St. Louis in 1935, gedetailleerd hij het ​​proces van het maken van een Spemann micropipet in zijn Manual of Experimental Embryologie 19. Drew Noden was een afgestudeerde student in het lab Hamburger bij de Universiteit van Washington tot 1972. Na de verhuizing naar de Universiteit van Massachusetts, Amherst en daarna naar Cornell University, Noden voortgezet fabriceren en gebruiken Spemann micropipetten voor zijn chirurgische transplantaties met kwartel-chick hersenschimmen. &amp;# 160;. Terwijl een afgestudeerde student, een van de auteurs (Rich Schneider) getraind met Drew Noden aan de Cornell 1995-1998 Het volgende protocol voor het maken van een Spemann micropipet is gebaseerd op beschrijvingen geschreven door Hamburger en Noden, en omvat de volgende wijzigingen door Schneider. Het gebruik van kwartel-chick chimeren voor de studie van craniofaciale ontwikkeling en vooral voor het begrip van de bijdrage van neurale cellen is ontwikkeld door Noden en Le Douarin in de vroege jaren 1970, beoordeeld Le Douarin et al. 20. Deze benadering is algemeen in veel studies en talrijke andere onderzoekers 1, 4, 5, 21-38 aangenomen. Het equivalent groeicijfers en de morfologie van kwartel en kuiken maken transplantaties binnen ze ideaal voor de studie van cel lot en lineage tracing. Echter, vanwege de overeenkomsten tussen kwartel en kuiken, morfologische veranderingen indhanteerden door donorcellen zijn moeilijk te ontcijferen. In tegenstelling, hebben andere aviaire chimere systemen binnenlandse eend opgenomen als een manier om de mechanismen die embryo anatomisch duidelijke 39-50 te bestuderen. Meer specifiek, de kwartel-eend chimere systeem biedt meerdere voordelen voor het onderscheiden van de effecten van de donor op de host, en vice versa. Eerste, kwartel en eend embryo&#39;s zijn te onderscheiden in het lichaam van grootte en vorm, die een directe manier om donor-of host-specifieke mechanismen van patroonvorming verkennen door te testen op differentiële domeinen van genexpressie (figuren 1 A en B) biedt. Tweede, kwartel en eend embryo&#39;s hebben aanzienlijk verschillende tarieven van rijping, met kwartel eitjes in 17 dagen en eend uitkomen in 28 dagen. Getransplanteerde neurale handhaaft haar intrinsieke rijping tarief binnen de nieuwe omgeving, en dus de identificatie van temporele veranderingen in genexpressie, weefsel interacties, histogenese en morfogenese is mogelijk51-57. Tenslotte, de anti-nucleaire antilichamen kwartel (Q ¢ PN) maakt donor en gastheer cellulaire bijdragen permanent onderscheiden van elkaar door het herkennen van een eiwit dat alomtegenwoordig tot expressie wordt gebracht in kwartel cellen maar afwezig eend cellen.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s BSS zonder fenol rood</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &micro;m filter-gesteriliseerd</td></tr><tr><td>18 G Naalden</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 ml spuit</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Rechte schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann Pipet</td><td></td><td></td><td>Handgemaakt in het lab</td></tr><tr><td>Ei-houder</td><td></td><td></td><td>Glaze asbak en modelklei</td></tr><tr><td>Alcoholbrander</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Transparant plakband</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Glas roerstaaf</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>De punt is vernauwd en afgerond met behulp van een vlam</td></tr><tr><td>Wolfraamdraad (0,004 x 3 inch)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>De punt is vlammachtig in een propaanbrander</td></tr><tr><td>Bunsenbrander</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9-inch (229 mm)</td></tr><tr><td>Rubberen slangen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>amber, dunne wand natuurlijke rubber; wanddikte: 0,0625 in/1,6 mm; O.D.: 0,375 in/9,5 mm; I.D.: 0,25 in/6,4 mm</td></tr><tr><td>Propaan gasfles</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 met torch stijl "A" met een schroefbare messing "potloodvlam" brander</td></tr><tr><td>Diamantpunt potlood</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Rubberen kolven</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

het beoordelen soortspecifieke bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van quail-eend chimeras

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

De generatie van chimere embryo&#39;s is een wijdverspreide en krachtige aanpak van celtypes, weefsel interacties en soortspecifieke bijdragen aan de histologische en morfologische ontwikkeling van gewervelde embryo&#39;s te bestuderen. Met name het gebruik van chimere embryo het belang van neurale vastgesteld richten van de species-specifieke morfologie van het craniofaciale complex. De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van twee vogelsoorten, eend en kwartel, met opmerkelijk verschillend craniofaciale morfologie. Deze methode aanzienlijk vergemakkelijkt het onderzoek van de moleculaire en cellulaire regulatie van soortspecifieke patroon in het craniofaciale complex. Experimenten in kwartel en eend chimere embryo&#39;s hebben al onthuld neurale-kuif gemedieerde weefsel interacties en cel-autonome gedrag dat soort-specifiek patroon in het craniofaciale skelet, spieren, en integument reguleren. De grote diversiteit van neurale derivaten suggereert aanzienlijk potentieelvoor toekomstige toepassingen van de kwartel eend chimere systeem begrijpen gewervelde ontwikkeling, ziekte en evolutie.

Voorafgaand aan verdere analyse, de efficiëntie van het transplantaat moet worden getest. Voor histologische, morfologische, of genexpressie analyses van weefselmonsters, moet kwartel cellen worden gedetecteerd door immunohistochemie met behulp van Q ¢ PN antilichaam zoals beschreven 36. Voor RNA-analyses, kunnen soortspecifieke bijdragen aan weefsels van belang worden berekend met behulp van een PCR-gebaseerde strategie 58. Na de werkzaamheid van het transplantaat is gevalideerd kunnen verdere morfologische en moleculaire meetinstrumenten worden beoordeeld chimeren. Interacties tussen de donor neurale lijst cellen en omliggende gastheer afkomstig weefsel dat een goede histogenese en morfogenese van het craniofaciale complex ten grondslag liggen zijn eerder uitvoerig bestudeerd. In het bijzonder neurale mesenchym regisseert soortspecifieke morfologie van het gezicht 7, 13, 51, 59, veer patroon 52, spier-patroon 56 </s<html> inschrijven&gt;, en kraakbeen 53, 57 door de regulering van gastheer genexpressie. Bijvoorbeeld, neurale mesenchym dicteert wanneer bot vormen in de onderkaak door tijdelijk reguleren Bmp4 expressie 55. Onlangs heeft het onderzoek gericht op weefsel interacties voorkwamen heel vroeg in craniofaciale ontwikkeling. In dit verband, experimenten met behulp van kwartel-eend hersenschimmen hebben aangetoond gastheer embryo beïnvloeden neurale migratie door het bepalen van morfologische grenzen. Dat wil zeggen, in chimere quck embryo, donor kwartel neurale lijst cellen migreren naar de gastheer eend onderkaak boog in een eend-achtig patroon (figuur 1D). Ondanks deze bijdrage gastheer voor de omvang van de neurale populatie, de donor neurale blijft onderkaak skelet dat kwartel-achtige vorm en grootte (figuur 1E) genereren. e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Quail-Eend Chimeric System. (A) kwartel en (B) eend schedels tonen aanzienlijke verschillen in grootte en vorm, en derhalve zijn ideaal voor het gebruik van een chimeer systeem craniofaciale ontwikkeling bestuderen (gewijzigd van Tokia et al.. 56). (C) Proefopzet opwekken eenzijdige chimere quck embryo&#39;s van stadium afgestemd HH9.5 kwartel en eend embryo&#39;s. De neurale plooi wordt verwijderd van een kant van kwartels embryo en getransplanteerd in eenden embryo na een equivalent stuk van de neurale plooi is verwijderd. (D) Quail donorcellen (groen) kan worden gevolgd chimeren met een anti-kwartel antilichaam (Q ¢ PN), zoals in ventrale oog op UU12 chimere embryo. (V) In quck kaken op HH38, de kwartel donor-afgeleide Meckel7, s kraakbeen korter en rechter dan die waargenomen voor de contralaterale eend gastheer afkomstig Meckel kraakbeen, die groter en gebogen. Herdrukt Tokita et al.., Dev. Bio. 306, 377 (2007) met toestemming van Elsevier.

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor chimeer embryo&#39;s die zijn ontworpen om de soortspecifieke bijdragen van neurale en / of andere weefsels craniofaciale ontwikkeling testen genereren.

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Het algemene doel van deze procedure is om kwartel-duct-chimeren te gebruiken als middel om de mechanismen te onderzoeken waarmee neurale kamcellen soortspecifieke patronen genereren tijdens de craniofaciale ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst een strook van de neurale plooi uit de midden- en anterieure regio van het ruitbrein van een kwartelembryo in stadium 9,5 te dissekeren en te verwijderen. De tweede stap omvat het overplaatsen van de neurale plooi van de kwarteldonor naar het eenden-gastembryo.De derde stap omvat het dissecteren en verwijderen van de overeenkomstige regio van een eenden gastheemembryo in stadium 9.5. De laatste stap is het plaatsen van de neurale plooi van de coil in de mid- en anterieure regionen van het achterbrein van de eend. Uiteindelijk kunnen de resulterende chimeerembryo's, via in situ hybridisatie, neurale kam-gemedieerde veranderingen in genexpressie pinpointen en kunnen ze ook morfologische veranderingen onthullen via histologische analyses.Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik bruine pelikanen over Ocean Beach in San Francisco zag vliegen. Ik realiseerde me dat neurale kamcellen de bron moeten zijn van het soortspecifieke patroon, aangezien zij de basis vormen voor de beenderen en het kraakbeen van hun lange snavelskelet. Hoewel het me niet lukte om eieren van de bruine pelikaan te bemachtigen, kon ik wel witte Peking-eenden vinden.Aangezien San Francisco de grootste Chinatown buiten Azië heeft. Door gebruik te maken van de verschillen in rijpsnelheid en morfologie tussen kwartels en eenden. Deze methode kan ons helpen belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals het begrijpen van de oorsprong van soortspecifieke patronen. De chirurgische ingreep wordt uitgevoerd door Dr. Jennifer Fish, een postdoctoral onderzoeker in mijn laboratorium; zij wordt bijgestaan door Kate Ovitz, een promovendus. Verhit met een Bunsenbrander het smalle uiteinde van een Pasteurpipet totdat het glas langs de taps toelopende zijde begint te smelten. Haal de pipet uit de vlam en trek de tip uit elkaar tot de pipet is afgesloten.Zorg ervoor dat een gedeelte van het taps toelopende deel een buitendiameter heeft tussen 0,7 en één millimeter. Breek vervolgens het afgesloten uiteinde af op ongeveer vier centimeter van de taps toelopende zijde. Bevestig daarna ongeveer zestig centimeter rubberen slang aan het open uiteinde van de pipet en blaast u aan het andere uiteinde.Er mag geen lucht ontsnappen via de aansluiting of het andere uiteinde van de pipet terwijl er voorzichtig druk wordt uitgeoefend door in de slang te blazen. Gebruik een propanepencil of een vlambrander om een ovaal gebied aan één zijde van de pipet te verhitten, net onder het begin van de taps toelopende sectie. Zodra het glas naar buiten begint te buigen, haalt u de pipet uit de vlam en blaast u voorzichtig door de rubberen slang.Hierdoor zal het verhitte deel van het glas een worstvormige bel vormen. Te veel druk zal ervoor zorgen dat de glasbel knapt, wat voorkomen moet worden. Het resulterende venster in de pipet moet ongeveer één centimeter breed en anderhalf tot twee centimeter lang zijn.Richt het taps toelopende uiteinde nu naar boven en schraap de bel in een glazen afvalcontainer, terwijl u voorzichtig door de buis blaast om te voorkomen dat glasfragmenten in de pipet terechtkomen. Brand vervolgens met de propaanvlam voorzichtig de resterende randen van de bel weg en vuurpolijst de zijden van de open opening. Houd daarna het diamantstiftpotlood in een verticale positie en gebruik het diamantstiftpotlood om het taps toelopende uiteinde van de pipet één centimeter vanaf het begin van de taps toelopende sectie te inkerven.Breek de pipet voorzichtig bij de inkeping met een pincet. Controleer onder een dissectiemicroscoop of de breuk schoon is en geen rafelige randen vertoont om de tip te verwijderen. Houd de pipet vast zoals men een potlood vasthoudt, met de wijsvinger boven de opening op ongeveer 9,5 millimeters vanaf de tip.Verweek het glas van de pipette door deze naast de rand van de vlam van een alcoholbrander te houden. Oefen met een pincet druk uit op de punt om het smalle uiteinde van de pipette onder een dissectiescoop in een hoek van 60 graden naar beneden te buigen. Polijst de punt vervolgens snel en zorgvuldig met de alcoholbrander.De voltooide opening moet afgerond en onbelemmerd zijn. Houd er rekening mee dat de punt zal versmallen en onbruikbaar wordt als deze te lang in de vlam wordt gehouden. Smeer nu een rubberen slangetje van 2,5 centimeter lengte in met 70% ethanol.Schuif het over de schacht van de pipette van onderaf omhoog om het open venster te bedekken. Plaats vervolgens een latex ballonnetje van twee milliliter op het open uiteinde van de pipette. Om de interne luchtdruk te handhaven, wordt eerst het gastenei voorbereid.Snijd het Vitale-membraan door met een vlamgeslepen wolfraamnaald en trek het membraan over het embryo. Sluit het ei vervolgens opnieuw af met tape, zoals gedaan is bij het donorei. Verwijder de tape van het venster van het donorei om de neurale plooi uit het donorembryo te snijden.Maak inkepingen aan beide zijden van de neurale buis met een vlamgeslepen wolfraamnaald. Snijd vervolgens door de neurale buis op de gewenste anterieure en posterieure niveaus van het transplantaat en scheid het transplantaat voorzichtig van de rest van de neurale buis. Let hierbij op specifieke anatomische details, zoals de anterieure versus posterieure vorm van het transplantaat, om het donorteweefsel correct te kunnen oriënteren.Zorg ervoor dat de wolfraamnaald extreem scherp is wanneer deze in de gastheer wordt geplaatst. Gebruik snelle en doelgerichte bewegingen om het weefsel volledig en in één stuk te verwijderen. Verwijder de neurale plooi uit het donorembryo met een shaman-pipet. Zuig zo min mogelijk vloeistof op, anders kan het weefsel tijdens de overdracht wegvloeien.Verwijder nu de tape van het venster op het gasterei en gebruik de shaman-pipet om de neurale plooi van de donor naast het gastembryo te plaatsen, grenzend aan het gebied van de neurale buis dat het transplantaat zal ontvangen. Scheid nu de neurale plooi van de neurale buis van het gastembryo, zoals eerder bij de donor is gedaan. Zorg ervoor dat er een graft van gelijke grootte als het donorweefsel wordt verwijderd.Duw dit gastweefsel voorzichtig ver weg van het embryo. Verplaats vervolgens met een stompe wolfraamnaald of de afgeronde punt van een micropipet de neurale plooi van de donor voorzichtig in de neurale buis van de gastheer, waarbij de juiste anteroposterieure en dorsoventrale oriëntaties worden behouden. Zorg ervoor dat het transplantaat langs de zijkanten is ingeschoven, maar let erop dat u het onderliggende weefsel niet doorprikt of beschadigt.Steriele zoutoplossing moet voorzichtig en zachtjes over het gastembryo worden aangebracht. Indien er tekenen van uitdroging zijn, moet het ei nu zorgvuldig opnieuw worden afgesloten en gelabeld, waarna het voorzichtig kan worden teruggeplaatst in een incubator met een hoge luchtvochtigheid, waar het chimeer embryo kan uitgroeien tot het gewenste stadium voor analyse.Verzamel voor analyse de chimerische embryo's in vers bereid koud Sarah's fixatief. Plaats ze vervolgens onmiddellijk op een rocker bij vier graden Celsius voor een fixatie gedurende de nacht. Dit maakt een gevoeligere detectie van kwartelseieren mogelijk met het anti-kwartseantilichaam.Een andere belangrijke stap voor genexpressie-analyses via real-time kwantitatieve PCR is het invriezen van de embryo's in vloeibare stikstof voorafgaand aan de RNA-extractie. Palingen en eenden vertonen aanzienlijke verschillen in grootte en vorm, waardoor hun embryo's bij uitstek geschikt zijn voor het creëren van een chimeer systeem om de craniofaciale ontwikkeling van C te bestuderen.Specifiek is het systeem nuttig voor het onderzoeken van de rol van neurale kamcellen. Bij de patroonvorming van het gelaatsskelet in het chimerische eend-koudschotel-embryo migreren neurale kamcellen van de donor-koudschotel naar de mandibulaire boog van de gastheer-eend. In een eend-achtig patroon worden de donorcellen van de koudschotel in het groen weergegeven, gevisualiseerd met een anti-koudschotel-antilichaam vanuit ventraal perspectief.In een chimerisch embryo in stadium 12 genereert de neurale kam van de donor een mandibulair skelet dat qua grootte en vorm kenmerkend is voor een kwartel. Zodra de techniek onder de knie is, kan elke transplantatie in ongeveer vijf minuten worden voltooid. Indien de procedure langer duurt, loopt het embryo een risico op uitdroging en zal de overlevingskans afnemen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om op uw houding te letten, uw schouders te ontspannen en een goede handpositie te behouden. Ontwikkel daarnaast een routine en plaats uw chirurgische instrumenten en reagentia elke keer op dezelfde plek, zodat u uw ogen in de microscoop kunt houden en uw handen op een geautomatiseerde manier kunt bewegen.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt ​​bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.

Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Werkwijze voor het orofaciale grootte en vorm van Xenopus laevis embryo kwantificeren ontwikkeld. In dit protocol worden metingen traditionele formaat gecombineerd met geometrische morfometrie te zorgen voor meer geavanceerde analyses van orofaciale ontwikkeling en defecten.

Kwantificering van Orofacial Phenotypes in Xenopus

Cel organisatie van craniofaciale botten is al lang de hypothese, maar niet direct zichtbaar. Multispectrale cell labeling en in vivo levende   beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische cel gedrag in de zebravis onderkaak. Hier hebben we detail het protocol te manipuleren Zebrabow transgene vis en direct waar te nemen cel intercalatie en morfologische veranderingen van chondrocyten in de Meckel's kraakbeen.

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel&#39;s Kraakbeen

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

Hier beschrijven we in detail een methode, die is gebaseerd op microcomputertomografie, om 3D-modellen van craniomaxillofaciale botten bij muizen te segmenteren en te meten, voor een betere beoordeling van de craniomaxillofaciale botontwikkeling bij muizen dan wat mogelijk is met de huidige methoden.

Analyse van craniomaxillofaciale misvormingen bij muizen met behulp van driedimensionale microcomputertomografie

Leer hoe kwartel-eend chimeras soortspecifieke bijdragen van neurale kamcellen aan craniofaciale ontwikkeling onderzoeken. Deze methode onthult mechanismen van skeletpatronering en evolutionaire biologie.

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

Meer video's verkennen