Karakterisering van Multi-layered Fish Scales (

Het algemene doel van deze procedure is om de structuur, chemie en mechanische eigenschappen van meerlaagse gemineraliseerde visschubben te bepalen door middel van röntgen-computertomografie, nano-indentatie, Fourier-transform infraroodspectroscopie en scanning-elektronenmicroscopie gekoppeld aan energiedispersieve röntgenspectroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de individuele schubben voor analyse voor te bereiden door het zachte weefsel van de schubben te verwijderen, de schubben te monteren en in secties te snijden, gevolgd door stapsgewijs polijsten. De tweede stap is het uitvoeren van ruimtelijk gecorreleerde nano-indentatie langs de dwarsdoorsnede van de schub met een diamanten Berkovich-tip om de lokale nanomechanische eigenschappen te bepalen.

Vervolgens worden de binnenste en buitenste lagen van de visschubben onderzocht met een FTIR-microscoop om de belangrijkste functionele groepen in de respectievelijke lagen te identificeren. De laatste stap is het gebruik van de EDX-detector op de scanning-elektronenmicroscoop om de lokale chemische samenstelling te correleren met de nano-indentiaties die in de visschubben zijn aangebracht, en om beelden vast te leggen van de indentiaties in de verschillende lagen en breukvlakken. Uiteindelijk worden, door het combineren van deze verschillende experimentele technieken, de natuurlijke ontwerpprincipes van gemineraliseerde visschubben opgehelderd door een begrip van de structuur-eigenschaprelaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande testmethoden, zoals bulk statistische nano-indentatie, is dat het een directe correlatie biedt tussen de chemische samenstelling, de structuur en de lokale mechanische eigenschappen. In gebieden van belang hebben we deze methode toegepast om de ruimtelijke distributie, de chemische samenstelling, de structuur en de mechanische eigenschappen in structurele biomaterialen te bestuderen. Het heeft bovendien vele toepassingen, waaronder cementgebonden materialen, meerfasige composieten en in feite elk type heterogeen materiaal dat deze heterogeniteit vertoont op micrometer- en nanometerschaal.

Om een dwarsdoorsnede van de korte as van een visschub te onderzoeken, plaatst u de visschub in een monstervorm met een diameter van 32 millimeter, waarbij u een commercieel verkrijgbare plastic monsterhouder gebruikt om het monster correct georiënteerd te houden tijdens het inklikken in de epoxy. Zodra het monster in de vorm is gefixeerd, giet u ongeharde epoxy over het monster. Laat de epoxy uitharden volgens de instructies van de fabrikant en zaag vervolgens het gemonteerde monster door in de middellijn met een precisie-afzaagmachine met een diamantblad.

Zodra het monster in de nanoindentometer is geladen, worden de softwarebedieningselementen gebruikt om het preparaat naar de locatie voor de eerste indrukking te verplaatsen. Voer vanaf deze locatie vier parallelle rijen indrukkingen uit met een tussenruimte van 15 micrometers om een statistisch significant gegevensbestand te verkrijgen. Stel de nanoindentometer vervolgens in op een maximale belasting van 5 millinewtons, belastings- en ontlastingssnelheden van 0,1 millinewtons per seconde, een totale tijd van 30 seconden en een minimale afstand tussen de indrukkingen van 5 micrometers per rij. Wanneer de batch is voltooid, worden met de nanoindentometer referentie-indrukkingen gemaakt met een maximale belasting van 100 millinewtons bij de eerste en laatste indrukking, welke respectievelijk in de epoxy vóór de anoe-laag en na de botlaag moeten worden geplaatst.

Plaats het monster na nano-indentatie terug in de PBS-oplossing om verdere dehydratie te voorkomen. Monteer het monster stevig, zodanig dat de langste dimensie parallel loopt aan de detector. Bevestig na het instellen van de scanner het gemonteerde monster aan de scantafel met materialen die röntgenstralingsdoorlatend zijn, zoals piepschuim en paraforme.

Positioneer het monster zodanig dat het zich in het rotatiecentrum bevindt. Selecteer gedurende de scan de hoogste resolutie waarmee de volledige schaal in het gezichtsveld past, wat in dit geval 7.5 micrometers is. Reconstrueer na de gegevensverwerving de röntgenprojectiebeelden om een dataset met dwarsdoorsnedebeelden te creëren.

Gebruik vervolgens de software om het definitieve 3D-grijswaardenbeeld te verkrijgen. Pas het grijswaardenbereik aan naar een passend niveau om de artefacten van het piepschuim en paraforme te verwijderen. Voor SEM-opnamen (scanning elektronenmicroscopie) van nano-indents op het gepolijste monster, bevestig het monster aan een SEM-stub met dubbelzijdige koolstoftape, waarbij het oppervlak met de indents naar boven is gericht. Plaats vervolgens het preparaat in de SEM-kamer en pomp de kamer naar de lage vacuümmodus.

Stel de werkafstand in op tussen 3.0 en 5.0 millimeter. Activeer de hoogspanning en navigeer naar de regio's van belang op het preparaat, wat in dit geval de structuren in de anoe- en botlagen zijn. Maak vervolgens beelden bij een hoogspanning tussen 5 kilovolt en 15 kilovolt en een lagere bundelstroom van 3.9 nano ampère.

Om de resolutie te verbeteren, worden er beelden vastgelegd van ten minste drie interessante regio's bij vergrotingen van 250 x tot 10.000 x met behulp van de low vacuum back scattered electron BSE-detector, om de identificatie van veranderingen in het biomineraalgehalte en de dichtheid te ondersteunen. Navigeer vervolgens naar een interessante regio op het gepolijste monster waarin een nano-indentatierooster is opgenomen, aangegeven door fiduciale markeringen aan het uiteinde van elke lijn met indentaties. Zorg ervoor dat de hoge spanning ten minste 15 kilovolt bedraagt.

De bundelstroom is ten minste 3,9 nano amps en de werkafstand is groter dan 5,0 millimeter. Leg vervolgens het terugverstrooide elektronenbeeld vast van het gebied dat met EDX geanalyseerd zal worden. Maak hiervoor gebruik van EDX-analysesoftware.

Leg hetzelfde beeld vast om te helpen bij het lokaliseren van gebieden voor chemische analyse langs de lijn van inkepingen. Positioneer vervolgens, met behulp van de lijnanalysetechniek, een lijn om een chemische analyse uit te voeren langs de betreffende lijn van inkepingen, beginnend bij de eerste inkeping en eindigend bij de laatste inkeping. Specificeer het aantal analysepunten dat langs de lijn moet worden geplaatst, waarbij hetzelfde aantal wordt gebruikt als het aantal aanwezige inkepingen, om een directe ruimtelijke correlatie tussen de chemische samenstelling en de mechanische eigenschappen te verkrijgen.

Wanneer de lijn is gepositioneerd en de punten correct zijn gespecificeerd, wordt de lijnanalyse gestart met behulp van de EDX-software. Na voltooiing van de lijnanalyse worden de elementen van belang geïdentificeerd die gekwantificeerd moeten worden op basis van de punktspectra die zijn verkregen langs de gespecificeerde lijn op het gepolijste oppervlak van het monster.

Zodra de elementen van belang zijn geïdentificeerd, wordt er een achtergrondkalibratie uitgevoerd om rekening te houden met remstralingsruis en andere effecten. Kies de optie voor deconvolutieanalyse in de software om een kwantitatieve analyse van elk punt langs de opgegeven lijn te verkrijgen, teneinde de chemische samenstelling op elk punt te kwantificeren. Sla tot slot de resultaten van de kwantitatieve chemische analyse op, samen met de afbeelding van de geanalyseerde lijn, om de ruimtelijke correlatie met de mechanische eigenschappen te ondersteunen die zijn gemeten met nano-indentatie in de anoe-laag; de nano-indentatie berekende een gemiddelde modulus van 69,0 giga pascals en een hardheid van 3,3 giga pascals.

Met nano-indentatie werd voor de botlaag een gemiddelde modulus van 14,3 GPa en een hardheid van 0,5 GPa vastgesteld. De anoe- en botlaag bevatten kwantificeerbare verschillen in chemische samenstelling. De koolstofpiek in de botlaag kan worden toegeschreven aan een lage mineralisatie, wat resulteert in een toename van koolstof en een afname van de helderheid van de BSE-afbeelding. FTIR-spectra van de bot- en ENE-lagen tonen hydroxyapatiet-signaturen in de buitenste gwe-laag en collageen-signaturen in de binnenste botlaag.

Röntgen-computertomografie laat zien dat de gwe-laag de botlaag niet bedekt op de plaatsen waar de schubben elkaar overlappen. De lichter grijze gwe-lagen zijn dichter, harder en stijver, terwijl de donkerder grijze botlagen een lagere dichtheid en stijfheid hebben. Er zijn duidelijke putjes waarneembaar nabij het centrum van de ging-laag, wat de niet-uniformiteit ervan aantoont.

De SEM-opname van het geëtste breukoppervlak bij een lagere vergroting onthulde nanostructuren die in een gelaagd patroon in de gingiva-laag waren georganiseerd, wat correleert met de FTIR. SEM-opnames bij een hogere vergroting van het geëtste breukoppervlak tonen georiënteerde nanostaven in de gingiva-laag, terwijl er in de botlaag na de ontwikkeling een vezelachtige nanostructuur wordt waargenomen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor aanvullend onderzoek naar biomaterialen en composietmaterialen om de ruimtelijke distributie van de chemische samenstelling, structuur en mechanische eigenschappen te bestuderen, en om interfaces in meerfasige composietmaterialen te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u monsters voorbereidt en analyses uitvoert om de chemische samenstelling ruimtelijk te correleren met de structuur en mechanische eigenschappen in structurele biomaterialen.

Deze technieken zijn ook toepasbaar en aanpasbaar voor het bestuderen van andere typen heterogene meerfasige materialen.