Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

Hallo, ik ben Christina McKennan van de Universiteit van Helsinki, Finland. Een van de uitdagingen bij het karakteriseren van een specifiek proteïnecomplex is het bepalen van de moleculaire samenstelling ervan. Hiervoor is de ontwikkeling van methoden nodig om het complex uit de cellulaire omgeving te isoleren en te zuiveren.

Het onderzoeksgebied binnen de microbiologie richt zich op de interacties tussen plantenvirussen en hun gastheren; we zijn daarom geïnteresseerd in de verschillende virale ribonucleoproteïnecomplexen die tijdens de infectie worden gevormd. In het verleden hebben we deze complexen met succes bestudeerd met behulp van zuivering op basis van affiniteitstags. De Twin-Strep-tag bleek een van de meest effectieve tags te zijn.

We hebben echter bepaalde beperkingen in het gebruik waargenomen, waaronder een lage opbrengst, en daarom wilden we deze methode verbeteren. Hallo, mijn naam is Mata en ik zal u door het experimentele protocol leiden. Maar eerst geef ik u een overzicht van de methode.

We maken gebruik van strep tachin macro prep beads om specifieke complexen tussen twin strept-getagde eiwitten en hun fysiologische bindingspartners te zuiveren. De strep-getagde tetrameer is in het groen weergegeven, het twin strept-getagde eiwit in het blauw, de bindingspartner in het oranje en twee kopieën van de strep-tag in het rood.

De ongebonden eiwitten, weergegeven als grijze pijlen, worden in de conventionele methode verwijderd door middel van wassen. De gebonden complexen worden competitief geëlueerd met biotine, weergegeven in roze. We observeerden echter bij het gebruik van deze methode een onvolledige elutie van de gebonden complexen, waarbij slechts een fractie succesvol loskwam van de streptavidine-beads.

Dit resulteert in een lage recovery van het doeleiwit. Om verdere analyse te bemoeilijken, kan de recovery van het doeleiwit worden verbeterd door gebruik te maken van denaturerende elutie met S-D-S-S-D-S. Er worden miss cells gevormd rond het gedenatureerde twin strep ttag bait-eiwit.

Zijn bindingspartner en rond de gedissocieerde monomeren van streptactine. De resulterende monstercontaminatie met vrijgekomen streptactine is onaanvaardbaar als het monster verder geanalyseerd moet worden via massaspectrometrie. Om het probleem van monstercontaminatie te overwinnen, hebben we een methode ontwikkeld waarbij het streptactine-tetrameer eerst wordt gestabiliseerd door chemische crosslinking.

De resulterende gecrosslinkte hars wordt gebruikt om het lokaas-eiwit en de bindingpartner van het monster te zuiveren; elutie met SDS waarborgt een hoog eiwitherstel, terwijl chemische crosslinking van de hars de elutie van het strept-getagde lokaas-eiwit en de bindingpartner garandeert zonder contaminatie van het monster met vrijgekomen strept. Laat één afgesloten microcentrifugebuisje met 2 mg BS3-crosslinker equilibreren tot kamertemperatuur.

Bereid een pipetpunt voor op harsoverdracht door het uiteinde van de punt af te knippen. Resuspendeer de strep tact- en macro prep-hars door kort en krachtig te schudden en breng onmiddellijk 600 µL van de suspensie over naar een CoStar spinx filterkolom; centrifugeer 30 seconden bij 4.000 RPM. Voeg bij kamertemperatuur 450 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing toe. Het doel van deze stap is om primary am mean triss te vervangen door niet-reactief fosfaat.

Gooi de doorstroomvloeistof weg. Meng de inhoud door de buis meerdere keren om te keren. Herhaal de centrifugatie- en wasstappen twee keer en laat de hars in 430 µL PBS pH 8.

Door na de laatste centrifugatie de folie van de microbuis door te prikken met een pipetpunt met 100 µL Milli-Q water, kan het BS3-poeder in het water worden opgelost door voorzichtig op en neer te pipetteren. Zodra de BS3 volledig is opgelost, worden onmiddellijk 20 µL van de oplossing aan de SpinX-kolom toegevoegd. Zorg ervoor dat de inhoud goed is gemengd.

Roteer de kolom 30 minuten bij kamertemperatuur, waarbij u ervoor zorgt dat de hars goed is gemengd met de BS drie-oplossing. Om de reactie te stoppen, voegt u zes µL drie molar tris toe, ingesteld op pH 7.5 met zoutzuur. Roteer de kolom nogmaals 15 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens 30 seconden bij 4.000 RPM.

Suspendeer de gecrosslinkte hars bij kamertemperatuur in 450 µL tris-gebufferde zoutoplossing met tween 20 en gooi het doorstroomvolume weg. Herhaal de centrifugatie- en wasstappen nog twee keer. Suspendeer de hars in de laatste stap opnieuw in 450 µL TBS. Draag de hars-suspensie over naar een nieuw buisje, suspendeer de resterende hars in de kolom met nog eens 450 µL TBS en draag dit over naar hetzelfde buisje.

Herhaal de laatste stap nogmaals om een maximale overdracht van de hars van de kolom naar de buis te garanderen. Laat de buis met de harsuspensie 10 minuten staan bij kamertemperatuur en vul het volume aan tot 600 µL. Door het overschot aan TBS te verwijderen, is de hars klaar voor onmiddellijk gebruik of kan deze worden bewaard bij 4 °C zonder te vriezen.

Deze methode is geschikt voor de zuivering van elk fusie-eiwit met een twin-strep-tag en de daarmee geassocieerde complexen. Het eiwit kan van dierlijke, plantaardige of bacteriële oorsprong zijn en kan worden geïsoleerd uit zowel een totaal cellysaat als een verrijkte organelfractie. In dit voorbeeld isoleren we een twin-strep-tag-eiwit, VPG Pro van aardappelvirus A, uit de kernfractie van virusgeïnfecteerde planten; begin met het centrifugeren van één milliliter van het lokeiwitmonster in bindingsbuffer bij 13.000 RPM gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Overbreng de supernatant naar een nieuwe buis om binding van endogene gebiotinyleerde eiwitten aan de strep tact en hars te minimaliseren. Voeg avadon toe tot een eindconcentratie van 100 µg/mL en zorg ervoor dat de inhoud grondig is gemengd. Roteer gedurende 15 minuten bij 4 °C.

Resuspendeer de gecrosslinkte hars door te vortexen en voeg met een cup-pipetpunt onmiddellijk 50 µL van de hars-suspensie toe aan de buis met het bait-proteïnemonster. Roteer gedurende nog eens 30 minuten bij 4 °C terwijl u wacht. Stel de thermomixer in op 55 °C en verwarm 500 µL Elu-buffer voorvoor gebruik in de elutiestap voor; centrifugeer bij 2000 RPM gedurende één minuut bij 4 °C.

Verwijder het supernatant en was de hars met 1 mL vooraf gekoelde wasbuffer nummer één door vijf minuten te roteren bij 4 °C. Herhaal de centrifugatie- en wasstappen drie keer bij de laatste stap.

Resuspendeer de hars in 250 µL wasbuffer nummer twee en breng de harsuspensie over naar een nieuwe spinx-kolom. Resuspendeer de resterende hars in de buis in nog eens 250 µL wasbuffer nummer twee en breng dit over naar dezelfde kolom; centrifugeer 3 minuten bij 2000 RPM bij 4 °C. Breng de kolom over naar een nieuwe dolphin nose 2 mL buis en gooi het doorstroomvolume weg.

Ga onmiddellijk over tot de volgende elutiestap. Voeg 150 µL voorverwarmde elutiebuffer toe aan de spin-kolom. Incubeer de oplossing vijf minuten in de thermomixer bij 55 °C, schuddend op 1400 RPM, centrifugeer vervolgens één minuut bij 4 000 RPM op kamertemperatuur en gooi de kolom weg.

De gezuiverde doeleiwitten zijn nu klaar voor verdere analyse en kunnen worden bewaard bij temperaturen onder -20 °C. De afbeelding laat zien dat de elutie van eiwitten uit streptactin macro-prep hars met biotine onvolledig is in vergelijking met elutie met SDS. Het verschil in signaalintensiteiten van de western blot weerspiegelt de verschillende eiwitopbrengsten die met de twee elutietechnieken zijn behaald. Hoewel elutie met SDS veel efficiënter is dan elutie met biotine, leidt dit tot contaminatie van het monster met vrijgekomen streptactine.

De afbeelding toont een zilverkleuring van de gel van SDS EIT's uit de Streptactin Macro prep resin; let op de aanwezigheid van vrijgekomen streptactin in de linkerbaan, maar de afwezigheid ervan in de rechterbaan. Het monster links is geëlueerd uit de niet-gecrosslinkte resin en het monster rechts uit de resin die gecrosslinkt is met BS3. Op basis van deze resultaten concluderen we dat crosslinking met BS3 de vrijgave van streptactin uit de resin tijdens SDS-eluutie voorkomt.

In dit voorbeeld hebben we Strept actin macro prep resin, gecrosslinkt met BS drie, gebruikt om het lokaas-eiwit VPG PRO en de bijbehorende bindingspartners te zuiveren. Een aliquot van het gezuiverde monster werd onderworpen aan massaspectrometrie-analyse voor eiwitidentificatie. De afwezigheid van een specifieke band in de negatieve controle bevestigt de specificiteit van de pull-down.

De onderste band komt overeen met het lokaas-eiwit VPG PRO en de bovenste band met de bindingspartner NIB replicate, geïdentificeerd via massaspectrometrie. Hallo, we hebben zojuist laten zien hoe chemische cross-linking kan worden gebruikt om de beperkingen te overwinnen die gepaard gaan met denaturatie en elutie uit de strep-tac-hars. Naast de zuivering van eiwit-eiwitcomplexen kan de methode ook worden gebruikt voor de zuivering van eiwitcomplexen met nucleïnezuren, inclusief die welke met formaldehyde zijn cross-linked.

Ten slotte kan de methode worden gebruikt voor het zuiveren van strep tech membraaneiwitten. Deze worden gesolubiliseerd met detergentia. Detergentia zijn nodig om deze hydrofobe eiwitten in oplossing te houden.

Hun aanwezigheid kan echter leiden tot monstercontaminatie door het vrijkomen van strep-tane. Zelfs bij een milde biotin-evolutie denken wij dat cross-linking van de hars een oplossing kan bieden voor het probleem van monstercontaminatie. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Oké.