Name: In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer in vitro aggregatietesten voor tau-eiwitonderzoek met hypergefosforyleerd tau. Deze methode vergelijkt aggregatiekinetiek en helpt bij het begrijpen van de ziekte van Alzheimer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Aging (AG039768) aan MHK. We danken Drs. Thomas Sharkey en Honggao Yan voor het genereus verstrekken van de instrumenten, evenals Sean Weise en Yan Wu voor technische assistentie.

1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid aggregatie buffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Bewaar bij RT, stabiel maanden. Supplement 1 mM dithiothreitol (DTT) vóór gebruik. OPMERKING: een HEPES-gebaseerde buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) produceert dezelfde resultaten tau aggregatie. </li><li> Bereid thioflavin T of thioflavin S stockoplossing (3 mM, opgelost in aggregatie buffer) en filter door 0,22 pm steriele filter unit. Bewaren bij -20 ° C in een buis onder aluminiumfolie, stabiel maanden. </li><li> Bereid heparine stockoplossing (300 uM, opgelost in aggregatie buffer). Bewaren bij -20 ° C, stabiel gedurende maanden. </li><li> Bereid dithiotreïtol (DTT) voorraad (1 M, opgelost in water). Aliquot in 1,5 ml buizen. Bewaren bij -20 ° C. Voor aggregatietesten ontdooien de 1 M oplossing bij kamertemperatuur. Vanaf deze 1000x voorraad, bereiden een portie van 100 mM werkvoorraad met gedemineraliseerd water. Laat het ijstot klaar. </li><li> Verwijder tau van -80 ° C vriezer. Ontdooien op ijs. Pas tau aan vooraf bepaalde concentratie met de aggregatie buffer. Spin in een microcentrifuge bij 20.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C staan ​​voorgebakken grote aggregaten te verwijderen. Deze pre-spinning stap vergroot de samenhang van de daaropvolgende fluorescentie meting van elke partij van het eiwit prep. Breng het supernatans naar een andere buis; vertrekken op ijs pas klaar voor de aggregatie reactie monteren. </li></ol> 2. No-kleurstof, Terminal Assay OPMERKING: De aggregatie reactie van deze test geschiedt bij afwezigheid van de fluorescente kleurstof. Na het mengen van alle componenten wordt de reactie om naar vooraf bepaalde tijdstippen. Monsters worden vervolgens uit de aggregatie reactie en gemengd met ThT of THS voor amyloïde binden voordat fluorescentie lezen. Het beginvolume van de aggregatie reactie hangt af van het aantal tijdstippen nodig. Deze aanpak kan requIre een grote hoeveelheid tau-eiwit, maar is snel, eenvoudig en kan in een fluorometer of een multi-well plaatlezer (zie bespreking). Hieronder is de stap voor stap, gebruikmakend van het ISA SPEX FluoroMax-2 spectrofluorometer compact fluorescentie voor kwantificering. <ol><li> Stel de aggregatie mengsel in 1,5 ml Eppendorf buisjes zoals in tabel 1. Elke kolom geeft de ingrediënten voor een 100 ui reactie, wat genoeg is voor een tijdpunt meting. Pas het bedrag voor de gehele aggregatie mix gebaseerd op de tijdstippen die nodig is voor dat experiment. Voeg nog 10% van elke component om ruimte te maken voor pipetteerfout. De typische reactie die heparine hier worden vervangen door arachidonzuur of aggregatie buffer. Voeg aan 1 mM DTT aan het reactiemengsel. Als de gehele reactie duurt meer dan een dag, als aanvulling verse DTT alledaagse (1 mm) tot een reducerend milieu te waarborgen. </li><li> Keer de buis een paar keer om te mengen. Place elke reactie in een 37 ° C incubator of waterbad. Roeren is niet noodzakelijk voor tau aggregatie. </li><li> Voordat het meten van de fluorescentie, zet de spectrofluorometer (lamp eerst, dan de computer). OPMERKING: De xenon arc lamp die direct kunnen worden gebruikt. Echter, voor het beste resultaat kunt u het apparaat opwarmen ongeveer 10 minuten vóór het lezen van fluorescentie. </li><li> Start de software op de computer. <ol><li> Kies Real Time modus Display in Instrument Control Center, ingesteld excitatie golflengte tot 450 nm (spleet tot 2 nm) en emissie golflengte tot 510 nm (spleet tot 5 nm). Sluiten Real Time Display modus venster om terug te keren naar het Instrument Control Center. </li><li> Kies Constant Golflengte Analyse, drukt u op Toevoegen &gt;&gt; sleutel in het bovenste frame golflengten sets toe te voegen. Stel acquisitie parameters van Standard Error op 1 en maximaal Trials tot 3, klik op Toevoegen. Klik op Go! Om de gegevens weer te openenraam. </li><li> In het Data Display, klikt u op Start Acq om het dialoogvenster Nieuwe Sample openen. Kies &quot;onbekend&quot; voor soort monster. </li></ol></li><li> Om elke 100 ul aggregatie mengsel, voeg 98 ul aggregatie buffer en 2 pi 3 mM thioflavin T. pipet enkele malen om te mengen. </li><li> Breng het gehele mengsel aan een cuvet (FCA3, buitenkant dimensie, bxlxh = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Plaats de cuvette in de monsterhouder in de steekproef-compartiment en sluit het deksel. Klik op Uitvoeren om de fluorescentie gegevens te verzamelen. Noteer de gegevens. </li><li> Verwijder de cuvet en wordt de oplossing. Spoel de cuvet met gedestilleerd water 3 keer. Droog door te blazen lucht in en buiten de cuvette. </li></ol> 3. Met-dye, Continue Mode Assay op een SpectraMax M2 Plate Reader Opmerking: Deze test verschilt van de vorige doordat de fluorescente kleurstof ThT of ths opgenomen in de aggregatie reactie. Dit maakt continue meting van dezelfde set van reacties. Door het herhaald gebruik van de reactie wordt deze werkwijze beter uitgevoerd met een automatische multiwell-plaatlezer (zoals onder de werking van SpectraMax M2). Een regelmatige fluorimeter werkt ook maar de meetfrequentie van snelle aggregatie reactie is enigszins beperkt vanwege de handmatige aard van de operatie. <ol><li> Stel de aggregatie mix in een plaat met 96 putjes (96 putjes zwarte vaste plaat, goed volume 360 pl, vlakke bodem) volgens tabel 2. Elke kolom geeft de ingrediënten voor een 200 gl reactie, die genoeg is voor een tijd-punts meting. Meng goed door meerdere malen pipetteren. Supplement verse 1mM DTT elke dag in de loop van de experimenten. </li><li> Incubeer de plaat met 96 putjes bij 37 ° C. </li><li> Op elk tijdstip vóór fluorescentiemeting, zet de multi-mode microplaat reader en de computer. Voldoende tijd voor de machine te stabiliseren, ongeveer 10 min. </li><li> Start de software op de computer. Stel de temperatuur tot 37 ° C en kies fluorescentie- intensiteit (FI-Top lezen) modus ingesteld excitatie golflengte bij 450 nm en emissie golflengte bij 510 nm. </li><li> Plaats de plaat met 96 putjes in de lade en druk LEES toets om de meting te starten. </li><li> Na het lezen, verwijder de plaat en stuur het terug naar de 37 ° C incubator. Kopieer de gegevens en plakken in een Excel-spreadsheet voor data-analyse en plotten. </li></ol> 4. Met-dye, Continue Mode Assay op een Compact Spectrofluorometer <ol><li> Stel de aggregatie mengsel in 1,5 ml Eppendorf buisjes zoals in tabel 3. Elke kolom geeft de ingrediënten voor een 200 gl reactie, die genoeg is voor een tijdpunt meting. </li><li> Keer de buis een paar keer om te mengen. </li><li> Zet de spectrofluorometer en zet de software als in de stappen 2.3 en 2.4. </li><li> Breng het gehele mengsel to een cuvet. Plaats de cuvette in de monsterhouder in de steekproef-compartiment en sluit het deksel. Klik op Uitvoeren om de fluorescentie gegevens te verzamelen. Noteer de gegevens. </li><li> Lees verder op geschikte tijdstippen door te klikken op Uitvoeren en het opnemen van de gegevens. Als de aggregatie wordt gecontroleerd op een hoge frequentie (bijvoorbeeld elke 30 of 60 seconden), laat de reactie in de cuvet en in het apparaat totdat de meting is voltooid, of wanneer er voldoende tijd is om reacties of cuvettes wisselen. </li><li> Verwijder de cuvet en wordt de oplossing. Spoel de cuvet met gedestilleerd water 3 keer. Droog door te blazen lucht in en buiten de cuvette. </li></ol>

We hebben niets te onthullen.

Dit protocol toont verschillende testomstandigheden en instrumenten die de fosforylering-afhankelijke snel tau aggregatie kinetiek detecteren. In de terminal assay, wordt de fluorescentie kleurstof ThT toegevoegd aan een deel van het reactiemengsel uit de master mix op elk tijdstip. Amyloid binding geïnduceerde fluorescentie wordt vervolgens gemeten 26. In de tweede, met kleurstof modus tau aggregatie in aanwezigheid van ThT of THS uitgevoerd, zodat dit type reactie geschikt voor real-time automatische beoord...

De ziekte van Alzheimer (AD) is één van een grote collectie van neurodegeneratieve aandoeningen bekend als tauopathieen. De typische pathologie onderliggende tauopathie is de tangles, NFTs, in neuronen, astrocyten en microglia 1-4. De NFT dichtheid correleert met cognitieve stoornissen 3,5 en neuron verlies 6. NFT bevat voornamelijk hypergefosforyleerde tau-eiwit (aangeduid als &quot;p-tau&quot; voortaan) die recht of gepaarde helixvormige filamenten (PHF) 7,8 vormt. Tau is een microtubuli geassocieerde eiwit dacht bij axonale transport, dat is onontbeerlijk voor de neuronale signalering van en handel 9,10 vergemakkelijken. Elke tau molecuul 2-3 fosfaten in normale hersenen, maar de fosforylgroep gehalte toeneemt door verscheidene vouwen in tauopathie patiënten 11. Meerdere kinases zijn waarschijnlijk bijdragen tot tau hyperfosforylatie inclusief GSK3P (glycogeensynthasekinase 3β) en CDK5 (cycline-dekelijke kinase 5) 12,13, maar de directe aanleiding voor de pathologische fosforylering blijft ongrijpbaar 14. Abnormale fosforylatie in of nabij de microtubuli bindende motieven dissocieert tau de microtubule 15, en veroorzaakt tau mis-lokalisatie aan het somatodendritische compartiment waar p-tau oligomerizes in rechte of gepaarde spiraalvormige filamenten die uiteindelijk kunnen polymeriseren in NFT insluitsels. De nauwe band tussen tau hyperfosforylatie, NFT vorming, en neurodegeneratie leidde tot een heersende hypothese dat p-tau klitten ontlokken apoptotische en andere cytotoxische reacties, en daarmee is de onderliggende oorzaak voor tauopathie neurodegeneratie 16,17. Drug schermen en vroege klinische tests op basis van dit uitgangspunt zijn gelanceerd 18. Echter, deze hypothese wordt geconfronteerd met uitdagingen 19,20. Bijvoorbeeld SantaCruz et al. Toonden aan dat cognitieve functies van transgene muizen kunnen worden verbeterd door het onderdrukken van de expressie van een mutantmenselijke tau, hoewel NFT blijven vormen bestaande tau moleculen 21. In een Drosophila model, werd aangetoond dat de NFT toxische cytosolische tau sekwestreren de onderliggende zenuwcellen 22,23 beschermen. Duidelijk de pathogenese rol van NFT eventuele sterk zal beïnvloeden richting tauopathie therapeutische ontwikkeling. In hoge concentraties recombinant of normale hersenen tau-eiwit spontaan maar langzaam polymeriseert in een PHF-achtige structuur in vitro, zoals aangegeven door de binding van verschillende β-sheet voorkeur fluorescente kleurstoffen, elektronenmicroscopie en lichtverstrooiing spectroscopie 24-27. Het toevoegen van heparine of arachidonzuur, een overvloedige vetzuur in menselijke hersenen, drastisch versnelt PHF formatie tau isoform- en inductor concentratieafhankelijke manieren 28-32. Intrigerend hypergefosforyleerde tau gezuiverd van AD hersenen of door uitputtend in vitro bereid fosforyleringsreacties eenggregates sneller en efficiënter 26,33-35. Deze resultaten zijn in uitstekende overeenkomst met de pathologische rol van p-tau. Een in vitro systeem gebaseerd op de aggregatie van p-tau kan dus dienen als een krachtig hulpmiddel voor AD drug screening. Gezien de nauwe samenwerking tussen tau-aggregatie en de progressieve neurodegeneratie van AD, evenals de recente mislukking in de ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op de AP-plaque, een andere belangrijke histologische marker van AD 36-38, de belangstelling voor het ontdekken van geneesmiddelen die controle tau aggregatie stijgt. Inderdaad hebben verscheidene groepen al begonnen drug schermen op verschillende verwerkingscapaciteit hand van in vitro tau aggregatie reacties als primaire assay. Een aantal chemische stoffen bleken remmende of omkering activiteiten op tau aggregatie vertonen in vitro 39-42. Echter, alle huidige tau aggregatie regulator schermen gebruiken ongewijzigde tau dat de belangrijkste pathologische kenmerk van fosfor mistylering, verhogen een zorg voor de specificiteit en de werkzaamheid van deze verbindingen bij AD behandeling. Een van de belangrijkste hindernissen ontwikkelen aggregatie assays voor biochemische karakterisering en AD drug screening is de productie van voldoende hoeveelheden van het pathofysiologisch relevante hypergefosforyleerd tau-eiwit. Met behulp van de ritsen geassisteerde katalyse systeem waarin de 1N4R isoform van tau en de GSK-3β kinase gelijktijdig worden gebracht in E. coli leucine zipper fusie-eiwitten hebben we deze uitdaging overwinnen (. Sui et al, ingediend; zie Figuur 1 voor de eindproducten van tau en p-tau, zie ook 43 een voorlopige massaspectrometrie karakterisering van p-tau). Uit een panel van negen antilichamen specifiek voor verschillende fosforylatieplaatsen van tau werden positieve signalen waargenomen in acht posities (gegevens niet getoond). Hieronder beschrijven we protocollen en instrumentaties die kunnen onderscheiden van de aggregatie kinetische differences tussen ongewijzigde tau en p-tau soorten. Deze testen werden gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde protocollen dat de toename van de fluorescentie van thioflavine T (ThT) of thioflavin S (THS) op amyloid (tau aggregaten) binding 26 gemeten. In de eerste &quot;terminal&quot;, geen kleurstof benadering aggregatie reacties worden samengevoegd en geïncubeerd in de afwezigheid van de amyloïde kleurstof. Op verschillende tijdstippen is een monster van elke reactie verwijderd en gemengd met een gelijk volume van de ThT bevattende buffer aggregatie stoppen en laat ThT tau aggregaten binden. Fluorescentie wordt gemeten door een IAP FluoroMax-2 fluorometer. In de tweede &quot;met kleurstof&quot; continue bewaking test ThT of THS is bij de aggregatie reacties. Fluorescentie kan manueel continu gemeten gedurende het gehele experiment of een multi-plaatlezer. Verder beschrijven we een test die een bijna fysiologische concentratie van tau en p-tau gebruikt voor aggregatie in de continue meting mode. Het effect van fosforylering steeds gemakkelijk detecteerbaar. Hieronder wordt stap voor stap bedieningsprocedures beschrijven en tonen representatieve resultaten van deze assays. Bespreking van een aantal van de voor-en nadelen van elke benadering, evenals de mogelijke drug discovery programma&#39;s zullen volgen. Bij een hoge concentratie, tau aggregaten in amyloïd-achtige structuren spontaan. In het laboratorium, tau fibrillization wordt gewoonlijk versneld door inductoren zoals heparine (gemiddeld molecuulgewicht 6000 g / mol) en arachidonzuur. Voorbeelden hierin zijn inclusief 30 uM heparine. De vorming van tau amyloïde aggregaten wordt door de fluorescentie verkregen uit amyloïde binden door thioflavine T (ThT) of Thioflavin S (THS). Na binding aan tau aggregaten, ThT vertoont een rode verschuiving in fluorescentie (excitatie: 450 nm; piekemissie: 485 nm). THS, daarentegen, heeft zwakke emissie bij 510 nm (excitatie bij 450 nm) voordat amyloïde binden, maar dit fluorescence significant in aanwezigheid van amyloïde eiwit toeneemt als de geaggregeerde tau 44. Beide kleurstoffen werken goed in het opsporen van tau en p-tau-aggregatie. Vanwege de sterke en relatief brede emissiepiek van ThT (zie figuur 2), is er slechts 30% verlaging van de fluorescentie-eenheid bij 510 nm. Gemakshalve gebruiken we dezelfde combinatie van excitatie / emissie golflengten (bijvoorbeeld 450 nm / 510 nm) tau aggregatie controleren wanneer met behulp van kleurstof. Tau aggregatie kan in aanwezigheid of afwezigheid van de kleurstof, afhankelijk van het doel van de test en de beschikbaarheid van tau-eiwit. Beide modi van reacties worden hieronder weergegeven. Verder tonen we de werking van twee verschillende instrumenten - één monster fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) en een multi-plate reader (SpectraMax M2). Lezers moeten in staat zijn om deze protocollen aan te passen aan hun specifieke behoeften en beschikbaarheid instrument aan te passen.

<table><tbody><tr><td>Trizma&nbsp;base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>Bewaar in het donker</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>Bewaar in het donker</td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB3494</td><td>Bewaar bij &ndash;80 &deg;C</td></tr></tbody></table>

in vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd tau proteïne

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's ziekte is een van een grote groep neurodegeneratieve aandoeningen, bekend als tauopathieën, die zich manifesteren door de neuronale afzettingen van hypergefosforyleerd tau-eiwit in de vorm van neurofibrillaire slinger (NFT's). De dichtheid van NFT correleert goed met cognitieve stoornissen en andere neurodegeneratieve symptomen, wat leidt tot het streven naar het ontwikkelen van op tau-aggregatie gebaseerde therapeutische middelen. Tot dusver gebruiken tau-aggregatie-assays recombinant of synthetisch tau dat verstoken is van de pathologie-gerelateerde fosforyleringsmarkeringen. Hier beschrijven we twee assays met recombinant, hypergefosforyleerd tau als onderwerp. Deze assays kunnen worden opgeschaald voor high-throughput screening van verbindingen die de kinetiek of stabiliteit van hypergefosforyleerde tau-aggregaten kunnen moduleren. Nieuwe therapeutische middelen voor Alzheimer's ziekte en andere tauopathieën kunnen mogelijk worden ontdekt met behulp van hypergefosforyleerde tau-isovormen.

Met behulp van recombinant tau en p-tau (Figuur 1), hebben we twee verschillende protocollen om de kinetiek van aggregatie van tau en p-tau vergelijken, profiteren van de sterke fluorescentie emissie van ThT en THS na binding aan proteïneaggregaten amyloidal, waaronder tau en p-tau (Figuur 2). Met of zonder de fluorescente kleurstof in de aggregatie reactie zagen we consistente verhoging van tau aggregatie door hyperfosforylering (figuren 3-5). Deze stimulatie is onafha...

Ongemodificeerde en hypergefosforyleerd tau-eiwitten werden twee in vitro aggregatie-assays om de hyperfosforylering afhankelijke snelle aggregatie kinetiek onthullen. Deze assays weg effenen voor toekomstige schermen voor verbindingen die de neiging van hypergefosforyleerde tau kan moduleren fibrillen die de progressie van de ziekte van Alzheimer ten grondslag vormen.

In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de aggregatiekinetiek van ongemodificeerde en hypergefosforyleerde tau-proteïnesoorten te monitoren en te vergelijken. Dit wordt bereikt door eerst ongemodificeerd en hypergefosforyleerd tau-proteïne te genereren met behulp van het zippers assisted catalyst-systeem. De tweede stap is het opzetten van de aggregatie-assays zodat deze geschikt zijn voor een van de twee verschillende instrumenten.Het tau-aggregatieproces wordt gemonitord via de fluorescentie van twee verschillende thioflavine-kleurstoffen, thioflavine S en thioflavine T. De laatste stap is het uitzetten en vergelijken van de aggregatiecurves. Uiteindelijk worden de kinetische veranderingen van de thioflavine-fluorescentie bij binding aan geaggregeerde tau-soorten gebruikt om de hyperfosforylering-afhankelijke versterking van tau-fibrillatie in vitro aan te tonen.Hallo. Welkom bij ons JoVE-artikel: In vitro aggregatie-assays met gebruik van hypergefosforyleerd tau-eiwit. Mijn naam is Minko, en de experimenten zullen worden uitgevoerd en gedemonstreerd door way.Voor dit protocol is een relatief verse aggregatiebuffer nodig, bereid binnen de afgelopen maand. Voeg vlak voor gebrui

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video demonstrates a fluorescence resonance energy transfer (FRET) flow cytometry assay to detect the seeding activity of protein aggregates isolated from biological samples. Mammalian cells expressing tau reporter proteins are incubated with liposome transduction complexes containing tau seeds. These seeds mediate the aggregation of the reporter proteins, leading to generating a FRET positive signal in the flow cytometer.

A FRET Flow Cytometry Technique to Detect Tau-Seed Induced Reporter Protein Aggregation

This video showcases a cell-based assay quantifying Tau uptake by murine microglia using pH-sensitive fluorescent-labeled Tau aggregates, analyzed via fluorescence-activated cell sorting for a quantitative assessment.

A Cell-Based Assay to Assess the Tau Protein Uptake by Microglia

This video demonstrates an in vitro assessment of neuronal growth cone collapse by amyloid-β (Aβ) aggregates. Treating the neurons with Aβ aggregates causes cytoskeletal destabilization, leading to the collapse of growth cones at the tip of the axons. The treated cells are compared with control cells to assess the extent of growth cone collapse.

In Vitro Assessment of Aggregated Amyloid-&beta; on Neuronal Growth Cone Collapse

This video demonstrates the process of transducing human neuronal cells with a lentivirus encoding a mutant human tau protein tagged with yellow fluorescent protein (YFP) to study protein aggregation. It outlines the steps from viral entry to mutant tau expression, culminating in the formation of visible cytoplasmic tau aggregates in the neurons.

Lentiviral-Mediated Transduction of Human Neurons for Tau Protein Aggregation Analysis

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Dit manuscript wordt beschreven standaardprotocollen voor het meten van tau hyperphosphorylation, tau binding aan de microtubuli, en lokalisatie van intracellulaire tau drug behandelingen na te meten. Deze protocollen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van drugs of andere verbindingen die gericht zijn op tau hyperphosphorylation of microtubulus bindend.

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

De tau aggregatie assay beschreven in dit manuscript bootst de verwachte kenmerken van in vivo misfolding tau en aggregatie.

In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening

Hier beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Leer in vitro aggregatietesten voor tau-eiwitonderzoek met hypergefosforyleerd tau. Deze methode vergelijkt aggregatiekinetiek en helpt bij het begrijpen van de ziekte van Alzheimer.

In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne

Meer video's verkennen