In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne
2 januari 2015
Ongemodificeerde en hypergefosforyleerd tau-eiwitten werden twee in vitro aggregatie-assays om de hyperfosforylering afhankelijke snelle aggregatie kinetiek onthullen. Deze assays weg effenen voor toekomstige schermen voor verbindingen die de neiging van hypergefosforyleerde tau kan moduleren fibrillen die de progressie van de ziekte van Alzheimer ten grondslag vormen.
Het algemene doel van deze procedure is om de aggregatiekinetiek van ongewijzigde en hyperfosforyleren tau-eiwitsoorten te monitoren en te vergelijken. Dit wordt bereikt door eerst ongewijzigde en hyperfosforyleren tau-eiwitten te genereren door middel van het door ritsen ondersteunde katalysatorsysteem. De tweede stap is om de aggregatietests in te stellen om geschikt te zijn voor een van de twee verschillende instrumenten.
Het tau-aggregatieproces wordt gemonitord door de fluorescentie van twee verschillende thio. Flavine sterven, deof flavine S en deof flavine T. De laatste stap is om de aggregatiecurven te plotten en te vergelijken. Uiteindelijk worden de kinetische veranderingen van thioflavine fluorescentie door binding aan geaggregeerde TA-soorten gebruikt om de hyperfosforyleringsafhankelijke verhoging van tau-fibrilvorming in vitro te tonen.
Hallo. Welkom bij ons JOV-artikel. In vitro aggregatietests met hyperfosfo tau-eiwit. Mijn naam is Minko en de experimenten worden uitgevoerd en gedemonstreerd doorway.
En voor dit protocol, een redelijk verse aggregatiebuffer gemaakt binnen de afgelopen maand. Voeg vlak voor gebruik DIO drie etol toe aan één millimolair, ook vereist A gefilterde Theo Flavin thee of S-voorraadoplossing. Hein-voorraadoplossing, beide opslagbaar bij min 20 graden Celsius en handdoek eiwit opgeslagen bij min 80 graden Celsius.
Trek de handdoek op ijs en pas vervolgens de concentratie aan met behulp van de aggregatiebuffer zoals vereist voor consistentie. Draai het handdoek neer met aggregatiebuffer en 20.800 G gedurende 10 minuten van vier graden Celsius. Breng nu het supernatant over naar een andere buis en bewaar het op ijs tot het tijd is om de aggregatiereactie samen te stellen.
Stel de aggregatiemix in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes in. Volgens de tabel is 100 microliter voldoende voor één portie reactanten. Bereken het totale volume op basis van het aantal reacties en verhoog het met 10% om rekening te houden met pipetteringsfouten.
Peper in kan worden vervangen door raonzuur of aggregatiebuffer indien nodig. Meng de reacties door inversie en breng ze over naar 37 graden Celsius zonder vegetatie. Vul elke 24 uur de reacties aan met een aanvullende één millimolair DTT om een reducerende omgeving te garanderen voor het meten van fluorescentie.
Verwarm de spectra fluorimeter ongeveer 10 minuten op. Dit zal de consistentie van de metingen in de computersoftware verbeteren. Selecteer de real-time weergavemodus die te vinden is in het instrumentcontrolecentrum.
Stel de excitatiegolflengte in op 450 nanometer met de spleet op twee nanometer en stel de emissiegolflengte in op 510 nanometer met de spleet van vijf nanometer. Ga vervolgens terug naar het instrumentcontrolecentrum en kies constant golflengteanalyse. Druk op de toevoegen-toets in het bovenste frame om een set golflengten toe te voegen.
Stel de verwervingsparameters van de standaarddeviatie in op één en het maximumaantal pogingen op drie. Klik vervolgens op toevoegen. Klik vervolgens op gaan om het gegevensweergavevenster te openen.
Klik nu in het gegevensweergavevenster op start act om het nieuwe voorbeelddialoogvenster te openen en kies onbekend voor voorbeeldtype. Bereid vervolgens de reacties voor om metingen te doen tot elke 100 microliter bij 98 microliter aggregatiebuffer en twee microliter drie millimolair theof flavine S of T. Pipetteer het mengsel meerdere keren om een goede menging te garanderen.
Breng alle 200 microliter van één mengsel over naar een FA drie qve en laad het in positie. Druk vervolgens op run om de fluorescentiegegevens te verzamelen. Nadat de oplossing uit de vete is verwijderd, spoel het drie keer met gedistilleerd water en droog het in een luchtstroom. Deze test omvat de fluorescerende kleurstof in de aion-reactie, die continue metingen mogelijk maakt en beter kan worden gedaan met een automatische mat-well plate reader.
Een reguliere parameter is ook werkt beperkt door de snelheid van handmatige bediening. Stel de aggregatiemix in een 96-welspachtige zwarte plaat in. Met 360 microliter een welspaaltjesvolume is 200 microliter voldoende voor elke tijdspuntmeting.
Meng elke reactieput met pipetten. Bewaar de 96-welspaalplaat bij 37 graden Celsius en voeg elke 24 uur een aanvullende één millimolair DTT toe om een reducerende omgeving bij elk tijdstip te garanderen. Zet voor een meting de multi-modus microplate reader en de computer ten minste 10 minuten van tevoren in de computersoftware aan.
Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en selecteer de fluorescentie-intensiteitsmodus. Stel vervolgens de excitatiegolflengte in op 450 nanometer en de emissiegolflengte op vijf en 10 nanometer. Plaats de 96-welspaalplaat in de lade en druk op de leestoets.
Na het nemen van metingen, breng de plaat onmiddellijk terug naar de incubator voordat u de gegevens analyseert, kan de continuemodustest worden uitgevoerd met behulp van een compacte spectrofotometer voor deze test. Stel de aggregatiemix in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes in. 200 microliterreacties zijn voldoende om een tijdstip te meten.
Keer de buisjes om om te mengen. Stel de reacties in bij 37 graden Celsius of kamertemperatuur en voeg elke 24 uur een aanvullende één millimolair DTT toe om metingen te doen. Stel de urometer en software in zoals voor de no die terminal test is gedaan.
Breng het gehele mengsel over naar een vet en plaats het in de steekhouder in de steekcompartimente en sluit het deksel. Druk op run om de fluorescentiegegevens te verzamelen op de juiste tijdsintervallen. Als dit interval kort is, zoals 30 of 60 seconden, is het oké om de Q vet in de machine te laten staan tussen metingen tot het laatste tijdstip is bereikt.
Breng de reactie van de vete terug naar zijn steekbuis en breng de buis terug naar de incubator Wanneer voltooid. Leun de vete zoals eerder geïnstrueerd met behulp van recombinant tau en P tal. Twee verschillende protocollen werden vastgesteld om de aggregatiekinetiek van tau en p tal te vergelijken, gebruikmakend van de ster
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de aggregatiekinetiek van ongemodificeerde en hypergefosforyleerde tau-eiwitten met behulp van in vitro assays. De bevindingen benadrukken de hyperfosforyleringsafhankelijke toename van tau-fibrillatie, wat van groot belang is voor het begrijpen van de progressie van de ziekte van Alzheimer.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Alzheimeronderzoek
Achtergrond
- Tau-eiwitten zijn cruciaal voor de stabilisatie van microtubuli in neuronen.
- Hyperfosforylering van tau is geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten.
- Het begrijpen van tau-aggregatie is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- In vitro assays kunnen inzicht bieden in de kinetiek van tau-aggregatie.
Doel van de studie
- Om de aggregatiekinetiek van ongemodificeerde en hypergefosforyleerde tau-eiwitten te vergelijken.
- Om een methode vast te stellen voor het screenen van verbindingen die de tau-aggregatie kunnen beïnvloeden.
- Om de rol van hyperfosforylering bij tau-fibrillatie te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Generatie van ongewijzigde en hypergefosforyleerde tau-eiwitten met behulp van een zippers-ondersteund katalysatorsysteem.
- Opzetten van aggregatie-assays die geschikt zijn voor verschillende instrumenten.
- Monitoren van tau-aggregatie met behulp van fluorescentie van thioflavine-kleurstoffen.
- Het uitzetten en vergelijken van aggregatiecurves om kinetische veranderingen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Hypergefosforyleerd tau vertoont een snellere aggregatiekinetiek in vergelijking met ongewijzigd tau.
- Fluorescentiemetingen correleren met de fibrillatiesnelheden van tau.
- De studie biedt een kader voor toekomstige screening van tau-modulerende verbindingen.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ziekte van Alzheimer.
Conclusies
- Hyperfosforylering versterkt de aggregatiekinetiek van tau aanzienlijk.
- In vitro-assays zijn effectief voor het bestuderen van het gedrag van tau-eiwitten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische interventies te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze assay maakt directe evaluatie mogelijk van de aggregatiekinetiek van hypergefosforyleerd tau, een belangrijke pathologische drijfveer bij de ziekte van Alzheimer en gerelateerde tauopathieën. Door gebruik te maken van ziekterelevant, posttranslationeel gemodificeerd tau, verhoogt de methode het vertrouwen in de targetvalidatie en ondersteunt deze het vroegtijdig minimaliseren van risico's bij therapeutische hypothesen. Het biedt een schaalbaar, kwantitatief platform voor het screenen van verbindingen die tau-fibrillatie moduleren, wat aansluit bij preklinische workflows voor target engagement en lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat hyperfosforylering pathogene tau-aggregatie aanstuurt.
- Operationele waarde: Maakt een zij-aan-zij vergelijking van gemodificeerde en ongemodificeerde tau mogelijk om fosforyleringsafhankelijke effecten te isoleren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in het target door een gedefinieerde moleculaire modificatie te koppelen aan meetbare fibrillogenese.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van thioflavine S- en T-fluorescentie om aggregatiekinetiek in real-time kwantitatief te monitoren.
- Operationele waarde: Compatibel met microplate-lezers en spectrofotometers, wat schaalbare en reproduceerbare metingen mogelijk maakt.
- Klaar voor assay: Ondersteunt high-throughput adaptatie voor screening van verbindingenbibliotheken tegen hypergefosforyleerd tau.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van recombinant hypergefosforyleerd tau om ziekterelevante proteïneconformaties te modelleren.
- Preklinische relevantie: Biedt een mechanistische readout voor target engagement in programma's voor neurodegeneratie.
- Risicobeperking: Maakt vroege beoordeling van de effecten van verbindingen op tau-aggregatie mogelijk vóór cellulair of in vivo testen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het vroege stadium van het ontdekkingscontinuüm, waarbij targetvalidatie wordt ondersteund door mechanistische risicoreductie en hit-identificatie in screeningscascades wordt mogelijk gemaakt. De kwantitatieve output ondersteunt go/no-go-beslissingen op basis van targetspecifieke biochemische activiteit.
- Discovery Biology: Test de hypothese dat hyperfosforylering tau-fibrillatie versterkt, een kernmechanisme in de pathogenese van tauopathie.
- Screening: Genereert dosis-responsieve, kinetische gegevens die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van verbindingen op aggregatiesnelheden.
- Analytics: Produceert op fluorescentie gebaseerde aggregatiecurven waarmee de lag-tijd, groeisnelheid en plateauwaarden kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de modulatie van biochemische targets met ziekterelateerde eiwitpathologie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar biochemisch assayplatform voor tau-gerichte programma's over meerdere targets en modaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de impact van tau-hyperfosforylering op aggregatie te isoleren.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde reagensbereiding en instrumentinstellingen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdstippen.
- Strategische waarde: Verbetert de voorspelling van de effectiviteit van targetmodulatie, waardoor het risico op falen in latere preklinische fasen wordt verkleind.
- Impact op portfolio: Maakt datagestuurde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van targetspecifieke biochemische activiteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitbehandeling, fluorescentiespectroscopie en het ontwerp van aggregatie-assays.
- Afhankelijk van toegang tot fluorimeters of microplate-readers met configureerbare excitatie-/emissie-instellingen.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van reagentia, inclusief verse aggregatiebuffer en DTT-suppletie.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in het aggregatiegedrag van eiwitten tussen batches en opslagcondities.
- Beperkt tot in vitro systemen; brengt geen mechanismen van cellulaire klaring, seeding of neurotoxiciteit in kaart.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparations
2:14
Terminal Assay with No Dye
4:44
Continual Mode Assay Using a Plate Reader With Dye
6:14
Continual Mode Assay Using a Compact Spectrofluorometer With Dye
7:33
Results: Tau Aggregation Assayed by Different Modes and Instruments
8:34
Conclusion
