Name: Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Ontdek de FUEL-techniek voor fluorescentieonderzoek met bioluminescente bacteriën en luminescente nanopartikels. Deze methode genereert rode fotonen en biedt nieuwe mogelijkheden voor bioluminescentiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag hun dankbaarheid voor financiële ondersteuning uit het Pasteur Stichting van New York uit te breiden (JD, CS, CS), de EU-FP7 programma &quot;Automation&quot; (SLS), het Institut Carnot Programma 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) en Project IMNOS (RT, SLS), de Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), de European Masters in Molecular Imaging (IT), het programma Regio Ile de France MODEXA (SLS), SESAM (SLS) en DimMalInf (SLS, RT), de ANR Programma Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Sante: Frankrijk LifebioImaging (FLI) Frankrijk Life Imaging (RT, SLS), Frankrijk Bioimaging (JD, SLS) en de Institut Pasteur, Parijs. Verder zou de auteurs willen bedanken, Jose Bengoechea en Herbert Schweizer voor reagentia. Verder zou De auteurs willen Cindy Fevre die de antilichamen gegenereerd bedanken.

1. Reagentia <ol><li> Aankoop of lichtgevende bacteriën en passende cultuur media zoals gewijzigd Escherichia coli uiting van de lux ABCDE 21 ontwikkelen, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Bereid fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) en kweekmedia oplossingen volgens standaard recepten. E. coli en K. pneumoniae werden gekweekt in Luria Bertani (LB) bij 37 ° C en V. fischeri en Photobacterium sp in LB aangevuld met 0,5 M NaCl bij 22 ° C. </li><li> Aankoop of verkrijgen fluorescente probes zoals Q-tracker 705 (40 nm diameter, aangeduid als QD705), Q-tracker 800 (40 nm diameter, aangeduid als QD800), fluorescent (40 nm diameter) en niet fluorescerende polystyreen microsferen ( 48 nm diameter), en conventionele fluorescerende kleurstoffen. </li><li> Bereid de benodigde reagentia voor bacteriële etikettering. </li><li> Zorgen voor toegang totgeheel dier bioluminescentie imager, zoals een IVIS Spectrum, dat in staat detectiesignaal onder uiteenlopende emissiegolflengten en blootstellingstijden. Een plaat lezer kan bioluminescentie metingen voldoende voor de meeste van de hier beschreven experimenten. </li></ol> 2. Basis Recapitulatie van FUEL <ol><li> Uitgaande van individuele kolonies op standaard cultuur platen, beginnen &#39;s nachts culturen van lichtgevende bacteriën. Hier V. fischeri werden gebruikt. </li><li> De dag van experimenteren, initiëren verse subculturen en hen in staat stellen om de vooruitgang tot een OD 600 van 1-1,5 wordt bereikt. Om vergelijkbare resultaten te produceren is het het beste om bacteriën te gebruiken in een gelijkaardige groei staten waarin zij produceren intense signalen. Dit kan worden gewaarborgd door het houden van de OD 600 constant. </li><li> Combineer fracties van 100 pi van elk met 5 pl QD705 of fysiologische zoutoplossing (PS), en vervolgens aan 895 ul van PS in Standard spectroscopische cuvetten. Plaats de gevulde cuvetten in de IVIS Spectrum en neem de metingen onder de juiste filter sets. Hier werd de emissie filter 710-730 nm gebruikt. </li></ol> 3. FUEL over verschillende afstanden <ol><li> Vul twee kleiner volume (1 ml) kunststof fotometrische cuvetten met ofwel 50 pl QD705 of 97,2 ul van niet-fluorescerende 48 nm polystyreen microbolletjes in een totaal volume van 1 ml PS. Hierdoor dergelijke vaste oppervlak per totaal volume tussen de twee entiteiten. </li><li> Bereid een lichtbron cuvette door bekisten een derde cuvet met standaard zwarte tape of ander ondoorzichtig materiaal kunnen blokkeren licht. Bereiden voorzichtig twee identieke optische vensters aan weerszijden van de cuvette. </li><li> Plaats de eerder gevulde cuvetten direct op beide zijden van de lichtbron cuvet. Voeg 1 ml van V. fischeri of andere cultuur (dwz lichtgevende E. coli of Photobacterium sp) van een frisse subcultuur in de lichtbron cuvette en bedek het met een ondoorzichtig materiaal, zoals zwart papier om geen licht vervuiling te verminderen. </li><li> De interne drie cuvetten onder de corresponderende emissie filters zoals het totale licht en 710-730 nm emissie filters met belichtingstijden van 10, 30 en 30 seconden respectievelijk. </li><li> Herpositioneren zowel externe cuvetten bij equivalente verdere afstanden van de centrale cuvette, en dan weer te visualiseren. Herhaal dit totdat een definitieve face-to-face (centraal gereduceerd volume cuvette) afstand van 3 cm is bereikt. Bij elke stap, een fluorescentiebeeld (450-480 nm excitatie, 710-730 nm emissie) aan de QD705 locatie valideren verwerven. </li></ol> 4. Onderzoek naar potentiële brandstofbesparing Pairs <ol><li> Vul twee gereduceerd volume cuvetten met 1 ml oplossingen die hetzij een fluorofoor of een fluorescente nanodeeltjes plaats in een en PS en PS met niet-fluorescerende nanodeeltjes als de negatieve controle in de andere. In the werk toonde hier diverse potentiële handel verkrijgbare brandstof fluoroforen en fluorescente nanodeeltjes onderzocht zoals aangegeven in tabel 1. </li><li> Voeg een 1 ml van verse V. fischeri of andere lichtgevende bacteriën een geblindeerde derde cuvette met twee fysiek gelijke optische vensters aan weerszijden. Bedek de cuvet met een ondoorzichtige stof, zoals een stukje zwart papier. </li><li> Bij een korte maar gelijke afstand plaats de twee verlaagde volume cuvetten aan weerszijden van de verduisterde cuvette en visualiseren onder de juiste filters. Hier afstand 0,7 cm gebruikt. Herhaal dit met de andere fluoroforen. </li></ol> 5. Gerichte FUEL <ol><li> Bereid gebiotinyleerde antilichamen die specifiek zijn voor de lichtgevende bacteriën. Bijvoorbeeld, hier primaire antilichamen specifiek K. pneumoniae (α-Kp) werden gebiotinyleerd met behulp van een oplossing die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine. </li&gt; <li> Overtollig reagens uit de antilichamen middels ontzouten kolommen onder centrifugeren (1500 x g) gedurende 2 minuten. </li><li> Gebruik een standaard Bradford assay de eiwitconcentratie te bepalen en bepalen de mate van biotinylering antilichaam door HABA assay. </li><li> Haal de α-Kp-biot gebiotinyleerd antilichaam (Ab) batches door menging van 100 ui (10 mM, opgelost in 1 x PBS) met 40 ul α-Kp-antilichaam, hetgeen uiteindelijk een substitutiegraad van 16 biotine residuen per Ab en een definitieve eiwitconcentratie van 10 mg ml-1. </li><li> Het gebruik van meerdere nachtelijke repliceren culturen, richten de gewassen bacteriën met voornoemde antilichamen na de geschikte protocol. <ol><li> In het bijzonder, was het K. pneumoniae in 1x PBS en resuspendeer in 1 x PBS tot een buitendiameter van 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 -1 OD). </li><li> Voor elke replicaat, incubeer 100 pl PBS, α -Kp antilichamen (10 pl α-Kp-biotB of 10 ul PBS controle) en 100 ul cellen gedurende 90 min bij 30 ° C. Was de cellen drie keer in 1x PBS en resuspendeer in 196 pi PBS. </li></ol></li><li> Label de cellen met de QD705 streptavidineconjugaat en verdeel ze in twee gelijke volumes. </li><li> Was een oplossing drie keer en dan resuspendeer het in het juiste volume. </li><li> Verdeel 100 pi van de gewassen en ongewassen oplossingen in afzonderlijke putjes van een zwarte plaat met 96 putjes. Meet de resulterende luminescentie onder de Total Light, 490-510 nm en 710-730 nm filters. Fluorofoor concentratie kan worden bepaald middels 450-480 nm excitatie en 710-730 nm emissie. </li></ol>

<ol><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li>
<li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+progress+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%3A+Official+Journal+of+the+Society+for+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li>
<li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262(2012).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li>
<li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li>
<li>So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li>
<li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li>
<li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence%3A+Broadening+the+scope+of+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li>
<li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria%3A+general+cell+morphology+and+envelope+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li>
<li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+gel%3A+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. JD, SB, KLR en SLS bijgedragen aan Europees octrooi EP10290158.4 en World Intellectual Property Organization octrooiaanvrage WO/2011/117847.

De fundamentele demonstratie van FUEL kan eenvoudig worden bereikt door het mengen van lichtgevende bacteriën met fluorescerende nanodeeltjes of QD&#39;s. De twee entiteiten fysiek gescheiden zijn en blijven zonder enige efficiënte RET afstand. Moeilijker is de brandstof signaal optimalisatie zowel in vitro als in vivo. Onder in vitro omstandigheden, zowel met als zonder optische absorptie aanwezig, gewoonlijk de toevoeging van overmaat fluorofoor zal volstaan ​​om de FUEL respons te maximaliseren. Bij hoge concentraties verschijnselen zoals statische of botsing quenching kan leiden tot een verlies van fluorescerend signaal. Het uitvoeren van een verdunningsreeks van onafhankelijk variëren van de concentratie van de luminescerende bron en de fluorofoor zal helpen om de gewenste concentraties te optimaliseren. De oprichting en optimalisatie van FUEL onder in vivo concentraties is veel moeilijker en moet van geval tot geval moeten worden aangepakt. Het kan moeilijk zijn om een ​​co creërenndition waar de fluorescerende entiteit kan optisch worden benaderd door de lichtgevende bron. Als zodanig, te beginnen met directe co-injecties van de twee groepen kan informatie met betrekking tot het succes van FUEL onder optimale omstandigheden. Standaard protocollen bestaan ​​voor het labelen van bacteriën en eukaryote cellen met fluorescerende entiteiten zoals de Alexa-serie en QD&#39;s. Vaak moet oppervlak functionalisering of activering met antilichamen, wat kan leiden tot ongewenste effecten zoals verminderde cellevensvatbaarheid of gewijzigde metabolische activiteit. Om dit te overwinnen, is het belangrijk om te bepalen van de optimale hoeveelheid antilichaam of activatie agens nodig die cellulaire minimaliseert verstoringen tegelijkertijd de fluorescente labeling. Het gebruik van QDs is voordelig vanwege hun kenmerkende brede excitatiespectra, smal en afstembare emissiespectra en de mogelijkheid van een grote Stokes verschuiving. Echter, QDs cytotoxisch en niet gewenst zijn in sommige gevallen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL is een verschijnsel dat in veel BRET experimenten 13 is en is toepasbaar op een verscheidenheid van luminescentie en fluorescerende bronnen. Tot nu toe werden de fotonen gevolg van BRANDSTOF als het product van niet-specifieke interacties of een ongelukkige achtergrondsignaal gevolg van slecht ontworpen BRET experimenten. Het is alleen met de aard van de experimenten hier laten zien dat we in staat waren om het nut van deze ongewenst signaal te identificeren. In de getoonde voorbeelden, de lichtgevende bacteriën fungeren als een diffuse excitatiebron staat tot het opwekken van een standaard fluorescente reactie van een grote verscheidenheid van fluorescente eenheden. Bovendien, als gevolg van de aanzienlijke werkafstand, is het veilig om te concluderen dat terwijl FUEL kan worden gebouwd zonder het optreden van Bret in het algemeen BRET kan niet worden waargenomen zonder een bijdrage van FUEL. Belangrijk is door het ontbreken van een targeting vereiste brandstof worden gebruikt om de ruimtelijke kloof tussen BRET en Conventional hele dier beeldvormende technieken.

De genetische modificatie van organismen, zoals virussen 1, 2, 3 bacteriën of kleine zoogdieren 4 ofwel induceren of constitutief bioluminescentie, zeer succesvol en breed aangetoond 5-7. Bioluminescentie is een in vivo chemiluminescente reacties met natuurlijk voorkomende reagentia, heeft het voordeel om licht te produceren zonder de noodzaak van een externe lichtbron. Als zodanig is bioluminescentie beeldvorming geen last van de gemeenschappelijke nadelen van auto-en niet-specifiek signaal gevonden van fluorescentie beeldvorming 8. Bijgevolg bioluminescentie een belangrijke signaal-ruisverhouding aangezien elke gedetecteerde signaal uitsluitend afkomstig van de beoogde bron. Hoewel veel modellen de lux operon van Photorhabdus luminescens (emissiemaximum gecentreerd tussen 480 en 490 nm) in vitro en in vivo toepassingen 9 uitgebuit, zijn gebruik in kleine MammALS is problematisch vanwege de aard van de beeldvorming voorwaarden; de doordringende bestaan ​​van optische absorptiemiddelen, zoals hemoglobine en verstrooiing middelen, zoals weefsel en bot, sterk beïnvloeden blauw naar geel golflengten 3. De expressie van een aangelegde vuurvliegluciferase (maximale emissie bij 617nm) is recent ontwikkeld en opgenomen, het verstrekken van een hulpmiddel dat sterk overwint optische absorptie 10, maar is nog steeds onderworpen aan verstrooiingseffecten. In reactie daarop zijn er meerdere pogingen tot rood-verschuiving van het uitgezonden signaal in de gewenste optische raam van 650-900 nm, een regio geminimaliseerd absorptie en verstrooiing, met behulp van bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) 11-13 geweest. Als een instrument om signaaldetectie verbeteren, BRET, die een bioluminescerend bron gebruikt als de donor en een toegevoegde fluorofoor als de acceptor, heeft gevonden beperkt succes. Als een rudimentaire voorbeeld van dit fenomeen, &quot;self-lichtdoorlatende quantum dots4, (SIQDs) 14 bestaan ​​uit gemodificeerde Renilla reniformis luciferasen gebonden aan het uitwendige polymeer-lysine layer van commercieel beschikbare quantum dots (QD). Na substraat Bovendien moeten de bioluminescente reactie induceert-emissie van de QDs, genereren een aanzienlijke productie van rode fotonen. Echter, deze SIQDs toepasbaarheid beperkt tot in vivo visualisatie van fysiologisch relevante gebeurtenissen. Deze beperkte toepasbaarheid waarschijnlijk vanwege de moeilijkheid die de dubbele sonde naar het orgaan, cel of gen van belang, aangezien de SIQDs niet genetisch gecodeerd kunnen worden en daarom zou een tweede wijziging van de polymeermantel vereist. De toepassing ervan beter, alternatief SIQDs, waarbij de luciferasen rechtstreeks zijn gebonden aan de luminescerende kern, zijn onlangs toegepast 15. Voortbouwend op de SIQD concept werd een meer toepasselijke BRET systeem bereikt door het aanbrengen van Cypridina luciferase een indocyanine kleurstof 16, die specifiek kunnen richten op tumoren in muizen terwijl de productie een aanzienlijke roodverschuiving van 460 nm tot 675 nm. Om niet-stralende energieoverdracht ondergaan, BRET volgt dezelfde primaire beperkingen als de tl-tegenhanger: er moet een sterke spectrale overlap tussen de donor emissie en de acceptor excitatiespectra en de werkafstand tussen de twee groepen zijn, moeten in de orde van de Förster radius (5-14 nm afhankelijk van de donor-acceptor paren, met een effectieve maximale afstand tweemaal de Förster radius 17). Deze afstand afhankelijkheid sterk beperkt de typen gebeurtenissen die kunnen worden waargenomen met behulp BRET als middel om detectie te verbeteren. Onlangs werd een nieuwe benadering geïdentificeerd en aangetoond onder zowel in vitro als in vivo omstandigheden. Voortbouwend op het fundament van BRET, Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) 18, 19 </sup&gt; vereist ook een sterke spectrale overlap tussen de luminescerende en fluorescerende componenten. In tegenstelling BRET, FUEL is een volledig radiatieve proces waarbij het uitgezonden foton uit het luminescerende bron wordt geabsorbeerd door een optisch toegankelijke fluorofoor, die vervolgens zendt een rood-verschoven foton volgens de fluorofoor quantum opbrengst. Verwant aan BRET Deze benadering kan ook worden gebruikt om de beperkingen van beeldvorming in aanwezigheid van optisch absorberende overwinnen. De verkregen rode verschuiving geeft een algemene toename en specificiteit van het gedetecteerde signaal door een afname in demping en een vermindering van optische verstrooiing effecten. FUEL is gemeld optreden tussen bioluminescentie Escherichia coli uiting van de lux operon en QD&#39;s 18, 19. Terwijl experimenteel vergelijkbaar met de SIQDs, een fundamenteel verschil bestaat: brandstof, is het niet noodzakelijk dat de luminescerende bron fysiek gebonden aan de fluorofoor, waardoor fo zijnr genetische codering van de luminescerende probe. Door de succesvolle detectie van FUEL tussen lichtgevende bacteriën en QD, is het mogelijk dat deze techniek kan worden toegepast op zowel oppervlakkige (huid) en diepe weefsels (long, lever) infecties zoals Staphylococcus aureus en Klebsiellia pneumoniae. Sinds het verslag van de experimentele betekenis heeft FUEL ontwikkeld tot een robuust wiskundig model 20 dat kan worden gebruikt om aanvaardbare luminescentie en fluorescentie paren voorspellen bevatten en de toepassingen uitgebreid met gebruik omvatten identificatie van fotofysische eigenschappen zoals quantum opbrengst. We beschrijven hieronder een aantal van de basistechnieken van FUEL. Ten eerste, laten we zien bewijs voor dit fenomeen dan zowel de korte (micrometer) en lange (cm) werkafstanden, die fundamenteel onderscheidt brandstof uit BRET. Ten tweede, bij eventuele FUEL paren vergroten zo door behandeling van een breed scala aan fluoroforen en fluorescente nanodeeltjes. Third, worden FUEL toepassingen onderzocht door het vergelijken van gerichte en ongerichte FUEL paren.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli die het luxABCDE operon tot expressie brengt&nbsp;</td><td></td><td></td><td>vriendelijk ter beschikking gesteld door Jos&eacute; A. Bengoechea met toestemming van Herbert P. Schweizer</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 is een serotype K2-referentiestam</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>standaard groeimedium</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>Life Sciences</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Life Sciences</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Life Sciences</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Life Sciences</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Life Sciences</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Life Sciences</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Niet-fluorescerende microspheres</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Roze microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8887</td><td>40 nm diameter</td></tr><tr><td>Gele microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8888</td><td>40 nm diameter</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA assay kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

een stap verder bret: fluorescentie door geconsolideerd opwinding van luminescentie (fuel)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) is een stralings excitatie-emissie proces dat verhoogde signaal en contrast verbetering produceert in vitro en in vivo. BRANDSTOF deelt veel van dezelfde uitgangspunten als Bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET), maar sterk verschilt aanvaardbare werkafstand tussen de luminescerende bron en de fluorescerende entiteit. Terwijl BRET effectief beperkt tot maximaal 2 maal de straal Förster, gewoonlijk minder dan 14 nm, kan FUEL optreden bij afstanden tot um of zelfs cm bij ontbreken van een optisch absorptiemiddel. Op het fundament en de toepasbaarheid van FUEL hier breiden we door de herziening van de relevante beginselen achter het fenomeen en demonstreren de compatibiliteit met een breed scala aan fluoroforen en fluorescerende nanodeeltjes. Verder is het nut van antilichaam gerichte FUEL onderzocht. De hier getoonde voorbeelden tonen aan dat brandstof kan worden gebruikt voor applnicatieorganisatie waar BRET niet mogelijk is, het vullen van de ruimtelijke leegte die bestaat tussen BRET en traditionele hele dier beeldvorming.

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de eenvoud van brandstof aan te tonen en de generatie van rode fotonen door radiatieve excitatie-emissiegebeurtenissen waar te nemen. Dit wordt bereikt door bioluminescente bacteriën en luminescente nanodeeltjes te combineren voor de productie van brandstof. Vervolgens wordt een bioluminescentie-plaatlezer gebruikt om de resulterende rode fotonen waar te nemen die voortkomen uit de brandstof; de resultaten tonen aan dat een aanzienlijke hoeveelheid rode fotonen kan worden geproduceerd wanneer de bioluminescente bacteriën en quantum dots in dezelfde oplossing worden gehouden.Op basis van de waargenomen toename in de flux van rode fotonen, reiken de implicaties van deze techniek tot het in twijfel trekken van het paradigma van NCE residentiële entry-transfer of Brett. Dit wordt vaak in de literatuur gerapporteerd. Start vanuit individuele kolonies op standaard cultuurplaten overnight-culturen van luminescente bacteriën.Hierbij werd gebruikgemaakt van Vibrio Fisher Eye op de dag van het experiment. Start verse subculturen en laat deze groeien tot een optische dichtheid of OD bij 600 nanometer van 1 tot 1,5 is bereikt. Gebruik bacteriën in vergelijkbare groeifasen waarin zij intense signalen produceren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.Combineer aliquota van 100 µL van elk met vijf µL van de fluorescerende probe, QD 7 0 5 of fysiologische zoutoplossing. Voeg het mengsel vervolgens toe aan 895 µL fysiologische zoutoplossing in standaard spectroscopische cuvetten. Plaats de gevulde cuvetten in een bioluminescentie-imager voor hele dieren en voer de metingen uit met de juiste filtersets.Hier werd het emissiefilter van 710 tot 730 nanometer gebruikt om metingen uit te voeren over verschillende afstanden. Vul twee plastic fotometrische cuvetten met een gereduceerd volume met ofwel 50 microliters QD 7 0 5 of 97,2 microliters niet-fluorescerende 48 nanometer polystyreen microsferen in een totaalvolume van één milliliter fysiologische zoutoplossing. Dit garandeert een vergelijkbaar vast oppervlak per totaalvolume tussen de twee entiteiten.Bereid een lichtbron qve voor door een derde qve te omwikkelen met standaard zwart plakband of een ander ondoorzichtig materiaal dat in staat is om licht te blokkeren. Maak zorgvuldig twee identieke optische vensters aan tegenovergestelde zijden van de vete. Voeg een aliquot van 1 mL Vibrio fii of een andere cultuur uit een verse subcultuur toe aan de lichtbron vete en bedek deze met een ondoorzichtig materiaal zoals zwart papier om eventuele lichtcontaminatie te verminderen.Plaats vervolgens de eerder gevulde cuvetten direct aan weerszijden van de lichtbron in de imager. Visualiseer de drie QD-cuvetten onder de juiste emissiefilters, zoals de filters voor totaal licht en voor emissie van 710 tot 730 nanometer, met belichtingstijden van respectievelijk 10, 30 en 30 seconden. Leg een fluorescentiebeeld vast bij een excitatie van 450 tot 480 nanometer en een emissie van 710 tot 730 nanometer om de locatie van QD 705 te valideren.Positioneer beide externe Q-vets op gelijke, grotere afstanden van de centrale Q-vet. Visualiseer vervolgens en leg een fluorescentiebeeld vast voordat dit proces wordt herhaald totdat een uiteindelijke onderlinge afstand van drie centimeter is bereikt. Vul twee cuvetten met gereduceerd volume: één met één milliliter oplossing houdend fluoro four of een fluorescente nanodeeltje van belang, en de andere met fysiologisch zout met niet-fluorescente nanodeeltjes als negatieve controle.Voeg een aliquot van 1 mL verse Vibrio FII of andere luminescente bacteriën toe aan een zwart gemaakte Q-cuvet die twee fysiek gelijke optische vensters aan tegenovergestelde zijden bevat; bedek de cuvet met een ondoorzichtige substantie, zoals een stuk zwart papier, op een korte maar gelijke afstand. Plaats de twee cuvetten met gereduceerd volume aan weerszijden van de zwart gemaakte Q-cuvet en visualiseer onder de juiste filters; hier werd een afstand van 0,7 cm gebruikt. Herhaal dit met de overige fluorescentie-stappen van de QD 705 bij de bacteriën.Er wordt een aanzienlijke toename in het aantal rode fotonen waargenomen in vergelijking met alleen de bacteriën. Controlebrandstof kan over grote afstanden voorkomen in de afwezigheid van enige absorber. Deze afstandsafhankelijkheid kan worden gekarakteriseerd door de omgekeerde kwadratenwet.Voor puntsources. De targeting van de flora fours naar het bacteriële membraan lijkt weinig tot geen effect te hebben op de totale hoeveelheid gegenereerd brandstofsignaal. In deze context blijft de getargete brandstof behouden, zelfs na meerdere wasstappen.Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe brandstof in meerdere modaliteiten kan worden gereconstitueerd als middel om rode fotonen te genereren vanuit radiatieve excitatie-emissiegebeurtenissen.

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We bespreken de bouw en exploitatie van een complex niet-lineaire optische systeem dat ultrasnelle all-optisch schakelen gebruikt om te isoleren Raman van fluorescentie-signalen. Met behulp van dit systeem zijn wij in staat om succesvol scheiden Raman en fluorescentie-signalen gebruik te maken van puls energie en de gemiddelde krachten die blijven biologisch veilig.

Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie

De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

We beschrijven hier een verbeterde werkwijze Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) waarin we introduceren protease splitsingsplaats tussen de donor en acceptor fluorofoor sites. Deze modificatie kunnen wij specifieke LRET signalen die door membraaneiwitten plaats, waardoor de studie van membraaneiwitten zonder eiwitzuivering verkrijgen.

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Dit protocol beschrijft een nieuwe intraoperatieve beeldvormingstechniek die gebruik maakt van een rutheniumcomplex als bron van chemiluminescente lichtemissie, waardoor hoge signaal-ruisverhoudingen worden geproduceerd tijdens in vivo beeldvorming. Intraoperatieve beeldvorming is een groeiend veld dat de manier waarop chirurgische ingrepen worden uitgevoerd, zou kunnen revolutioneren.

Een nieuwe techniek voor het genereren en Observing Chemiluminescence in een biologische instelling

Dit artikel biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van volledig gecorrigeerde nauwkeurige FRET-metingen op individuele, vrij verspreidende biomoleculen met behulp van de open-source, goedkope smfBox, van inschakelen, via uitlijning en scherpstellen, tot gegevensverzameling en -analyse.

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

Er wordt een protocol verstrekt voor het opzetten van een standaard confocale laserscanmicroscoop voor in vivo Förster resonantie energieoverdrachtsmetingen, gevolgd door gegevensevaluatie.

Förster Resonantie EnergieOverdracht Metingen in Levende Plantencellen

Dit protocol beschrijft een op BRET gebaseerde test voor het meten van de interacties van het CRAF-kinase met 14-3-3-eiwitten in levende cellen. Het protocol schetst stappen voor het voorbereiden van de cellen, het uitlezen van BRET-emissies en gegevensanalyse. Er wordt ook een voorbeeldresultaat gepresenteerd met identificatie van de juiste controles en probleemoplossing voor testoptimalisatie.

Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen

Ontdek de FUEL-techniek voor fluorescentieonderzoek met bioluminescente bacteriën en luminescente nanopartikels. Deze methode genereert rode fotonen en biedt nieuwe mogelijkheden voor bioluminescentiestudies.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Meer video's verkennen