Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de eenvoud van brandstof aan te tonen en de generatie van rode fotonen door radiatieve excitatie-emissiegebeurtenissen waar te nemen. Dit wordt bereikt door bioluminescente bacteriën en luminescente nanodeeltjes te combineren voor de productie van brandstof. Vervolgens wordt een bioluminescentie-plaatlezer gebruikt om de resulterende rode fotonen waar te nemen die voortkomen uit de brandstof; de resultaten tonen aan dat een aanzienlijke hoeveelheid rode fotonen kan worden geproduceerd wanneer de bioluminescente bacteriën en quantum dots in dezelfde oplossing worden gehouden.

Op basis van de waargenomen toename in de flux van rode fotonen, reiken de implicaties van deze techniek tot het in twijfel trekken van het paradigma van NCE residentiële entry-transfer of Brett. Dit wordt vaak in de literatuur gerapporteerd. Start vanuit individuele kolonies op standaard cultuurplaten overnight-culturen van luminescente bacteriën.

Hierbij werd gebruikgemaakt van Vibrio Fisher Eye op de dag van het experiment. Start verse subculturen en laat deze groeien tot een optische dichtheid of OD bij 600 nanometer van 1 tot 1,5 is bereikt. Gebruik bacteriën in vergelijkbare groeifasen waarin zij intense signalen produceren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

Combineer aliquota van 100 µL van elk met vijf µL van de fluorescerende probe, QD 7 0 5 of fysiologische zoutoplossing. Voeg het mengsel vervolgens toe aan 895 µL fysiologische zoutoplossing in standaard spectroscopische cuvetten. Plaats de gevulde cuvetten in een bioluminescentie-imager voor hele dieren en voer de metingen uit met de juiste filtersets.

Hier werd het emissiefilter van 710 tot 730 nanometer gebruikt om metingen uit te voeren over verschillende afstanden. Vul twee plastic fotometrische cuvetten met een gereduceerd volume met ofwel 50 microliters QD 7 0 5 of 97,2 microliters niet-fluorescerende 48 nanometer polystyreen microsferen in een totaalvolume van één milliliter fysiologische zoutoplossing. Dit garandeert een vergelijkbaar vast oppervlak per totaalvolume tussen de twee entiteiten.

Bereid een lichtbron qve voor door een derde qve te omwikkelen met standaard zwart plakband of een ander ondoorzichtig materiaal dat in staat is om licht te blokkeren. Maak zorgvuldig twee identieke optische vensters aan tegenovergestelde zijden van de vete. Voeg een aliquot van 1 mL Vibrio fii of een andere cultuur uit een verse subcultuur toe aan de lichtbron vete en bedek deze met een ondoorzichtig materiaal zoals zwart papier om eventuele lichtcontaminatie te verminderen.

Plaats vervolgens de eerder gevulde cuvetten direct aan weerszijden van de lichtbron in de imager. Visualiseer de drie QD-cuvetten onder de juiste emissiefilters, zoals de filters voor totaal licht en voor emissie van 710 tot 730 nanometer, met belichtingstijden van respectievelijk 10, 30 en 30 seconden. Leg een fluorescentiebeeld vast bij een excitatie van 450 tot 480 nanometer en een emissie van 710 tot 730 nanometer om de locatie van QD 705 te valideren.

Positioneer beide externe Q-vets op gelijke, grotere afstanden van de centrale Q-vet. Visualiseer vervolgens en leg een fluorescentiebeeld vast voordat dit proces wordt herhaald totdat een uiteindelijke onderlinge afstand van drie centimeter is bereikt. Vul twee cuvetten met gereduceerd volume: één met één milliliter oplossing houdend fluoro four of een fluorescente nanodeeltje van belang, en de andere met fysiologisch zout met niet-fluorescente nanodeeltjes als negatieve controle.

Voeg een aliquot van 1 mL verse Vibrio FII of andere luminescente bacteriën toe aan een zwart gemaakte Q-cuvet die twee fysiek gelijke optische vensters aan tegenovergestelde zijden bevat; bedek de cuvet met een ondoorzichtige substantie, zoals een stuk zwart papier, op een korte maar gelijke afstand. Plaats de twee cuvetten met gereduceerd volume aan weerszijden van de zwart gemaakte Q-cuvet en visualiseer onder de juiste filters; hier werd een afstand van 0,7 cm gebruikt. Herhaal dit met de overige fluorescentie-stappen van de QD 705 bij de bacteriën.

Er wordt een aanzienlijke toename in het aantal rode fotonen waargenomen in vergelijking met alleen de bacteriën. Controlebrandstof kan over grote afstanden voorkomen in de afwezigheid van enige absorber. Deze afstandsafhankelijkheid kan worden gekarakteriseerd door de omgekeerde kwadratenwet.

Voor puntsources. De targeting van de flora fours naar het bacteriële membraan lijkt weinig tot geen effect te hebben op de totale hoeveelheid gegenereerd brandstofsignaal. In deze context blijft de getargete brandstof behouden, zelfs na meerdere wasstappen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe brandstof in meerdere modaliteiten kan worden gereconstitueerd als middel om rode fotonen te genereren vanuit radiatieve excitatie-emissiegebeurtenissen.