Name: Aip1p Dynamics worden gewijzigd door de R256H Mutatie in actine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer hoe Aip1p-dynamiek verandert door de R256H-mutatie in actine bij gist met behulp van totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult hoe mutaties het cytoskelet beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Peter Rubenstein voor nuttige discussie en technisch advies en David Pellman voor de originele PB1996 kloon. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de March of Dimes en de financiering van de Ride for the Kids.

1. Klonering in de PB1996 Plasmide <ol><li> Ontwerpen en bestellen DNA primers van een oligonucleotide productiebedrijf dat de doelsequentie flankeren en bevatten unieke restrictie sites in de gekozen basismotor plasmide. Opmerking: In dit geval primers werden ontworpen voor het 400 basenparen amplificeren einde de Aip1 de sequentie 5 &#39;. De Xhol restrictie plaats werd in de primer verwerkt ongeveer 20 bp voor de Aip1 sequentie en XmaI werd opgenomen ongeveer 20 bp na het doelwit Aip1 volgorde. Het plasmide gebruikt voor het klonen was PB1996, die een 3XGFP tag voor fluorescentie, een URA gen voor giststam selectie, en een ampicillineresistentiegen voor bacteriële selectie bevat. </li><li> Zuiver het genomisch DNA van een Ura-gist haploïde stam. Opmerking: Zie Figuur 1 voor een diagram van klonen. </li><li> Voer een standaard PCR-reactie met de twee primers en de gist genomisch DNA om de Aip1p gen amplificeren met de restrictieplaatsen aan beide end. Verteren van het PCR-product en de PB1996 plasmide met de restrictie-enzymen in afzonderlijke reacties per fabrikant aanbevolen protocollen. In dit geval Xmal en Xhol werden gebruikt met de bijbehorende buffer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voer een 0,8% agarose gel elektroforese om de gedigereerde DNA-fragmenten te scheiden. In een goed, laadt een lage DNA massa ladder en, in afzonderlijke putten, laadt u de hele reactie van elke spijsvertering. Laat de gel bij 100 volt gedurende 1 uur, totdat de kleurstof voorkant is aan het einde van de gel. Zichtbaar de gel een UV licht en zuiveren uit het segment dat overeenkomt met de eiwitsegment en gesneden plasmide. </li><li> Ligeren de verteerde Aip1 segment en PB1996 plasmide. Transformeer het product in DH5a cellen met protocollen van de fabrikant (10 pl DNA met 100 ul cellen gedurende 30 min op ijs, hitteschok bij 42 ° C gedurende 2 min, groeien in SOC-medium gedurende 2 uur bij 37 ° C) en plaat op kweekplaten dat het antibioticum Voor selectie, in dit geval LB +Amp platen. Selecteren en te groeien een kolonie in vloeibare cultuur. Zuiver het nieuw ontworpen plasmide. </li></ol> 2. Mutant giststam Generation <ol><li> Gebruik een haploïde giststam waarin de actine allel is verwijderd een mutante giststam bouwen. Opmerking: In dit geval, de stam was een gulle gift van Dr Peter Rubenstein (Universiteit van Iowa) en de constructie is beschreven door Cook et al. 20 Deze stam mist het chromosomale actine-gen en bevat een plasmide dat wildtype gist codeert. actine en uracil. </li><li> Gebruik de pRS plasmide coderend voor wild-type gist actine met een Trp + selectie als basis plasmide voor mutagenese 21. </li><li> Voer plaatsgerichte mutagenese de pRS plasmide de missense mutatie in actine ingenieur. <ol><li> Voor de R256H mutatie in actine, maken de primer 5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39; van de Arg 256 veranderen naar Zijn 256. Voer een standaard mutagenesePCR reactie met het plasmide uit stap 2.2. </li><li> Transformeer de mutant actine plasmide uit de PCR in DH5a cellen. Isoleer het plasmide-DNA sequentie en de actine-gen de mutatie controleren. </li></ol></li><li> Transformeer het plasmide dat codeert voor mutant gist actine in de haploïde giststam uit stap 2.1. </li><li> Cultuur de getransformeerde cellen op Trp-platen om te selecteren voor gist met de Trp + met mutant gist actine plasmide. </li><li> Selecteren op cellen die niet de originele plasmide dat wild type actine en uracil (in 2.1 beschreven) codeert door sub-kweken van cellen van de Trp-platen op platen die 5-fluororotinezuur (5-FOA) bevatten. 5-FOA wordt omgevormd tot de toxische vorm, 5-flurouracil, in yeas stammen die het functionele URA3-gen. De cellen die groeien na de stapsgewijze selectie zal alleen de mutant actine plasmide bevatten. </li><li> Zuiver het plasmide DNA van de nieuwe giststam. Sequence het plasmide te zorgen voor de mutante actine gen aanwezig is. Gebruik dit strainen in verdere studies. Dit proces wordt schematisch weergegeven in figuur 2. </li></ol> 3. Omzetting van het plasmide in gistcellen <ol><li> Verteren de Aip1p-GFP plasmide met een restrictie-enzym om de integratie mogelijk te maken in de gist chromosoom. OPMERKING: De beperking site moet worden buiten de sequentie blok dat de tl-tag, gen van belang, en de selectie marker bevat. In dit geval gebruikt 1 ui restrictie-enzym HpaI met 8 pi DNA en 1 pi van de begeleidende 10x buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Cultuur S. cerevisiae cellen (uit stap 2.5) dat geen uracil (Ura-stam) overnacht synthetiseren in 5 ml YPD medium (1% gistextract, 2% pepton en 2% dextrose) op een wiel bij 30 ° C zijn Verminderde snelheid 1 ml van de cellen gedurende 5 min bij 1000 x g. </li><li> Maak PLAAT mengsel. Voeg 10XTE door toevoeging van 5 ml van 1 M Tris pH 7,5 en 2 ml van 250 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) aan 43 ml van DDH 2 O. 0 Voeg0,204 g lithium acetaat 20 ml 1XTE dan 8 g polyethyleenglycol (PEG) (MW ~ 3300) en filter steriliseren. </li><li> Schenk de supernatant van de cellen afgedraaid in stap 3.2 en resuspendeer de cellen in de resterende vloeistof. De gesuspendeerde cellen, voeg 2 ui 10 mg / ml zalm testes drager DNA. Voeg 10 ul van de gedigereerde plasmide DNA uit stap 3.1 en vortex. Voeg 0,5 ml van de plaat en vortex. Voeg 20 ul van 1 M DTT en vortex. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 6-8 uur bij 25 ° C. Heat shock de cellen in een waterbad bij 42 ° C gedurende 10 minuten. Plaat 100 pl cellen van de bodem van de microcentrifugebuis waar ze zijn uitgerold op een-Ura plaat. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen of totdat kolonies vormen. </li><li> Selecteer individuele kolonies en streak uit op een-Ura plaat. OPMERKING: Deze cellen bevatten het plasmide met de Aip1-GFP en Ura gen geïntegreerd in het chromosoom, waardoor de groei. Deze cellen worden vervolgens gebruikt microscopy. </li></ol> 4. Visualiseren van de Aip1p Eiwit Beweging Met behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie <ol><li> Kweek een kweek van de gistcellen met de opgenomen Aip1p-GFP YPD overnacht op een wiel bij 30 ° C. Subcultuur 1 ml van de kweek van een nacht over in 9 ml-Ura media. Kweek de cellen nog eens 3-4 uur op een schudinrichting bij 30 ° C zodat ze log groeifase. </li><li> Voeg 3 ul van cellen om een ​​glas microscoop glijbaan en voeg een dekglaasje. Laat de cellen om zich te vestigen op de dia gedurende 5 minuten. Plaats de dia in de beugel van het podium plaat. </li><li> Let op de Aip1p-GFP-eiwit met een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop (488 nm) met behulp van een olie-immersie 100X TIRF doelstelling en een digitale CCD-camera. Met SlideBook 5.0 software afbeeldingen voor 20 seconden verkrijgen met een snelheid van 5 beelden / sec (Onafhankelijke frames van verkregen beelden zijn weergegeven in figuur 2A). <ol><li> Te richten op de cellen, geopend SlideBook 5.0-software en klik op de knop Focus Venster in de werkbalk om toegang te krijgen tot de focus controles. Selecteer het tabblad Bereik en selecteer de 100X-TIRF doelstelling. Zet de lamp aan en zet de lamp bar tot 15%. Verander de Bin instelling in 2 x 2. Filter Wissel naar helder veld. </li><li> Op de microscoop, gebruik het scherpstellen draaiknop om de cellen in beeld te brengen zoals te zien op het computerscherm. </li><li> Met behulp van de controles binnen de Focus venster, zet de lamp uit, verander de filter te leven, en klik op de knop TIRFM. </li><li> Op de TIRFM hulplicht aan de rechter kant poort van de microscoop, draait u de laser emissie naar On. </li><li> Selecteer het tabblad Stroom binnen de Focus venster, vinkt u het vakje naast de opname te starten en klik vervolgens op helder veld knop. </li><li> Op de TIRFM hulplicht, draai de micrometer om de invalshoek van de laser aan te passen. Dit wordt gebruikt om de fluorescentie-emissie te optimaliseren van de Aip1-GFP foci en het minimaliseren van de achtergrond fluorescentie van decellen en glijbaan. </li><li> Wanneer het gewenste beeld wordt weergegeven, drukt u op Start. Na 20 sec, drukt u op Stop. Sla de beelden. Selecteer op het tabblad Bestand op het hoofdmenu Slide Opslaan als en geef het bestand locatie en naam. </li></ol></li><li> Gebruik ImageJ software om de beelden te analyseren. Gebruik de macro-plugin &quot;Manual Tracker&quot; om de beweging en de snelheid van de fluorescerende Aip1p brandpunten volgen. Het tijdsinterval parameter tot 0,2 sec. <ol><li> Met behulp van de add-track selectie, selecteren en volgen een individueel fluorescerend eiwit door 4-8 bindweefsel frames. Gebruik het eind spoor commando en de snelheid van eiwit beweging tussen elk frame wordt in een resultaat-venster weer te geven. </li><li> Bepaal de gemiddelde snelheid tussen elk frame met behulp van een Microsoft Excel spreadsheet. Gebruik de waarden van de gemiddelde snelheid van Aip1p beweging voor elke cel stam van rente berekenen. OPMERKING: Een scatter plot van de snelheid van Aip1p beweging en de gemiddelde niet-lineaire snelheid wordt weergegeven in Figure 2B. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lehtonen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+a+missense+variant+in+enteric+smooth+muscle+actin+gamma-2+with+autosomal+dominant+familial+visceral+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy.</a> Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).</li>
<li>Matsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cardiac+actin+mutations+produce+atrial+septal+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects.</a> Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gamma-actin+gene+%28ACTG1%29+are+associated+with+dominant+progressive+deafness+%28DFNA20%2F26%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26).</a> Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).</li>
<li>Nowak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+in+patients+with+actin+myopathy+and+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy.</a> Nat Genet. 23, 208-212 (1999).</li>
<li>Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mutations+in+dilated+cardiomyopathy%2C+a+heritable+form+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure.</a> Science. 280, 750-752 (1998).</li>
<li>Riviere, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+the+actin+genes+ACTB+and+ACTG1+cause+Baraitser-Winter+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome.</a> Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).</li>
<li>Guo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+smooth+muscle+alpha-actin+%28ACTA2%29+lead+to+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).</li>
<li>Sparrow, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+disease+caused+by+mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+%28ACTA1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1).</a> Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).</li>
<li>Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+deafness-causing+%28DFNA20%2F26%29+actin+mutations+affect+Arp2%2F3-dependent+actin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation.</a> J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).</li>
<li>Amberg, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+yeast+actin+cytoskeleton+through+the+budding+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).</li>
<li>Pelham, R. J., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+polymerization+and+actin+cables+in+actin-patch+movement+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).</li>
<li>Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+mechanism+of+the+contractile+ring+for+cytokinesis+by+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast.</a> Science. 319, 97-100 (2008).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ultrastructure+of+the+septin+filament+network+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).</li>
<li>Senning, E. N., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+mitochondrial+transport+in+mating+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).</li>
<li>Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+actin+assembly+by+in+vitro+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).</li>
<li>Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+bundle+formation+by+the+bacterial+actin+ParM%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM.</a> Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortex+organization+and+dynamics+in+microorganisms%2C+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. (63), e3982(2012).</li>
<li>Manneville, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TIRF+microscopy+to+visualize+actin+and+microtubules+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells.</a> Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).</li>
<li>Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+metabolism+of+the+yeast+actin+amino+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus.</a> J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probing+of+yeast+actin+subdomain+3%2F4+hydrophobic+loop+262-274.+Actin-actin+and+actin-myosin+interactions+in+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments.</a> J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).</li>
<li>Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+and+distinct+functions+for+cofilin%2C+coronin+and+Aip1+in+actin+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo.</a> J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).</li>
<li>Malloy, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+Aortic+Aneurysm+%28TAAD%29-causing+Mutation+in+Actin+Affects+Formin+Regulation+of+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization.</a> J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).</li>
<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ion+channel+dynamics+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane.</a> Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).</li>
<li>Bhattacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+vimentin+to+the+cell+surface+by+beta3+integrin+and+plectin+mediates+adhesion+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength.</a> J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).</li>
<li>Hetheridge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+FMNL3+is+a+cytoskeletal+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis.</a> J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).</li>
<li>Bergeron, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+effects+of+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection+alpha-smooth+muscle+actin+mutations+on+actin+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function.</a> J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een effectieve strategie om de dynamiek van het cytoskelet en de bruikbaarheid visualiseren onderzoeken op pathogene mutaties is beschreven. Geavanceerde beeldvormende technieken zijn er nieuwe mogelijkheden om de intracellulaire beweging van eiwitten in de buurt van het celmembraan begrijpen gecreëerd. Totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRF) is een gevoelige techniek voor functionele studies in levende cellen. TIRF gebruikt een schuine excitatie laser die een verdwijnende veld door het verschil in bre...

Actine is de dominante eiwit dat het cytoskelet en participeert in kritieke cellulaire processen zoals celdeling, organel beweging, celbeweeglijkheid, krimp, en de signalering. In het afgelopen decennium, hebben ziekteverwekkende mutaties ontdekt actine in elk van de zes menselijke actine isovormen die tot een reeks van aandoeningen, van myopathieën coronaire hartziekte 1-7. De processen waardoor actine mutaties leiden tot ziekte verder worden toegelicht. De gist model blijft de gouden standaard voor de biochemische effecten van mutaties op actine functie vanwege de voordelen van de interne essentiële actine isovorm, genetische traceerbaarheid en hoge behoud van actine sequentie en functie te bestuderen. Studies tonen aan dat individuele actine mutaties leiden tot moleculaire specifieke disfuncties met dominant negatieve effecten 8. Bijvoorbeeld,-doofheid veroorzaken mutaties in γ-niet-spieractine dat de Lys-118 residu beïnvloeden veranderen regulering doorhet actine bindend eiwit Arp2 / 3 9. Studies vaak te gebruiken in vitro analyses van eiwit: eiwit interacties. Onderzoeken naar het effect van actine mutaties celbiologie en met name actine bindend eiwit lokalisatie in de cel beperkt. Studies van de gist cytoskelet in vivo gewoonlijk afhankelijk beelden van gefixeerde cellen van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop 10. Deze experimenten verstrekte fundamentele gegevens over de morfologie van het actine cytoskelet. Onderzoeken hebben sindsdien opgenomen driedimensionale confocale beeldvorming om de complexe cytoskelet netwerk 11, 12 te visualiseren. Deze beeldvorming maakt kwantificering van de overvloed en de relatieve locatie van actine patches en filamenten. Dunne gedeelte electron tomography is gebruikt om het imago van de morfologie van de dichte draadvormige netwerken ten opzichte van bewaarde subcellulaire structuren 13. Crowded cellulaire spassen met een kleine doorsnede kan tot in detail worden onderzocht met deze techniek. Imaging studies zijn uitgebreid tot levende cellen met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie. Wanneer foto bleken en achtergrond fluorescentie kunnen worden gemodereerd, time lapse imaging laat onderzoeken met betrekking tot de dynamiek van het cytoskelet eiwitten en de reactie op omgevingsfactoren 11, 14. Afzonderlijk visualisatie van de dynamiek van actine filamenten in vitro werd bevorderd door de invoering van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Vergeleken met brede microscopie, TIRF het voordeel van verminderde achtergrondfluorescentie en verbeterd contrast individuele filamenten 15, 16 volgen. Met deze kwaliteiten, is TIRF microscopie is aangepast door celbiologen om cellulaire structuren controleren bij de plasmamembraan 17, 18. Cellulaire gebeurtenissen, waaronder veranderingen in het cytoskelet, kangevisualiseerd worden real time met lage fototoxiciteit, maximale contrast en minimale achtergrond bloei 19. Om een ​​beter begrip van het effect van actine mutaties op de beweging, lokalisatie en omzet cytoskelet eiwitten in de cel, TIRF microscopie en eiwit tagging gebruikt. Hierin methoden om het effect van een klinisch relevante mutatie in actine cytoskelet van dynamica in Saccharomyces cerevisiae wordt beschreven. Bijzonder de lokalisatie en beweging van het actine bindend eiwit, Aip1p, werd gevisualiseerd en gekwantificeerd in cellen die de R256H mutatie in actine. Deze technieken vullen in vitro biochemische studies en zorgen voor een beter begrip van eiwit interacties en functies.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blauw</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, single strengs uit zalmtestikels</td><td>Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>Waarschuwing! Schadelijk bij irritatie</td></tr><tr><td>Fungal/Bacterial DNA Kit</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaan</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Elk kit zal werken</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>1/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD media</td><td>LabExpress</td><td>3011</td><td></td></tr><tr><td>-URA Media</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>Elke PCR machine zal werken</td></tr><tr><td>TIRF Microscoop</td><td>Olympus IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA-R camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p dynamics worden gewijzigd door de r256h mutatie in actine

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutaties in actine leiden tot een scala van menselijke ziekten door specifieke moleculaire veranderingen die vaak veranderen cytoskelet functie. In deze studie, weergave van fluorescent gemerkte eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie (TIRF) microscopie gebruikt visualiseren en kwantificeren veranderingen in het cytoskelet dynamiek. TIRF microscopie en het gebruik van fluorescente markeringen maakt ook de kwantificering van veranderingen in het cytoskelet dynamica veroorzaakt door mutaties in actine. Met deze techniek kwantificering van cytoskelet functie in levende cellen een waardevolle aanvulling in vitro studies van eiwitfunctie. Als voorbeeld hebben missense mutaties die de actine residu R256 geïdentificeerd in drie humane actine isovormen suggereert dit aminozuur een belangrijke rol speelt regulerende interacties. De effecten van het actine cytoskelet mutatie R256H op bewegingen werden bestudeerd door gistmodel. Het eiwit, Aip1, waarvan bekend is dat cofilin helpen actine depolymerisatie wasgelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP) en de N-terminus en bijgehouden in vivo in TIRF microscopie. De snelheid van Aip1p beweging in beide wild-type en mutante stammen werd gekwantificeerd. In cellen die R256H mutant actine, wordt Aip1p beweging beperkt en de snelheid van de beweging is bijna de helft van de snelheid gemeten in wild-type cellen (0,88 ± 0,30 micrometer / sec in R256H cellen in vergelijking tot 1,60 ± 0,42 micrometer / sec in wild-type cellen, p &lt;0,005).

Werkwijze voor beeld de dynamiek van cytoskelet eiwitten in de cel wordt gegeven. De actine-bindend eiwit, Aip1p, werd gelabeld met GFP. Het ontwerp van het plasmide codeert het gelabelde product is weergegeven in Figuur 1. Het plasmide werd vervolgens getransformeerd in de gistcellen. Expressie van de fluorescent gelabeld Aip1p toegelaten visualisatie van het eiwit gedrag in de cel. Aip1p lokaliseert doorgaans naar actine plekken op plaatsen van endocytose 22. Om Aip1p beweging te kwantifice...

Ziekte-veroorzakende mutaties in actine kan cytoskelet functie veranderen. Cytoskelet dynamiek worden gekwantificeerd door beeldvorming van fluorescent gelabelde eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie microscopie. Als voorbeeld heeft het cytoskelet eiwit Aip1p, lokalisatie en beweging gewijzigd cellen die de mutant actine isovorm, R256H.

Aip1p Dynamics worden gewijzigd door de R256H Mutatie in actine

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de beweging van het actinebindende eiwit in gist die een mutante actine-isovorm tot expressie brengt. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide te maken en het actine-interagerende eiwit one or a IP one P gen te taggen met een three x green fluorescent protein Fluor four. De tweede stap is het genereren van een giststam die uitsluitend wildtype of mutant actine tot expressie brengt.Vervolgens wordt het GFP-gelabelde A IP one P-plasmide getransformeerd in de wildtype- of mutante giststam. De laatste stap is het beelden en analyseren van de beweging van het gelabelde A IP one P in de wildtype- en mutante gistcellen. Uiteindelijk wordt totale interne reflectie toegepast.Fluorescentie- of turfmicroscopie wordt gebruikt om aan te tonen dat A IP one P langzamer beweegt in gist die de R 2 56 H mutant actine tot expressie brengt dan in wild-type actine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van het cytoskelet, zoals de relatieve temporele bewegingen van bindingspartners. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen ik ontdekte dat, in tegenstelling tot de wild-type stam, het verwijderen van A IP one P uit de mutante giststam letaal was.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale microscopie, is het verbeterde contrast en de beeldvormingssnelheid. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het optimaliseren van de microscoopinstellingen voor hun specifieke experiment, vanwege de talrijke aanpassingen die kunnen worden gedaan en het subjectieve karakter van de beeldkwaliteit. Begin dit protocol met het genereren van het A IP one PGFP-plasmide en de gemuteerde giststam zoals beschreven in het tekstprotocol, en verteer het plasmide met een restrictie-enzym om integratie in de gistchromosoomcultuur mogelijk te maken.De voorbereide S-C-V-C-A-cellen die niet in staat zijn uracil te synthetiseren, worden gedurende een nacht in vijf milliliter YPD-medium op een schudapparaat bij 30 °C gekweekt. Centrifugeer één milliliter van de cellen gedurende vijf minuten bij 1000 ×g. Maak vervolgens het platenmengsel zoals beschreven in het tekstprotocol en steriliseer dit door filtratie; schenk het supernatant van de cellen af en resuspendeer de cellen in de resterende vloeistof tot de gesuspendeerde cellen.Voeg twee µL salmon testes carrier DNA met een concentratie van 10 mg/mL toe. Voeg vervolgens 10 µL van het gedigesteerde plasmide-DNA toe en vortex voordat u 0,5 mL plate toevoegt en opnieuw vortexet. Voeg tot slot 20 µL 1 M DI three etol toe en vortex.Incubeer het mengsel gedurende zes tot acht uur bij 25 °C. Geef de cellen een hittestok in een waterbad bij 42 °C gedurende 10 minuten. Plaat 100 µL van de cellen, die naar de bodem van de microcentrifugebuis zijn gezakt, op een minus U-plaat.Incubeer bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen of totdat er kolonies ontstaan. Selecteer individuele kolonies en strijk deze uit op een minus.ATE-medium. Ter voorbereiding op de microscopie bevatten deze cellen het plasmide met A IP one GFP en UroGen geïntegreerd in het chromosoom.Kweek een cultuur van de gistcellen met het geïncorporeerde A IP one PGFP overnight in YPD op een rotator bij 30 °C. Subcultiveer 1 mL van de overnight cultuur in 9 mL minus Euro-medium. Kweek de cellen gedurende nog eens 3 tot 4 uur op een schudincubator bij 30 °C om ervoor te zorgen dat ze zich in de logaritmische groeifase bevinden.Voeg vervolgens drie µL cellen toe aan een glazen microscoopglas en plaats een dekglas. Laat de cellen vijf minuten lang bezinken op het objectglas. Voordat het objectglas in de houder van de tafelplaat wordt geplaatst, wordt het A IP one PGFP-eiwit geobserveerd met een total internal reflection fluorescence (TIRF)-microscoop met gebruik van een 100 x TIRF-objectief met olie-immersie en een digitale CCD-camera.Om op de cellen te focussen, opent u de software van slide book 5.0 en klikt u op de knop voor het focusvenster in de werkbalk. Om toegang te krijgen tot de focusbediening, selecteert u het tabblad 'scope' en kiest u het 100 x turf objectief. Schakel de lamp in en schuif de lampbalk naar 15%. Wijzig de bin-instelling naar twee bij twee en stel het filter op de microscoop in op brightfield.Gebruik de fijninstelling van de focus om de cellen scherp te stellen, zoals te zien is op het computerscherm. Gebruik de bedieningselementen in het focusvenster om de lamp uit te schakelen, wijzig het filter naar 'live' en klik op de T-I-R-F-M-knop op de T-I-R-F-M-illuminator die aan de rechterpoort van de microscoop is bevestigd. Zet de laseremissie aan en selecteer het tabblad 'stream' in het focusvenster.Vink het vakje naast start recording aan en klik vervolgens op de brightfield-knop op de TIR FM-illuminator. Draai aan de micrometer om de invalshoek van de laser aan te passen. Dit wordt gebruikt om de fluorescentie-emissie van de A IP one GFP-foci te optimaliseren en de achtergrondfluorescentie van de cellen en de objectglas te minimaliseren wanneer het gewenste beeld wordt weergegeven.Druk op start. Neem gedurende 20 seconden beelden op met een snelheid van vijf frames per seconde. Druk na 20 seconden op stop.Sla de afbeeldingen op via het tabblad 'file' in de hoofdmenubalk. Selecteer 'save Slide as' en voer het bestand, de locatie en de naam in. Gebruik vervolgens de Image J-software.Om de beelden te analyseren, gebruikt u de macro-plugin 'manual tracker' om de beweging en snelheid van de fluorescente A IP one P-foci te volgen. Wijzig de parameter voor het tijdsinterval naar 0,2 seconden. Selecteer en volg met de optie 'add track' een individueel fluorescent eiwit over vier tot acht opeenvolgende frames.Gebruik het N track-commando, waarna de snelheid van de eiwitverplaatsing tussen elk frame in een resultatenvenster wordt weergegeven. Bepaal de gemiddelde snelheid tussen elk frame met behulp van een Microsoft Excel-spreadsheet.Gebruik de waarden om de gemiddelde snelheid van een A IP one P-beweging te berekenen, of van elke cellijn van belang om een A IP one P-beweging te kwantificeren. Meer dan 50 fluorescerende A IP one P-foci werden gevolgd in meer dan 10 cellen. Representatieve resultaten van een A IP one P-beweging in wildtype-cellen worden getoond zoals verwacht.Het fluorescentielabel a IP one P beweegt snel door de cel en verdwijnt vervolgens in cellen die de R 2 56 H mutant Acton tot expressie brengen. A IP one P vertoont minder beweging in vergelijking met wildtype-cellen. A IP one P wordt gevolgd met Image J om de beweging van het eiwit kwantitatief in kaart te brengen.A IP one P verspreidt zich over de hele cel in de wildtype-stam, maar beweegt slechts in een beperkt gebied. In de gemuteerde actine-stam werd de gemiddelde snelheid berekend voor elk fluorescent A IP one P-gebied. In wildtype-cellen is de gemiddelde snelheid van de beweging van a IP one P 1,60 plus of minus 0,42 microns per seconde; cellen die de R 2 56 H-mutante actine tot expressie brengen, waarvan bekend is dat deze een abnormale morfologie van het actine-cytoskelet hebben, vertonen een veranderd A IP one P-fenotype in de gemuteerde stam.De beweging van A IP one P is beperkt en langzamer. De gemiddelde snelheid van de A IP one P-beweging is 0,88, plus of minus 0,30 microns per seconde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe cytoskeletale eiwitten in beeld kunnen worden gebracht met behulp van turf-microscopie.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de cellen niet uitdrogen of fotogebleekt raken.

aip1p-dynamics-are-altered-by-the-r256h-mutation-in-actin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.

Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Leer hoe Aip1p-dynamiek verandert door de R256H-mutatie in actine bij gist met behulp van totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult hoe mutaties het cytoskelet beïnvloeden.

Aip1p Dynamics worden gewijzigd door de R256H Mutatie in actine

Meer video's verkennen