Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit in enkele microvaten van geïsoleerde rattenlongen te kwantificeren met behulp van een op fluorescentie gebaseerde methode. Dit wordt bereikt door eerst rattenlongen te isoleren en ze te perfunderen met autoloog bloed. De tweede stap van de procedure is het inbrengen van een linker atrium microkatheter in een kleine regio van de long om flora vier gelabelde dextrine te infunderen.

Terwijl de gelabelde dextrine wordt toegediend, worden er foto's van de long microvaten gemaakt. De laatste stap is het kwantificeren van de permeabiliteit van enkele microvaten uit de beelden met behulp van software. Uiteindelijk kunnen de resultaten de mate van permeabiliteit van long microvaten onder verschillende omstandigheden laten zien, zoals na LPS-behandeling.

Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Dr. Kava Kasami, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het uitvoeren van een tracheotomie op een mannelijke rat in een bevestigde chirurgische anesthesietoestand. Gebruik een PE 90 tracheaal canule en zet deze vast met hechtingen. Vervolgens infundeer je het hart met 100 tot 200 eenheden heparine met behulp van een 21 gauge vlindernaald.

Wacht een minuut en vervolgens exsanguineer je het bloed. Verzamel het bloed en zet het apart met zoutoplossing. Vul twee canules gemaakt van drie millimeter tigonbuis van vier centimeter lang en verbreed aan één uiteinde.

Voer nu een thoracotomie uit. Maak een snede net groot genoeg voor de canule in het rechter ventrikel en schuif de verbreed uiteinde van een canule richting de longslagader. Zet de canule vast met hechtingen.

Gebruik dezelfde techniek om de andere canule in de apex van het linker ventrikel te plaatsen richting het linker atrium. Zet deze vast met twee millimeter brede navelstrengtape. Verwijder nu de tussenliggende bindweefsels en verwijder het hart samen met de canules.

Breng ze over naar een petrischaal met de diafragmatische oppervlakte van de long naar boven en de drie canules allemaal uitgelijnd. Verplaats de gedissekteerde voorbereiding naar een verstelbare tafel voorzien van nummer 18 tigonbuisjes die zijn bevestigd aan druktransducers die dienen als inlaat- en uitlaatbuizen. Meng nu de verzameling bloed met een gelijk volume van 5% albumine oplossing.

Voeg dit mengsel toe aan het laadreservoir. Start de pomp bij 14 milliliter per minuut. Zorg ervoor dat de buis geen luchtbellen bevat.

Bij de voorbereiding. Bevestig de longslagader aan de longinlaatbuis en de linker atrium canule aan de uitlaatbuis. Controleer nogmaals dat er geen lucht in de buis zit, en controleer ook of de shunt open staat.

Verbind de trachea canule met een derde druktransducer. Blaas de longen op via de trachea canule met 30% zuurstof. Houd de longen op vijf centimeter waterdruk.

Klem nu de shunt en start de pomp bij 14 milliliter per minuut. Om de longperfusie tijdens de perfusie te beginnen, stel de pomp in om de longdruk op ongeveer 10 centimeter water te houden en de linker atriumdruk op drie centimeter water te houden. Begin met het voorbereiden van de met bloed doordrenkte long.

Bouw eerst een infuuskatheter uit een 40 centimeter lengte van PE 10 buis ingebracht in een 30 centimeter lengte van PE 90 buis. Bevestig het andere uiteinde van de PE 10 buis aan een 30 gauge naald bevestigd aan een één cc spuit. Breng het uiteinde van de buis bevestigd aan de long boven de voorbereiding en bevestig de infuuskatheter eraan.

Leid de infuuskatheter naar het linker atrium en vervolgens de long in totdat deze weerstand ontmoet. Overmatige kracht zal de long verwonden. Een juiste insnijding van de microkatheter is cruciaal, omdat elke schade aan de long door de microkatheter de succeskans van het protocol zal verminderen.

Vul vervolgens de spuit met ringers en bevestig deze aan een pomp. Infundeer de oplossing langzaam met een snelheid van 10 microliter per minuut. Geleidelijk zal de infusieplaats bleker worden in vergelijking met de rest van de long om het oppervlak van de long snel in plastic te houden met uitzondering van de infusieplaats.

Nu om de long te visualiseren, maak een kijkvenster door een O-ring aan een 22 millimeter dekglas te bevestigen. Gebruik stopkorhoed om de O-ring aan een reageerbuiskoker te bevestigen. Plaats vervolgens het venster over de infusieplaats.

Voltooi de opstelling door een 20 x objectief over het dekglas te zwaaien en op de long te focussen. Er wordt geen visuele vervorming verwacht. Infundeer nu de long met een oplossing naar keuze.

In dit voorbeeld wordt, na de zoutoplossing, één milliliter van ZI geconjugeerd dextrine gedurende 60 minuten via de spuitpomp in de long ingespoten. Gebruik de beeldvormingssoftware om één beeld per minuut gedurende de één uur durende infusie op te nemen en door te gaan met opnemen tijdens de daaropvolgende was uit fase gedurende 10 minuten. Nadat het Fitz dextrine is ingespoten, was het uit door de long ringer oplossing gedurende minimaal nog eens 10 minuten bij dezelfde stroomsnelheid te infundeer. Later. Bij het analyseren van de verkregen beelden score je de maximale fluorescentie-intensiteit in het gebied van belang tijdens de fit e infusie.

Score vervolgens de maximale fluorescentie-intensiteit van de resterende fluorescentie na de 10 minuten was uit. Veranderingen in vasculaire permeabiliteit werden onderzocht met behulp van fitzy dextrine infusie na behandeling met bacteriële lipopolysaccharide, aangezien dit een veel gebruikt model is van een LI. De resterende fit e fluorescentie was laag in microvaten behandeld met ringers, maar hoog in die behandeld met LPS. Bovendien, in vergelijking met de ringer infusie, veroorzaakte LPS infusie een significante vermindering van de permeabiliteitsindex, wat wijst op een globale toename van de permeabiliteit in alle vaten binnen het beeldveld.

Bovendien, in vergelijking met de ringer infusie, veroorzaakte LPS infusie een significante vermindering van de permeabiliteitsindex, wat wijst op een globale toename van de permeabiliteit in alle vaten binnen het beeldveld.