Het ontdekken van eiwit interacties en karakteriseren Eiwit-functie gebruiken HaloTag Technology

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitcomplexen efficiënt te isoleren uit zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te transfecteren met een halo tag-fusieconstruct om het eiwit van belang tot expressie te brengen. De tweede stap bestaat uit het lyseren van de cellen en het covalent vastleggen van de eiwitcomplexen op hars via de halo tag.

Vervolgens worden de eiwitcomplexen op de hars voorzichtig gewassen om aspecifieke interacties te verwijderen. De laatste stap is het elueren van de eiwitcomplexen uit de hars. Uiteindelijk worden halo tag pull downs gebruikt om nieuwe eiwitinteracties uit zoogdiersystemen te isoleren en te ontdekken.

De methoden die we u vandaag zullen demonstreren, kunnen leiden tot belangrijke ontdekkingen op het gebied van functionele proteomics, waaronder de identificatie van nieuwe eiwitinteracties en het bepalen van de eiwitlokalisatie binnen cellen. Deze procedures worden vandaag uitgevoerd door twee van onze senior wetenschappers, Jackie Mendez en Alen Beek. Bereid eerst voor elke fusie of controle één schaal van 15 centimeter voor met 30 milliliter cellen bij een concentratie van drie tot vier maal 10⁵ cellen per milliliter, of een totaal van 1 tot 1,2 maal 10⁷ cellen per construct.

Incubeer de cellen gedurende 18 tot 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Transfect na incubatie het construct met het gewenste transfectiereagens. Verwijder 24 tot 48 uur na transfectie het medium en was de cellaag voorzichtig met 20 tot 25 milliliters ijskoud PBS; verwijder de PBS-wash en voeg 25 tot 30 milliliters gekoelde PBS van 4 °C toe.

Schraap vervolgens de cellen voorzichtig van de schaal met een celschraper. Zodra de cellen in conische buizen zijn verzameld, worden de monsters gedurende vijf tot 10 minuten gecentrifugeerd bij 2000 ×g en 4 °C. Na het verwijderen van het supernatant worden de celpellets gedurende minimaal 30 minuten of maximaal zes maanden bewaard bij -80 °C.

Bereid voor elk fusie- of controlesample 18 milliliter hars-equilibratiewasbuffer. Meng de hars voorzichtig door het vial om te keren om een uniforme suspensie te verkrijgen. Doseer voor elk pull-down experiment 200 microliters hars in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 800 ×g. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant zonder de hars onderin de buis te verstoren. Zodra de supernatant is weggegooid, voegt u 800 µL hars-equilibratiewasbuffer toe aan het monster en mengt u dit grondig door de buis meerdere keren te keren. Daarna.

Centrifugeer het monster gedurende twee minuten bij 800 ×g. Verwijder voorzichtig de supernatant en gooi deze weg. Herhaal de voorgaande stappen nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.

Na het ontdooien van de celpellets worden deze resuspendeerd in 300 µL van de eerder bereide mammaliaanse lysisbuffer door middel van pipetteren. Draag het mengsel vervolgens over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg zes µL van een 50 x protease-inhibitorcocktail toe.

Voeg vervolgens drie µL RQ1 DNase toe en keer het monster 10 minuten lang om. Lyseer de cellen bij kamertemperatuur door het monster vijf tot 10 keer door een spuitnaald van 25 of 27 gauge te persen. Nadat het monster is gecentrifugeerd bij 14.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C, wordt het heldere lysaat overgebracht naar een nieuwe buis en op ijs geplaatst.

Voeg vervolgens nog 700 µL van de eerder bereide 1X TBS-buffer toe aan het heldere lysaat en meng dit goed door herhaaldelijk te pipetteren. Verwijder de laatste wasbeurten uit de eerder bereide, geëquilibreerde harsbuisjes zonder de hars onderin elk buisje te verstoren. Voeg daarna één milliliter van het verdunde lysaat toe aan elk buisje.

Incubeer de monsters onder menging op een buizenrotator gedurende 15 minuten bij 22 °C. Centrifugeer daarna de harsbuizen gedurende twee minuten bij 800 ×g. Voeg na het verwijderen van het supernatant 1 mL resin equilibration wash buffer toe en meng dit grondig door elke harsbuis handmatig enkele keren om te keren, gevolgd door centrifugatie van de harsbuizen gedurende twee minuten bij 800 ×g. Verwijder de wasvloeistoffen zodra de voorafgaande wasstappen drie keer zijn herhaald.

Voeg één milliliter hars-equilibratiewasbuffer toe aan de buisjes nadat de monsters vijf minuten bij 22 °C zijn geïncubeerd onder constante rotatie, centrifugeer de harsbuisjes twee minuten bij 800 ×g en gooi de wasvloeistoffen weg. Resuspendeer op dit punt de hars van elk monster in 50 µL SDS-elutiebuffer. Schud de buisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met een automatische microcentrifugebuis-shaker.

Na centrifugatie gedurende twee minuten bij 800 ×g, worden de EITs overgebracht naar schone buisjes voor analyse. Voor western blot of silver stain gel worden vijf tot 10 µL van de monsters geladen op een SDS-denaturerende gel voor massaspectrometrie. Bewaar 40 µL van elk monster bij -20 °C voor toekomstige analyse. In een acht-well chambered cover glass voor elk fusie-eiwit of controleplaat worden 400 µL HELOC-cellen in het bijbehorende medium in elke well geplaatst, met een dichtheid van 1 tot 2 × 10⁵ cellen per mL.

Nadat de cellen 18 tot 24 uur zijn geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2, worden ze getransfecteerd met het gewenste transfectiereagens. Verdun na 18 tot 24 uur na transfectie de TMR-ligand 1 op 200 in het geschikte celmedium. Voeg vervolgens 100 µL van deze oplossing toe aan elke put en meng voorzichtig. Incubeer daarna de getransfecteerde cellen met de ligand gedurende 15 minuten bij 37 °C en 5% CO2.

Aspirer na voltooiing het medium dat het ligand bevat en vervang dit door 500 µL van het juiste medium zonder eiwitfusietag-ligand, dat vooraf is opgewarmd tot 37 °C. Zodra de vorige stap twee keer is herhaald voor in totaal drie wasbeurten, worden de cellen gedurende 30 minuten teruggeplaatst in de incubator.

Zuig na de incubatie van 30 minuten het medium af en vervang dit door 500 µL geschikt medium, dat vooraf is voorverwarmd tot 37 °C. Beeld na deze stap de cellen af met een microscoop met de juiste acquisitieparameters; de expressie van het halo, BRD4 en de halo-tag controle is waarneembaar. Fusie-eiwitexpressie kan ook worden gedetecteerd middels Western blots met anti-halo-tag antilichamen of antilichamen tegen het bait-eiwit.

Zilverkleuringen van gels van biologische replica's van Halo BRD four en controle pulldowns tonen een hoge reproduceerbaarheid aan en laten eiwitten zien die interageren met het BRD four-eiwit. De hoge abundantie van componenten van PTF B CDK nine en Cycline T, evenals het BRD nine-eiwit, bevestigt de specifieke vangst van BRD four-complexen. De gels toonden andere eiwitten die zijn geïdentificeerd als potentiële interactoren van BRD four.

Als aanvullend voorbeeld werden complexe isolaties uitgevoerd met het Halo HD one-eiwit. In dit geval werd TEV-protease gebruikt om te knippen in een linkerregio tussen de Halo-tag en H DAC one, waarbij aanzienlijke hoeveelheden van het HD one-aas-eiwit werden vrijgemaakt. Zoals waargenomen.

HD one pulldown-monsters vertoonden hoge niveaus van HD one-activiteit, die werd geremd door de HDA-remmer saha. Om de specificiteit verder aan te tonen, werd geen HDA-remming waargenomen met de sirtuinefamilie-remmer EX 5 27 en werd er geen signaal gedetecteerd met alleen buffer. He A-cellen getransfecteerd met Halo BRD four en Halo HDAC one werden fluorescent gelabeld met TMR.

Ligand Imaging toonde aan dat beide in de nucleus gelokaliseerd waren en bewees dat de tag de fysiologische cellulaire lokalisatie van de fusiepartners niet beïnvloedde. Na het volgen van deze procedure kunnen de geïsoleerde eiwitten en hun interactiepartners worden geïdentificeerd en verder worden geanalyseerd met behulp van diverse analytische methoden, zoals massaspectrometrie en western blotting.