Het ontdekken van eiwit interacties en karakteriseren Eiwit-functie gebruiken HaloTag Technology

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitcomplexen efficiënt te isoleren uit zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te doorknippen met een halo tag-fusieconstruct om het eiwit van belang tot expressie te brengen. De tweede stap is om de cellen te snijden en de eiwitcomplexen covalent vast te leggen op hars via halo tag.

Vervolgens worden de eiwitcomplexen op de hars voorzichtig gewassen om niet-specifieke interacties te verwijderen. De laatste stap is om de eiwitcomplexen van de hars te elueren. Uiteindelijk worden halo tag pull downs gebruikt om nieuwe eiwitinteracties te isoleren en ontdekken uit zoogdiersystemen.

De methoden die we u hier vandaag zullen demonstreren, kunnen belangrijke ontdekkingen mogelijk maken op het gebied van functionele proteomics, inclusief identificatie van nieuwe eiwitinteracties en bepaling van eiwitlokalisatie binnen cellen. Deze procedures worden vandaag uitgevoerd door twee van onze senior wetenschappers, Jackie Mendez en Alen Beek. Eerst bereidt u voor elke fusie of controle één 15 centimeter schaal voor met 30 milliliter cellen bij drie tot vier keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter, of één tot 1,2 keer 10 tot de zevende cellen totaal per construct.

Incubeer de cellen gedurende 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Na incubatie transfecteert u het construct met het gewenste transfectie reagens. Na 24 tot 48 uur post-transfectie verwijdert u het medium en wast u de cellayaer voorzichtig met 20 tot 25 milliliter ijskoud PBS. Verwijder de PBS-was en voeg 25 tot 30 milliliter vier graden Celsius gekoelde PBS toe.

Vervolgens schraapt u de cellen voorzichtig van de schaal met een cellschaber. Zodra de cellen in kegelbuisjes zijn verzameld, centrifugeert u de monsters gedurende vijf tot 10 minuten bij 2000 keer G en vier graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, plaatst u de cellenpellets gedurende minimaal 30 minuten of maximaal zes maanden op min 80 graden Celsius.

Bereid voor elke fusie- of controlemonster 18 milliliter harsequilibratiewasbuffer. Meng de hars voorzichtig door de fles om te keren om een uniforme suspensie te verkrijgen. Voor elk pull down-experiment doseert u 200 microliter hars in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje.

Centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 800 keer G. Na centrifugatie. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de hars op de bodem van de buis te verstoren. Zodra het supernatant is weggegooid, voegt u 800 microliter harsequilibratiewasbuffer toe aan het monster en mengt u grondig door de buis meerdere keren om te keren. Na.

Centrifugeer het monster gedurende twee minuten bij 800 keer G. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant weg. Herhaal de vorige stappen nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.

Na het ontdooien van de cellenpellets, suspendeert u ze in 300 microliter eerder bereide zoogdierlyseringsbuffer door op en neer te pipetteren. Breng het vervolgens over naar een nieuw microcentrifugebuisje en voeg zes microliter 50 x proteaseremmercocktail toe.

Voeg vervolgens drie microliter RQ een DNAs toe en draai het monster gedurende 10 minuten. Lyseer de cellen bij kamertemperatuur door het monster vijf tot tien keer door een 25 of 27 gauge spuitnaald te laten lopen. Nadat het monster gedurende vijf minuten bij 14.000 keer G op vier graden Celsius is gecentrifugeerd, brengt u het heldere lysate over naar een nieuwe buis en plaatst u het op ijs.

Voeg vervolgens een aanvullende 700 microliter eerder bereide een XTBS-buffer toe aan het heldere lysate en meng goed door op en neer te pipetteren. Verwijder de laatste wasbeurten uit de eerder bereide geëquilibreerde harsbuisjes zonder de hars op de bodem van elke buis te verstoren. Voeg vervolgens een milliliter van het verdunde lysate toe aan elke buis.

Incubeer de monsters met mengen op een buisrotator gedurende 15 minuten bij 22 graden Celsius. Centrifugeert u de harsbuisjes vervolgens gedurende twee minuten bij 800 keer G. Na het weggegooien van het supernatant, voegt u een milliliter harsequilibratiewasbuffer toe en mengt u grondig door elke harsbuis handmatig meerdere keren om te keren na centrifugatie van de harsbuisjes gedurende twee minuten bij 800 keer G. Gooi de wasbeurten weg zodra de vorige en wassingsstappen drie keer zijn herhaald.

Voeg een milliliter harsequilibratiewasbuffer toe aan de buisjes nadat de monsters gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius zijn geïncubeerd met constante rotatie, centrifugeert u de harsbuisjes gedurende twee minuten bij 800 keer G en gooit u de wasbeurten weg. Op dit punt, suspendeert u de hars van elk monster in 50 microliter SDS-elutiebuffer. Schud de buisjes bij kamertemperatuur met een automatische microcentrifugebuisjesshaker gedurende 30 minuten.

Na centrifugatie gedurende twee minuten bij 800 keer G. Breng de EIT's over naar verse buisjes voor analyse Voor western blot of zilverkleuring gel, laadt u vijf tot tien microliter van de monsters op een SDS-denaturerende gel voor massaspectrometrie. Bewaar 40 microliter van elk monster bij min 20 graden Celsius voor toekomstige analyse. In een acht-kamerige gekamerde dekglas voor elke fusie-eiwit- of controleplak, 400 microliter HELOC-cellen in hun geschikte media in elke put met een dichtheid van één tot twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter.

Na het incuberen van de cellen gedurende 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2, transfecteert u ze met het gewenste transfectiereagens. Na 18 tot 24 uur post-transfectie verdunt u TMR-ligand een tot 200 in het geschikte celmedium. Voeg vervolgens 100 microliter van deze oplossing toe aan elke put en meng voorzichtig. Vervolgens incubeert u de getransfecteerde cellen die het ligand bevatten gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en 5%CO2.