Name: Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer hoe je humane monocyten isoleert via dubbele dichtheidsgradiëntcentrifugatie en differentieert tot macrofagen in Teflon-gecoate zakken. Deze methode levert hoge opbrengsten met standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag mevrouw Meike Schaffrinski bedanken voor haar altijd een uitstekende technische assistentie tijdens de laatste paar jaar. Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Council (DFG) binnen de gezamenlijke onderzoeksgroep 942 (FOR942) en door het onderzoeksprogramma van de faculteit Geneeskunde, Georg-August-Universität Göttingen.

1 Bereiding van steriel menselijk AB serum <ol><li> Verzamel 4-5 zakken van vers bevroren plasma (FFP). WINKEL zakken bij -20 ° C totdat zijn voldoende zakken verzameld. </li><li> Ontdooi zakken en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 ° C in een waterbad om complement te inactiveren en verwijderen fibrine. </li><li> Grondig ontsmetten de buitenkant van de zakken en breng het plasma tot 50 ml buizen. </li><li> Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te ontdoen van precipitaten en plaatjesresten. </li><li> Bundelen alle bovenstaande vloeistoffen en gooi de pellets. </li><li> Aliquot serummonsters in 15 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: U kunt de handel verkrijgbare warmte geïnactiveerd normaal menselijk AB-serum worden gebruikt. </li></ol> 2 Isolatie van monocyten Om in evenwicht brengen van de centrifuge te vergemakkelijken, is het raadzaam om twee buffycoats parallel verwerken. Echter, neem care afzonderlijke materialen voor elke donor en niet de cellen te mengen. Indien buffy coats niet gemakkelijk kan worden verkregen, kan 400 ml gehepariniseerd perifeer bloed worden gebruikt. <ol><li> Desinfecteren voorzichtig de plastic zakken met de buffycoats en breng de inhoud van elk buffycoat twee buizen van 50 ml. </li><li> Per buffy coat vullen drie 50 ml buizen met 15 ml Ficoll-oplossing (1,077 g / ml). De Ficoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding. </li><li> Layer 30-35 ml van de bufferlaag bloed bovenop de Ficoll oplossing voor de eerste dichtheidsgradiënt. Zorg er voor dit langzaam en voorzichtig doen om te voorkomen dat het mengen van beide lagen. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis. </li><li> Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 40 ml in totaal. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig supernatant en was pellet opnieuw met 40 ml PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Voor elke donor zwembad de pellets in 20 ml RPMI-1640 zonder fenol rood + 10% FCS. </li><li> Bereid de iso-osmotisch Percoll oplossing voor het tweede dichtheidsgradiënt: Twee donors meng 23,13 ml Percoll-oplossing (dichtheid: 1,131 g / ml) in een 50 ml buisje met 1,87 ml 10-voudig PBS. Vervolgens over 23 ml van deze oplossing tot een nieuwe buis van 50 ml en voeg 27 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS tot een 46% iso-osmotisch Percoll oplossing. De Percoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding. </li><li> Voor elke donor overdracht 25 ml van de bereide Percoll oplossing in een 50 ml buisje en laag het PBMC oplossing bereid 2.9) bovenop de Percoll oplossing. Wees voorzichtig om dit heel langzaam een ​​doend voorzichtig beide lagen de neiging om gemakkelijk mengen. Indien correct gedaan de twee fasen worden onderscheiden door hun verschil in kleur. </li><li> Centrifugeer bij 550 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van monocyten die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis. </li><li> Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 50 ml in totaal. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellets in 20 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS. </li></ol> 3 differentiatie van monocyten tot macrofagen <ol><li> Bepaal het aantal geïsoleerde monocyten in een 1:10 verdunning in trypaanblauw. Tellen alleen de grote, vaak onregelmatig gevormde cellen, die monocyten zijn. Reken er maar niet de kleinere, ronde-vormige cellen die lymfocyten. NOTE: Monocyt nummers niet al te nauwkeurig bepaald omdat ze alleen een hint over hoeveel en welke FEP Teflon beklede zakken (kleine of grote) moeten worden gebruikt voor de differentiatie van de cellen bevatten. </li><li> Voor 1,0-1,5 x 10 8 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een grote FEP Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 174 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 180 ml). <ol><li> Voor 3,0-5,0 x 10 7 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een kleine Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 28,5 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 30 ml). OPMERKING: Als bijvoorbeeld 8,0 x 10 7 monocyten worden verkregen, adviseren wij om ze te zaaien in two kleiner volume zakken 4,0 x 10 7 cellen per. In plaats van M-CSF, monocyten kan ook worden gedifferentieerd granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF) en dezelfde concentratie (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Voeg de celsuspensie (20 ml) op de voorbereide medium en meng voorzichtig. Als twee zakken bereid uit een donor, voeg 20 ml RPMI-1640 aan de celsuspensie en voeg de helft van de suspensie aan elk medium bereiding. </li><li> Optioneel: Om te bepalen of monocyt preparaat steriel gebleven, scheur een druppel van de celsuspensie op een bloed agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Draai het omhulsel van een 50 ml perfusiespuit op de stekker van de FEP Teflon-coating celcultuur zak en vul het met de voorbereide celsuspensie. </li><li> Haal de stekker van de spuit en druk de resterende lucht uit de zak. Sluit de zak met een afsluitende kegel. </li><li> Incubeer de zakken voor 6-7 dagen bij 3776, C met 5% CO2. </li></ol> 4 Macrophage Harvest <ol><li> Plaats de FEP Teflon beklede celkweek zakjes gedifferentieerde macrofagen op ijs gedurende ten minste 1 uur tot onthechting van de cellen (een incubatietijd van maximaal 3 uur mogelijk) te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de zak is bedekt met ijs. </li><li> Trek de zak met minimale druk 10x over de rand van een bureau / board. </li><li> Desinfecteren voorzichtig de buitenkant van de verpakking en verwijder het sluiten kegel. </li><li> Draai een 50 ml spuit op de stekker van de zak, verwijder de celsuspensie, en overbrengen naar 50 ml buizen. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur verminderde snelheid van de cellen. </li><li> Zuig het supernatant en verzamel het pellets ve zak in 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS in totaal. </li><li> Bepaal het aantal cellen in een hemocytometer (1: 4-1: 10 verdunning in trypan blauw). Tellen alleen de grote ronde cellen. OPMERKING: Na differentiatie van macrofagen in de FEP Teflon beklede zakken, kan er residuele cellen bijvoorbeeld lymfocyten, afhankelijk van de donor en de kwaliteit van de monocyt isolatie. </li><li> Om de FEP Teflon-coating zakken hergebruiken, was ze twee keer met 70% ethanol om de resterende cellen te verwijderen. Vul ze met 50 ml 70% ethanol en incubeer overnacht. Was de zakken 3x met steriel PBS, wikkel ze in sterilisatie papier, en steriliseren in een autoclaaf met behulp van standaard procedures. OPMERKING: De celkweek zakken kunnen meerdere malen hergebruikt worden zonder verlies van macrofagen opbrengsten. Echter, hebben we besloten om de zakken gooi deze na 10 gebruikt voordat ze beginnen te lekken. </li><li> Voor vervolgexperimenten cultuur macrofagen in RPMI-1640 + 10% FCS. Als lagere serumconcentraties vereist, cultuur in RPMI-1640 met 1% FCS is ook mogelijk. Zaad en incubeer cellen voor 3-4 uur. Na deze periode mee dat macrofagen hechten aan het oppervlak van de celkweekschaal terwijleventuele contaminerende cellen (bijvoorbeeld erythrocyten, lymfocyten en dendritische cellen) blijven in suspensie. Was de cellen ten minste tweemaal met PBS om niet-hechtende cellen te verwijderen. </li><li> Om macrofagen uit de celkweek schotel voor verdere experimenten los voorzichtig afkrabben van het oppervlak. Alternatief incubeer schotels voor 20 min op ijs, zuig het kweekmedium en voeg 1 ml enzymvrije celdissociatiebuffer. Na 5 minuten incubatie bij 37 ° C wordt 4 ml PBS en los cellen door pipetteren en neer ten minste 3 minuten. </li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
<li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX%283%29CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li>
<li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wingless+homolog%2C+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li>
<li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li>
<li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+inflammation%2C+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nestle+Nutrition+workshop+series.+Paediatric+programme%22%5BJournal%5D)">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li>
<li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+atherosclerosis%3A+a+dynamic+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li>
<li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li>
<li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li>
<li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag%3A+identification+of+the+human+monoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Reticuloendothelial+Society%22%5BJournal%5D)">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li>
<li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+acid+inhibits+macrophage%2Fmicroglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li>
<li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes%2C+Macrophages%2C+and+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475(2009).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages%3A+potential+candidates+for+CNS+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Ther+Transplant%22%5BJournal%5D)">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li>
<li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li>
<li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5A%2FCaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen als er geen belangenconflict bestaat.

Macrofagen zijn belangrijke effectorcellen van het aangeboren immuunsysteem en belangrijke functies in immunomodulatie antigeenpresentatie en weefselhomeostase geven. Vanwege hun opmerkelijke plasticiteit, zij kunnen reageren op verschillende stimuli veranderingen van het fenotype. Tot dusver veel gegevens over macrofaag polarisatie worden verkregen in het systeem van muizen, hoewel er meldingen blijkt dat slechts ongeveer 50% van macrofaag polarisatie markers direct vertaald wordt uit muizen menselijke 16. Daarom presenteren we hier een methode om primaire humane macrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen zonder de noodzaak van dure materialen, bijvoorbeeld MACS magnetische korrels of tegenstroom centrifugale elutriatie apparaat. Onze werkwijze is gebaseerd op de isolatie van monocyten uit PBMC en de daaropvolgende differentiatie in macrofagen FEP Teflon beklede celkweek zakken in de aanwezigheid van lage concentrations van M-CSF 11-13. Hoewel monocyten vertegenwoordigen minder dan 5 tot 10% van perifeer bloed leukocyten in de mens, na stimuleren zij worden gerekruteerd perifere plaatsen waar ze differentiëren resident weefsel macrofagen of dendritische cellen 17. De cytokine M-CSF is belangrijk voor monocyt overleving en drijft hun differentiatie tot macrofagen 18,19. Tot dusver zijn de M-CSF-concentraties die werden gekozen voor monocyt differentiatie varieerde tot 100 ng / ml, echter in ons protocol kunnen wij voldoende aantallen rijpe macrofagen te verkrijgen met een M-CSF concentratie van slechts 2,5 ng / ml 12 , 20. Daarnaast worden cellen gekweekt in FEP Teflon beklede celkweek zakken die het losmaken van de macrofagen en de daaropvolgende zaaien in bepaalde celaantallen vergemakkelijken. Aangezien de zakken meerdere malen kan worden hergebruikt, dit verder vermindert de kosten voor de isolatie werkwijze. De door deze procedure macrofagenzijn zeer positief voor CD45, CD14, CD 11, CD 11 c en tonen uitdrukking van de mannose receptor CD206, die pleit voor een bevolking van zuiver, volwassen macrofagen 21,22. Bijzonder hoge CD14 expressie is typisch voor gedifferentieerde macrofagen in de aanwezigheid van M-CSF 23. Na enten van de cellen, tonen zij een snelle hechting aan kunststof oppervlakken met een aantal cellen welke een typische spindel-achtige morfologie, terwijl anderen vertonen een gebakken ei fenotype. Dit is in overeenstemming met de waarnemingen van andere auteurs 18,22,24. Er werd gemeld dat differentiatie van monocyten in de aanwezigheid van M-CSF leidt tot M2-gepolariseerde macrofagen 16,25. De macrofagen geïsoleerd door ons protocol nog steeds in staat om te reageren op diverse stimuli inclusief blootstelling aan tumorcel afgeleide microvesicles en co-kweek met tumorcellen 26,27 of blootstelling aan LPS waaraan zij reageren met inductie van pro inflammatoire genen zoals IL-1 en# 946 ;, TNFa, Wnt5a, of diverse matrixmetalloproteïnases die typisch worden beschouwd voor het M1-gepolariseerde macrofagen 3,5,28. Concluderend, de isolatie van monocyten door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en daaropvolgende differentiatie tot macrofagen uit FEP Teflon beklede celkweek zakken resulteert in hoge aantallen macrofagen zonder dat technisch moeilijke of dure procedures. De verkregen macrofagen kunnen worden gebruikt voor daaropvolgende analyse van klassiek activatie door LPS op de co-kweek met tumorcellen.

Cellen van de monocyt geslacht en de terminaal gedifferentieerde derivaten - macrofagen - vertonen een opvallende plasticiteit met betrekking tot hun biologische functie, waardoor hun betrokkenheid in zulke uiteenlopende processen ontwikkeling, weefselherstel en immuniteit 1. Dit laatste is te wijten aan hun fagocytaire en antigeen-presenterende capaciteit die macrofagen plaatst op het kruispunt tussen het aangeboren en adaptieve immuunrespons 2. Hun vermogen om cytokines, chemokines, groeifactoren en andere signaalmoleculen afscheiden 1 niet alleen verhoogt hun immuun modulerende functie maar ook dient als basis voor de aanvullende functies. Pogingen om deze verschillende activering stappen in de context van niet-microbiële gemedieerde aandoeningen hebben geleid tot de M1 en M2 categorieën 3 spiegelen. Hoewel deze indeling is niet compleet, het zorgt voor een fundamenteel begrip van macrofaag biologie. Door deze veelzijdige mogelijkheden het komt niet als een verrassing dat macrofagen worden geassocieerd met vele voorwaarden die op een bepaalde manier te betrekken weefselremodellering of ontsteking. Naast hun fundamentele rol in de erkenning en goedkeuring van de binnendringende ziekteverwekkers 4-6, zijn macrofagen steeds meer op de nadruk in atherosclerose, fibrose, obesitas en kanker 7-10. Een reproduceerbare werkwijze voor het genereren van humane macrofagen is daarom cruciaal voor het begrijpen van deze pathologieën. Hier presenteren we een methode waarbij de isolatie van humane monocyten uit het perifere bloed van gezonde donoren door een dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie techniek zoals eerder 11 beschreven. Om differentiatie tot macrofagen bevorderen, worden de geïsoleerde monocytische cellen geïncubeerd in de aanwezigheid van lage concentraties van M-CSF en normaal humaan serum 12. Om verdere behandeling en cel oogst te vergemakkelijken, wordt de differentiatie in zuurstofdoorlatende FEP uitgevoerdTeflon-coating celcultuur zakken met een hydrofoob oppervlak 12-15. De resulterende rustende macrofagen kunnen worden onderworpen aan diverse testen zoals ze nog kan reageren in hetzij een M1 of M2-achtige manier. Alternatieve methoden monocyt isolatie en daaropvolgende differentiatie zoals magnetische geactiveerde celsortering (MACS) of tegenstroom centrifugale elutriatie (CCE) enkele beperkingen met betrekking tot de opbrengst, kosten en tijd vereist. De hierin beschreven protocol biedt het voordeel dat het met standaard laboratorium apparatuur kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van speciale reagentia (bijvoorbeeld MACS magnetische beads) of inrichtingen (bijvoorbeeld CCE inrichting) en maakt de verwerking van grote hoeveelheden cellen.

<table><tbody><tr><td>Antibodies voor immunofenotypisering</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>bijvoorbeeld: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>bijvoorbeeld: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Axiovert 200M microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Combi-stopper sluitkegels</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, zonder Ca en Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>Voor PBS-EDTA (1 mM) voeg 1 ml 0,5 M EDTA toe per 500 ml PBS</td></tr><tr><td>10x PBS, zonder Ca en Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>Bereid een 0,5 M oplossing in H2O, gebruik een steriele filter</td></tr><tr><td>Celdissociatie buffer (enzymvrij, op PBS gebaseerd)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Ficoll (dichtheid 1,077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>LPS uit E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td><td>eindconcentratie: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (dichtheid 1,131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor spuit 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>opnieuw opgehangen in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Kunststof wegwerp Pasteur pipetten</td><td>LVL technologies</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>Opnieuw opgehangen in 500 &micro;l steriele H2O (c = 100 ng/&micro;l), gealiquoteerd</td></tr><tr><td>RPMI-1640 met fenol rood</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 zonder fenol rood</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisatiepapier</td><td>VP group</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw kleurstof (0,4% w/v)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon-gecoate celkweekzak, klein</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon-gecoate celkweekzak, groot</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van humane monocyten door double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in teflon-coating cell culture tassen

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Menselijke macrofagen betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan pathologische processen gaande van infectieziekten kanker. Zo vormen zij een waardevol instrument om de onderliggende mechanismen van deze ziekten te begrijpen. Daarom presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van humane monocyten uit buffy coats, gevolgd door een differentiatie procedure die leidt tot hoge opbrengsten macrofaag. De techniek berust grotendeels op algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, en derhalve een kosten en tijd efficiënte manier om grote hoeveelheden menselijke macrofagen verkregen. Kort buffy coats van gezonde bloeddonoren onderworpen aan een dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie monocyten oogsten uit het perifere bloed. De monocyten worden vervolgens gekweekt in gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP)-Teflon beklede celkweek zakken in aanwezigheid van macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF). Het gedifferentieerde macrofagen kunnen gemakkelijk worden geoogst en gebruikt voor verdere studies en functioneelzegt. Belangrijke methoden voor de validatie van de isolatie en differentiatie stappen zullen worden belicht in het protocol. Samengevat, de hier beschreven protocol kunnen wetenschappers routinematig en reproduceerbaar te isoleren menselijke macrofagen zonder dat kostenintensieve hulpmiddelen. Bovendien kan de ziekte van modellen worden bestudeerd in een syngenetische menselijk systeem te omzeilen het gebruik van muizen macrofagen.

De eerste dichtheidsgradiënt centrifugatie met Ficoll levert een witte interfase die de PBMC (figuur 1A) ie lymfocyten en monocyten. Dit kan worden bevestigd door een May-Grünwald kleuring (Figuren 1B en C) van de verzamelde cellen die zowel een hoge kern / cytoplasma-verhouding geeft (typisch lymfocyten) en Bean of ringvormige kernen (typisch monocyten). Wanneer deze cellen vervolgens op een tweede dichtheidsgradiënt middels Percoll geladen, kan de monocyten verder gescheiden van de lymfocyten en opnieuw verschijnen als witte interfase (figuren 1D-F). Per buffy coat beschreven dubbele dichtheid gradiënt centrifugatie routinematig levert 150 ± 40 x 10 6 monocyten die kunnen worden gedifferentieerd tot 70 ± 30 x 10 6 macrofagen (figuur 2) per buffy coat. De gemiddelde opbrengst van macrofaag20 onafhankelijke voorbereidingen was 47 ± 14% van het totaal geïsoleerde monocyten. Na de Percoll gradiënt centrifugatie kan er nog geringe niet-monocytische cellen aanwezig in het preparaat die afhankelijk is van de bloeddonor en de nauwkeurigheid van het isolatieproces. Na de differentiatie fase van 6-7 dagen, de bereiding bestaat voornamelijk uit rijpe macrofagen (figuur 3) die verder kan worden verrijkt door hun hechting aan kunststof oppervlakken, een eigenschap die niet wordt gedeeld door de random contaminerende cellen (Figuren 4A en B). Eenmaal geplateerd, de meeste macrofagen tonen een klassieke &quot;gebakken ei&quot; morfologie terwijl er ook cellen met een verlengde as fenotype (figuren 4C en D). Dit wordt weerspiegeld door de F-actine distributie binnen het cytoplasma en de hechting clusters. De gedifferentieerde cellenworden gekenmerkt door de expressie van CD45, CD14, CD16, CD206 (mannose receptor), CD11b en CD11c die kenmerkend markers voor rijpe macrofagen (figuur 5) zijn. De aanwezigheid van CD11b pleit tegen een overwegend dendritische differentiatie die wordt ondersteund door het feit dat de cellen negatief voor de dendritische cel marker CD209 (DC-SIGN). Na het differentiatieproces de cellen blijven functioneel en metabolisch actieve ongeveer 5-7 dagen (figuur 6) als het kan worden gevisualiseerd door calceïne AM kleuring en hun vermogen tot het nemen extracellulaire vesicles werpen van tumorcellen. Bovendien kunnen de cellen nog steeds geactiveerd zoals bijvoorbeeld voor de stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) die resulteert in de expressie van verschillende pro-inflammatoire genen (figuur 7). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figuur 1 Uiterlijk en samenstelling van de PBMC- en monocyt-laag na verloop dubbele dichtheid centrifugatie.&#39;s Toont (A) de PBMC-band na Ficoll gradiënt en (D) de monocyt-fase na de iso-osmotisch Percoll centrifugatie. May-Grünwald kleuringen van cytospin preparaten van de (B, C) ​​PBMC-fractie en de resterende (E, F) monocyten. Schaal bar = 200 urn B en E = 50 urn C en F. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figuur 2 Opbrengst van monocyten en macrofagen. Vertegenwoordiger cel tellingen van geïsoleerde monocyten en macrofagen van 20 buffycoat preparations. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figuur 3 Microfoto en celgrootte metingen van monocyten en macrofagen. Fase contrast microscopie van monocytische celsuspensie vóór (A) en na (B) macrofaag differentiatie. Overeenkomstige celgrootte histogrammen van monocyten (C) en macrofagen (D). Schaal bar = 100 urn. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figuur 4 morfologie en organisatie van het cytoskelet van hechtende macrofagen. Fasecontrastmicroscopie van hechtende macrofagen vóór (A) en na (B) verwijdering van niet-adherent cellen. (C, D) Phalloidin-TRITC kleuring van filamenteuze actine in hechtende, niet-gestimuleerde macrofagen. Schaal bar = 100 micrometer op AC, 20 pm in D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5 immunofenotype van gedifferentieerde macrofagen. Flowcytometrieanalyse van macrofagen na 6 dagen van differentiatie in FEP Teflon-coating celcultuur zakken (aangegeven in rood). De overeenkomstige isotypecontroles worden grijs weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Figuur 6 Opname van tumorcel microvesicles door macrofagen. Micrografen hechtende macrofagen na blootstelling aan PKH26-label (rood fluorescerend) tumor cel afkomstige microvesicles. Beelden worden overlay op de overeenkomstige (A) helderveld of (B) cytosolische kleuring met de levensvatbaarheid kleurstof calceïne AM. Schaalbalken = 100 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figuur 7 opregulatie van IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, en MT1-MMP na stining van macrofagen met LPS (100 ng / ml) gedurende 24 uur. Genexpressie werd bepaald door kwantitatieve RT-PCR van totaal RNA monsters (A) en genormaliseerd op HPRT1 en GNB2L1 expressie. De getoonde waarden zijn voudige veranderingen in vergelijking met de onbehandelde controle (gemiddelde ± SD, n = 5, p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa en IL-6 inductie onder LPS stimulatie werden verder bevestigd door ELISA (B) (gemiddelde ± SD, * p &lt;0,05).

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke macrofagen in grote hoeveelheid en hoge kwaliteit te genereren met standaard laboratoriumapparatuur. Dit wordt bereikt door eerst bloed uit Buffy coats te centrifugeren op een FI call-gradiënt om de P BMCs cs te verzamelen. Vervolgens worden op een per call-gradiënt de monocyten gescheiden van de lymfocyten.Vervolgens worden de monocyten uitgezaaid in met Teflon gecoate kweekzakken en gedifferentieerd. Na zes of zeven dagen worden de macrofagen geoogst en uitgezaaid voor vervolgstudies. De verkregen cellen moeten de typische markers van mature macrofagen tot expressie brengen en reageren op diverse stimuli, zoals cocultivatie met tumorcellen of stimulatie met LPS. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals counterflow-centrifugatie of magnetische cel sortering (MACS), is dat menselijke macrofagen kunnen worden gegenereerd met standaard laboratoriumapparatuur, zonder dat er dure reagentia of instrumenten nodig zijn.Hoewel deze methode eenvoudig uit te voeren is, kunnen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben met het visualiseren en scheiden van de verschillende celpopulaties in de dichtheidsgradiënten. Daarom zal een visuele demonstratie van deze stappen helpen om deze moeilijkheden te overwinnen. Dit protocol wordt in dubbeltoevoeging uitgevoerd om het balanceren van de rotoren te vergemakkelijken.Begin met het desinfecteren van twee zakken van de buffy coat-fractie van gelaagd bloed. Draag vervolgens de buffy coats over naar twee buizen van 50 milliliter voor elke buffy coat. Bereid drie buizen van 50 milliliter voor met 15 milliliters kamertemperatuur FI call-oplossing met een dichtheid van 1,077 g/mL.Breng nu langzaam en voorzichtig 30 tot 35 milliliter puffy coat in lagen aan op elke buis met FI call. De lagen mogen niet mengen. Centrifugeer deze buizen zonder te remmen bij 400 G gedurende een half uur. Bij kamertemperatuur zal er tussen de twee fasen een witte ring van perifere bloedmononucleaire cellen ontstaan.Verwijder deze lagen met een plastic pipet. Voeg de lagen van de drie buisjes per donor samen in twee buisjes van 50 milliliter per donor. Was de verzamelde cellen door 1 millimolair P-B-S-E-D-T-A toe te voegen tot de 40 milliliter lijn, en centrifugeer deze vervolgens gedurende 10 minuten bij 300 G zonder rem bij kamertemperatuur.Aspireer nu de supernatanten en gooi deze weg. Herhaal vervolgens de wasstap en resuspendeer de pellets van elke donor in P-B-S-C-D-T-A en voeg deze samen in 20 milliliters RPMI plus FCS zonder fenolrood. Er zou nu één buis met cellen per donor moeten zijn.Bereid nu het tweede dichtheidsgradiëntmengsel door 23,13 milliliter per call-oplossing op kamertemperatuur te mengen met 1,87 milliliter 10 XPBS in een buis van 50 milliliter. Bereid één buis van het mengsel voor elke twee monsters. Breng vervolgens 23 milliliter van het mengsel over naar een nieuwe buis van 50 milliliter.Voeg vervolgens 27 milliliters RPMI plus FCS met fenolrood toe. Het resultaat is een 46%ISO osmotische oplossing per cel. Breng nu voor elke donoroverdracht 25 milliliters van de 46%oplossing over naar een 50 milliliter buis en breng het celmengsel er voorzichtig in lagen op aan.De twee fasen moeten op basis van hun kleur van elkaar te onderscheiden zijn zonder onderbreking. Centrifugeer de cellen gedurende een half uur bij kamertemperatuur en bij 550 G. Een witte ring monocyten zal zich tussen de twee fasen verzamelen. Verzamel deze cellen in een buis van 50 milliliter met een plastic pipet.Was de monocyten met 1 mM PBS-EDTA, tot aan de markering van 50 ml. Centrifugeer ze vervolgens gedurende 10 minuten bij 400 G zonder remming bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelletteerde monocyten in 20 ml medium. Ga daarna verder met de volgende sectie.Dit protocol maakt gebruik van met FEP Teflon gecoate kweekzakken als kweekkamer. Begin met het schatten van het aantal verzamelde monocyten. Monocyten zijn groot en vaak onregelmatig van vorm.Tel de kleinere lymfocyten niet. Als er 100 tot 150 miljoen cellen van één donor beschikbaar zijn, bereid dan 180 milliliter aangevuld RPMI voor. Als er minder cellen zijn, bereid dan volumes van 30 milliliter medium voor per 30 tot 50 miljoen cellen.Meng de cellen voorzichtig in een aliquot van 20 milliliter met de 180 milliliter klaargezette medium. Vul vervolgens de kweekzak met de cellen met behulp van een perfu-spuit van 50 milliliter die is bevestigd aan de stop van de kweekzak. Verwijder de spuit, druk de resterende lucht eruit en sluit de stop af met een conus.Incubeer de zakken nu gedurende zes tot zeven dagen met 5% koolstofdioxide. Na zes tot zeven dagen incubatie worden de kweekzakken naar ijs overgebracht om de cellen te oogsten; dompel de zakken volledig onder in het ijs en laat ze één tot drie uur afkoelen om de cellen los te maken. Trek de zakken vervolgens voorzichtig ongeveer 10 keer over een rand.Desinfecteer vervolgens de buitenkant van de zakken grondig. Vervang de stopkegel door een spuit van 50 milliliter. Trek vervolgens de celсусpensie op en breng deze over naar een buis van 50 milliliter.Wanneer alle buisjes zijn verzameld, worden deze 10 minuten gecentrifugeerd bij 400 G bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het supernatant en pool alle cellen in 10 milliliters RPMI plus FCS. Tel daarna de cellen zoals voorheen. Tel alleen de macrofagen, aangezien er residuele lymfocyten aanwezig kunnen zijn.Gebruik vervolgens de cellen voor de gewenste toepassing om de kweekzakken opnieuw te gebruiken. Was deze tweemaal met 70%ethanol. Vul ze daarna met 50 milliliters 70%ethanol en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur; spoel de zakken de volgende dag drie keer met steriele PBS.Wikkel ze vervolgens in sterilisatiepapier en autoclaveer ze. Een zak kan gemakkelijk 10 keer worden hergebruikt voor de dichtheidsgradiënt. Centrifugaties leveren een witte interface op die lymfocyten en monocyten bevat.Hier onderzoeken we de eerste dichtheidsgradiënt van May-Grünwald. Kleuring van deze cellen vertoont zowel een hoge kern-cytoplasmaverhouding, typerend voor lymfocyten, als boon- of ringvormige kernen, typerend voor monocyten.Deze kleuringen tonen de resultaten van de tweede gradiënt. Elke buffy coat levert ongeveer 150 miljoen monocyten op, die gedifferentieerd kunnen worden tot ongeveer 70 miljoen macrofagen. In 20 preparaten werden 47% van de monocyten macrofagen.De gezuiverde macrofagen kunnen verder worden verrijkt door adhesie aan plastic oppervlakken, een eigenschap die de contaminerende cellen niet bezitten. Na het uitplaten vertonen de meeste macrofagen een morfologie die lijkt op een gebakken ei, terwijl andere een uitgerekt, spoelvormig fenotype hebben. De cellen worden gekenmerkt door de expressie van verschillende markers.Typisch voor mature macrofagen. De expressie van CD 11 B spreekt een dendritische differentiatie tegen, evenals het ontbreken van CD 2 0 9 expressie. Na de differentiatie blijven de cellen vijf tot zeven dagen functioneel en metabool actief.Calciumkleuring van levensvatbare cellen toont hun vermogen aan om rood gelabelde extracellulaire blaasjes op te nemen die door tumorcellen zijn uitgescheiden. Daarnaast kunnen de macrofagen worden geactiveerd; stimulatie met lipopolysaccharide resulteert bijvoorbeeld in de expressie van verschillende pro-inflammatoire genen. Na deze procedure kunnen de geïsoleerde macrofagen worden onderworpen aan een breed spectrum aan functionele assays om fundamentele vragen over de biologie van macrofagen bij gezondheid en ziekte te beantwoorden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u grote aantallen menselijke macrofagen kunt genereren. Het is echter belangrijk om te onthouden dat u werkt met menselijke bloedmonsters, die potentieel infectieus kunnen zijn.

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the isolation of monocytes from whole human blood by immunomagnetic negative separation. The isolated monocytes can be used for further downstream analysis.

Isolation of Monocytes from Whole Blood by Immunomagnetic Negative Selection

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

In this video, we demonstrate a procedure to induce the differentiation and polarization of peripheral blood-derived monocytes into M1 or M2 macrophages. Incubation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, lipopolysaccharide, and interferon‐gamma yields pro-inflammatory M1 macrophages, while incubation with macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4 induces anti-inflammatory M2 macrophage production.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.

Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het immunomodulerende potentieel van implantaatoppervlakken in vitro, met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige protocollen te verbeteren en verder onderzoek te bevorderen. Secretoire cytokineprofielen, mRNA-expressie en markers op het celoppervlak werden gecontroleerd met behulp van van bloedmonocyten afgeleide macrofagen om macrofaagpolarisatie te onderzoeken die op titanium werd gekweekt.

Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken 

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer hoe je humane monocyten isoleert via dubbele dichtheidsgradiëntcentrifugatie en differentieert tot macrofagen in Teflon-gecoate zakken. Deze methode levert hoge opbrengsten met standaard laboratoriumapparatuur.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen (Video) | JoVE Journal

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Meer video's verkennen