Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Het algemene doel van deze procedure is om in grote hoeveelheid en kwaliteit humane macrofagen te genereren met standaard laboratoriumapparatuur. Dit wordt bereikt door eerst bloed van Buffy-coats op een FI-call-gradiënt te centrifugeren om de P BMC's cs te verzamelen. Vervolgens worden de monocyten op een per call-gradiënt gescheiden van lymfocyten.

Vervolgens worden de monocyten ingeteeld in Teflon-gecoate celcultuurzakken en gedifferentieerd. Na zes of zeven dagen worden macrofagen geoogst en gezaaid voor verdere studies. De verkregen cellen moeten de typische markeringen van volwassen macrofagen vertonen en reageren op verschillende stimuli zoals co-cultivatie met tumorcellen of stimulatie met LPS. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals tegenstroming, centrifugatie of magnetisch geactiveerde celsortering, is dat humane macrofagen kunnen worden gegenereerd met standaard lipapparatuur zonder de noodzaak van dure reagentia of instrumenten.

Hoewel deze methode gemakkelijk uit te voeren is, kunnen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met het visualiseren en scheiden van de verschillende celpopulaties in de dichtheidsgradiënten. Daarom zal visuele demonstratie van deze stappen helpen om deze moeilijkheden te overwinnen. Dit protocol wordt in duplicaat uitgevoerd om het balanceren van de rotoren gemakkelijker te maken.

Begin met het desinfecteren van twee zakken van de buffy coat-fractie uit gelaagd bloed. Breng vervolgens de Buffy-coats over naar twee 50 milliliter buizen voor elke buffy-coat. Bereid drie 50 milliliter buizen met 15 milliliter kamertemperatuur FI call-oplossing bij 1,077 gram per milliliter voor.

Laag nu langzaam en voorzichtig 30 tot 35 milliliter van de puff-coat op elke buis van FI call. De lagen mogen niet mengen, centrifugeer deze buizen zonder te breken bij 400 G gedurende een half uur. Bij kamertemperatuur tussen de twee fasen zal zich een witte ring van perifere bloedmononucleaire cellen vormen.

Verwijder deze lagen met een plastic pipet. Combineer de lagen van de drie buizen van elke donor in twee 50 milliliter buizen per donor. Was de verzamelde cellen door een millimolair P-B-S-E-D-T-A toe te voegen tot aan de 40 milliliter lijn, en centrifugeer ze vervolgens bij 300 G gedurende 10 minuten zonder te breken bij kamertemperatuur.

Zuig nu de supernatanten op en gooi ze weg. Herhaal vervolgens de wassing en resuspendeer en pool de pellets van elke donor en 20 milliliter RPMI plus FCS zonder fenolrood in P-B-S-C-D-T-A. Er zou nu één buis cellen per donor moeten zijn.

Bereid nu de tweede dichtheidsgradiëntmix 23,13 milliliter kamertemperatuur per call-oplossing met 1,87 milliliter 10 XPBS in een 50 milliliter buis voor. Bereid één buis van de mix voor elke twee monsters voor. Breng vervolgens 23 milliliter van de mix over naar een nieuwe 50 milliliter buis.

Voeg vervolgens 27 milliliter RPMI plus FCS met fenolrood toe. Het resultaat is een 46%ISO osmotische per call-oplossing. Breng nu voor elke donor 25 milliliter van de 46%oplossing over naar een 50 milliliter buis en laag voorzichtig de celmix op.

De twee fasen moeten door hun kleuren onderscheidbaar zijn zonder onderbreking. Centrifugeer de cellen gedurende een half uur bij kamertemperatuur en bij 550 G. Een witte ring van monocyten zal zich tussen de twee fasen vormen. Verzamel deze cellen in een 50 milliliter buis met een plastic pipet.

Was de monocyten met een millimolair P-B-S-E-D-T-A, gevuld tot de 50 milliliter lijn. Centrifugeer ze vervolgens bij 400 G zonder te breken gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg en resuspendeer de gepelletiseerde monocyten in 20 milliliter medium. Ga vervolgens verder met de volgende sectie.

Dit protocol gebruikt FEP Teflon-gecoate cultuurzakken als kweekkamer. Begin met het schatten van het aantal verzamelde monocyten. Monocyten zijn groot en vaak onregelmatig gevormd.

Tel de kleinere lymfocyten niet mee. Als er 100 tot 150 miljoen cellen van één donor beschikbaar zijn, bereid 180 milliliter gesupplementeerd RPMI voor. Als er minder cellen zijn, bereid 30 milliliter volumes medium voor elke 30 tot 50 miljoen cellen voor.

In een 20 milliliter aliquot meng de cellen voorzichtig in de 180 milliliter bereide medium. Laad vervolgens de kweekzak met de cellen met een 50 milliliter perfu-spuit die is bevestigd aan de plug op de kweekzak. Verwijder de spuit, duw de resterende lucht eruit en sluit de plug af met een kegel.

Incubeer de zakken nu zes tot zeven dagen met 5% koolstofdioxide. Na zes tot zeven dagen incubatie, breng de kweekzakken naar ijs om de cellen te oogsten, dompel de zakken volledig in ijs en laat ze een uur tot drie uur afkoelen om de cellen los te maken. Trek vervolgens voorzichtig ongeveer 10 keer over een rand.

Desinfecteer vervolgens de buitenkant van de zakken grondig. Vervang de plugkegel door een 50 milliliter spuit. Trek vervolgens de celsuspensie uit en breng deze over naar een 50 milliliter buis.

Wanneer alle buizen zijn verzameld, centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 400 G. Bij kamertemperatuur, zuig nu het supernatant op en pool alle cellen in 10 milliliter RPMI plus FCS. Tel vervolgens de cellen als voorheen. Tel alleen de macrofagen, aangezien er resterende lymfocyten aanwezig kunnen zijn.

Gebruik vervolgens de cellen voor de toepassing van belang om de kweekzakken opnieuw te gebruiken. Was ze twee keer met 70% ethanol. Vul ze vervolgens met 50 milliliter 70% ethanol en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur. De volgende dag spoelt u de zakken drie keer met steriel PBS.

Wickel ze vervolgens in sterilisatiepapier en autoclaveer ze. Een zak kan gemakkelijk 10 keer worden hergebruikt, de dichtheidsgradiënt. Centrifugaties leveren een witte interface op die lymfocyten en monocyten bevat.

Hier onderzoeken we de eerste dichtheidsgradiënt. May Grunwald. Kleuring van deze cellen toont zowel een hoge