Name: Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer een methode voor acute hersentrauma bij muizen met longitudinale twee-foton imaging. Deze techniek maakt real-time observatie van celgedrag mogelijk voor onderzoek naar post-traumatische aandoeningen en therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn diep dankbaar aan Dr Frank Kirchhoff voor het verstrekken van GFAP-EGFP en CX3CR1-EGFP muisspanningen. Het werk werd ondersteund door subsidies van het Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland, Tekes, Fins voor Neurowetenschappen (FGSN) en de Academie van Finland.

Alle hier gepresenteerde procedures werden uitgevoerd volgens de plaatselijke richtlijnen voor de verzorging van dieren (De Finse Wet op dierproeven 62/2006). Animal licentie (ESAVI/2857/04.10.03/2012) werd verkregen van de lokale overheid (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Volwassen muizen van 1-3 maanden leeftijd, gewicht 24-38 gram werden in individuele kooien gehouden in de gecertificeerde Universiteit dierfaciliteit en voorzien van voedsel en water ad libitum. 1. Hersenletsel Imaging Via een Cranial Window <ol><li> Verlamming dieren en de voorbereiding van de werking veld <ol><li> Verdoven muizen door peritoneale injectie van een mengsel van ketamine (Ketalar, 80 mg / kg) en xylazine (Rompun, 10 mg / kg) opgelost in steriel gefiltreerd fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), pH 7,4. Controleer de muis reflexen regelmatig (staart en teen knijpen sonde) om de diepte van de anesthesie te controleren. Verhoog de dosis indien nodig, om de juiste verdoving handhaven, maar Overd voorkomenose. </li><li> Handhaaf het dier bij 37,0 ° C een verwarmingselement gebruikt tijdens chirurgische operatie, imaging sessie en eerste uur na het herstel van de anesthesie. </li><li> Voor de ogen van de muis beschermen tegen uitdrogen, gelden oog smeermiddel. </li><li> Dien dexamethason (Rapidexon dierenarts, 2 mg / kg) door subcutane injectie ontsteking en cerebraal oedeem te verminderen. </li><li> Dien een analgeticum (bijvoorbeeld Ketoprophene intraperitoneaal) tot 30 minuten vóór of onmiddellijk na de operatie. Als het dier vertoont geen pijn symptomen, zoals onwil om te bewegen, eten of drinken, of gewichtsverlies, speekselvloed, pilo-erectie, of abnormale respiratoire klinkt na de operatie, herhaal de injectie van pijnstillende. </li><li> Scheer de muis &#39;hoofd met een scheren machine (zie materialen en apparatuur). Voorkom beschadiging van de snorharen. </li><li> Behandel de huid op het hoofd van de muis met 70% ethanol oplossing van het geschoren gebied schoon. </li><li> Met behulp van chirurgische schaar (zie materialen enApparatuur) en pincet (zie materialen en apparatuur), snijd de huid van de middellijn tussen de oren op het voorhoofd. </li><li> Voorzichtig schrapen het bindweefsel vastgemaakt aan de schedel met een botte microchirurgische mes weg. </li><li> Schuif huid grenzen opzij en trek het oor bars iets in auditieve openingen van de schedel voor hoofd en huid fixatie. </li><li> Reinig de schedel met steriele PBS en behandelen plaats van de operatie op het hoofd van de muis met 0,5% chloorhexidinedigluconaat, dan drogen de schedel oppervlak met behulp van een combinatie van steriele wattenstaafjes en perslucht. </li></ol></li><li> Toebrengen van de prik letsel <ol><li> Plaats een klein dier stereotaxisch instrument met een dier houder (zie materialen en apparatuur). </li><li> Pas de positie van de binoculaire microscoop naast de stereotaxische apparaat te concentreren op het oppervlak van de schedel van het dier. </li><li> Met behulp van een binoculair microscoop, zoek het bregma punt op de schedel. </li><li> Identificeer de region van belang met behulp van de stereotactische coördinaten. OPMERKING: Vermijd die aandachtsgebieden die direct zijn gelegen boven oppervlakkige corticale schepen. Vernietiging van deze kunnen sterk van invloed op de trauma progressie. </li><li> Plaats de 30 G naald boven de gekozen regio en markeer de target site door krabben de schedel oppervlak. </li><li> Boor de schedel met alle mogelijke voorzorgsmaatregelen om onnodige verbreding van het aangetaste bot oppervlak te voorkomen. Gebruik een hoge snelheid chirurgische boor (zie materialen en apparatuur) onder de microscoop. Stop met boren als vloeistof wordt weergegeven in het geboorde gebied. </li><li> Raak de onderkant van de geboorde put met de naald. </li><li> Dompel de naald soepel in de hersenen (inbrengfrequentie 5-10 mm / min), de diepte van 0,5-2,0 mm volgens de coördinaten van de prik toedieningsplaats. </li><li> Verwijder de naald direct na het bereiken van de gewenste diepte (terugtrekkingssnelheid 5-10 mm / min) en veeg het bloed verschijnt na de prik met een kleine tampon (see materialen en apparatuur). </li><li> Voer micro-injectie van 100 uM Sulforhodamine 101 of een andere verbinding van belang in de laesie site met behulp van een micro-pomp (WPI) en 10 pi Hamilton spuit monteren met glazen pipet. LET OP: Tijdens de voorbereiding van de glazen pipet van borosilicaatglas capillaire, scherpen de tip om een ​​diameter van 10-20 micrometer. </li><li> Bezielen 250-1,500 nl van de injectie-oplossing met een snelheid van 2-5 nl / sec. OPMERKING: Laat de pipet na het einde van de infusie gedurende minstens 5 min in de hersenen parenchym, verwijder deze dan langzaam en voorzichtig om de oplossing uitstroom te voorkomen. </li></ol></li><li> Craniotomie voor chronische craniale venster <ol><li> Boor de schedel zachtjes en voorzichtig naar een cirkel venster rond het letsel site. Gebruik venstertje met een diameter van 3-3,5 mm. </li><li> Breng een druppel cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgSO 4 in gedestilleerd H2O) aan de wi te dekkenndow. </li><li> Plaats een ronde glazen dekglaasje (# 1.5 dikte) op de craniale venster. </li><li> Verwijder de overmaat aan cortex buffer rond het dekglaasje. </li><li> Dicht de randen van het dekglaasje met polyacryl lijm (zie materialen en apparatuur). OPMERKING: Controleer of de lijm niet wordt aangebracht op het bovenoppervlak van het dekglaasje. Als de dekking van glas is vervuild met lijm, wachten tot het glas stabiel is vastgelijmd aan de schedel en de lijm op het glas oppervlak droog wordt, verwijder dan zorgvuldig de verontreinigende lijm met een microblad. </li><li> 5 minuten wachten tot laat de lijm drogen. </li><li> Met behulp van het oor bar hoogte schroeven, past u de positie van het hoofd, zodat de metalen houder kan worden geplaatst. </li><li> Breng een kleine hoeveelheid van polyacryl lijm op de ring van de stalen houder (zie materialen en apparatuur). </li><li> Lijm de ring van de stalen houder aan de glazen dekglaasje met de metalen houder handvat naar achteren gericht. </li><li> 5 minuten wachten tot laat de lijm drogen. </li><li> Mix tandheelkundig cement (zie materialen en apparatuur) met polyacryl lijm in een 3,5 cm petrischaal (of analoge) viskeuze omstandigheden te bereiken. </li><li> Dicht de grenzen van de craniale venster met de cement + lijm mengsel en bedek het zichtbare oppervlak van de schedel met hetzelfde mengsel tot aan de grens huid. </li><li> Wacht 15 minuten om te laten de cement + lijmmengsel opdrogen en verwijder oor bars. </li><li> Voeren twee-foton excitatie microscopische (TPEM) beeldvorming voor de regio van belang en een controlegebied zoals beschreven in protocol 3. </li><li> Na beeldvorming, zodat het dier te herstellen van narcose op een verwarmingselement en bewaar het in een individuele kooi onder observatie tot volledig herstel. Nat voer kan worden gegeven aan kauwen en hydratatie vergemakkelijken. </li></ol></li></ol> 2. Hersenletsel Imaging Door de Verdunde Skull <ol><li> Verdovende dieren en de voorbereiding van de werking veld <ol><li> Verdoven van de muis en voor te bereiden voor trauma inductiezoals beschreven in stap 1.1. </li></ol></li><li> Schedel dunner en toebrengen van de prik letsel <ol><li> Plaats een klein dier stereotaxisch instrument met het dier houder (zie materialen en apparatuur). </li><li> Pas de positie van een binoculaire microscoop naast de stereotaxische apparaat te richten op de schedel oppervlak dier. </li><li> Zoek het bregma punt op de schedel met de binoculair microscoop, identificeren van de hersenen gebied dat moet worden afgebeeld op basis van stereotactische coördinaten en markeer deze door krabben. OPMERKING: Skull dunner positie mag zich niet boven of in de omgeving schedelnaden, zoals de schedel stabiliteit in het gedrang komt in die gebieden. Bovendien, grote corticale of meningeale vaten en hersenvliezen onder de schedel hechtingen zich waarschijnlijk beeldvormingsartefacten veroorzaken. </li><li> Plaats de metalen houder bekleed met lijm over het gebied van de rente op de schedel van het dier, van toepassing lichte druk en wacht 5 minuten totdat de metalen houder stevig vastgelijmd aan de schedel. </li&gt; <li> Meng tandheelkundig cement (zie materialen en apparatuur) met polyacryl lijm in een 3,5 cm petrischaal (of analoge) viskeuze omstandigheden te bereiken. </li><li> Dicht de randen van de metalen houder met de cement + lijm mengsel en bedek het zichtbare oppervlak van de schedel met hetzelfde mengsel tot aan de grens huid. </li><li> Wacht 15 minuten om te laten de cement en lijm mengsel opdrogen. </li><li> Spoel de verdunde schedel gebied en de aangrenzende delen van de metalen houder meerdere malen met PBS, waardoor de resten van nonpolymerized lijm worden weggewassen. OPMERKING: Het is cruciaal om een ​​stabiele bevestiging van de schedel te garanderen aan de houder. Dit maakt de bereiding stabiliteit tijdens de beeldvorming. </li><li> Met behulp van de hoge vergroting modus van de binoculair microscoop, verwijder de bovenste lagen van de schedel bot met een high-speed micro-boor een verdunde schedel gebied van ~ 0,5-1,5 mm in diameter te creëren. Gebruik perslucht bij het boren tot op het bot vuil te verwijderen. Voer het boren intermittently tijdens de dunning procedure om wrijving veroorzaakte oververhitting te voorkomen. Koel de boor met de oplossing bij kamertemperatuur en periodiek toepassen buffer om de verdunde gebied om warmte te absorberen. OPMERKING: Om schade aan de cortex te voorkomen, niet boren over grote regio&#39;s (&gt; 1,5 mm) tot een dunne laag (&lt;50 micrometer). OPMERKING: Het knaagdier schedelbot structuur bestaat uit twee dunne lagen compact bot gescheiden door een dikke laag sponsachtig bot. Tiny holten van het sponsachtige bot vorm concentrische cirkels en canaliculi, die de bloedvaten bevatten. Gebruik microboor kunnen zowel de compacta laag en de meeste sponsachtige laag te verwijderen. Verstoring van de bloedvaten in het sponsachtige bot kan bloedingen veroorzaken. Gebruik hemostase collageenspons om dit bloeden te stoppen. </li><li> Gebruik tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming te onderzoeken of de meerderheid van de sponsachtige bot is verwijderd. Wees voorzichtig om overmatig dunner te vermijden, zorg ervoor dat de resterende bot is thIcker dan 50 urn in dit stadium van de bereiding. </li><li> Een druppel buffer warme (35-37 ° C) boven het verdunde gebied. Gebruik een microchirurgische blad of Micro Finishing Bur om verder te verwijderen bot lagen en vormen een gladde oppervlakte van ~ 700 micrometer in diameter met bot dikte van ~ 20 micrometer. Tijdens deze stap, is het nuttig om repetitieve SHG imaging uitvoeren en meet regelmatig het bot dikte. </li><li> Voer TPEM beeldvorming voor de regio van belang en een controlegebied. </li><li> Pas de positie van het hoofd met de oor bar hoogte schroeven zodanig dat uitgedund regio wordt strikt horizontaal geplaatst. Plaats de naald boven de verdunde regio en zorg ervoor dat er geen grote schepen onder de gerichte website. </li><li> Maak een laesie door dompelen de naald in de hersenen, om de diepte van 0,5-2,0 mm van verdunde schedel oppervlak en volgens de coördinaten van de prik toedieningsplaats. </li><li> Verwijder de naald en onderdrukken bloeding verschijnen na thij acuut hersenletsel met hemostatische tampon (zie materialen en apparatuur). Wacht tot het vormen van bloedstolsels en schip pulsatie op de schade-site stopt. </li><li> Voer micro-injectie van 100 uM sulforhodamine 101 of een andere van belang zijnde verbinding in de laesie, zoals hierboven in sectie 1.2.10. </li><li> Voer TPEM beeldvorming om te controleren de schade progressie en herstel zoals beschreven in protocol 3. </li><li> Na beeldvorming, zodat het dier het bewustzijn van narcose op een verwarmingselement te herwinnen. Laat de dieren niet alleen laten en terug te sturen naar zijn kooi pas na volledige fysieke herstel. </li></ol></li></ol> 3. Imaging <ol><li> Plaats het dier onder de microscoop door het aanbrengen van de metalen houder aan de custom-built frame. </li><li> Voor de beeldvorming, gebruik bijvoorbeeld de FV1000MPE twee-foton microscoop uitgerust met Mai Tai DeepSee laser en XLPLN 25X 1,05 NA water immersie objectief geoptimaliseerd voor in vivo twee-fotonbeeldvorming. </li><li> Identificeer de laesie site onder de microscoop met wide-field fluorescentie-modus. Gebruik lange pass filters om hersenenvasculature visualiseren en selecteer het controlegebied volgens de waargenomen patroon van de bloedvaten. </li><li> Om het beeld van de tweede harmonische generatie (SHG) signaal, tunen van de femtoseconde laser om de 800 nm golflengte en verzamel het uitgezonden licht met behulp van de 380-410 nm bypass filter. Voor fluorescentie beeldvorming, gebruik de band pass filter (515-560 nm) om uitgezonden licht te verzamelen, en de volgende golflengten worden gebruikt om de fluorescentie op: GFP-860 nm, YFP-950 nm. </li><li> Gebruik FluoView software voor het acquisitie. </li><li> Store coördinaten van elke ROI voor volgend repetitieve beeldvorming. Afbeelding dezelfde ROI tijd en coördinaten passen telkens naar afbeelding overlap maximaliseren. </li><li> Analyseer beelden met de juiste software (bijv.. ImageJ). Reconstructies hier gepresenteerd werden gedaan met behulp van Imaris software. </li></ol>

<ol><li>Lighthall, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cortical+impact%3A+A+new+experimental+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model.</a> J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).</li>
<li>Lindgren, S., Rinder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+in+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysik%22%5BJournal%5D)">Experimental studies in head injury.</a> Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).</li>
<li>Shreiber, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+cerebral+contusion%3A+histopathological+and+immunohistochemical+evaluation+of+dynamic+cortical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).</li>
<li>Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+cortical+injury%3A+I.+Methodology+and+local+effects+of+contusions+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat.</a> Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).</li>
<li>Bardehle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+astrocyte+responses+to+acute+injury+reveals+selective+juxtavascular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation.</a> Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).</li>
<li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice%3A+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2001).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).</li>
<li>Carré, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+an+impact+acceleration+traumatic+brain+injury+rat+model+with+potential+suitability+for+both+microdialysis+and+PtiO2+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring.</a> J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-evoked+calcium+transients+in+somatosensory+cortex+are+temporarily+inhibited+by+a+nearby+microhemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage.</a> PloS one. 8 (5), (2013).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J. Vis. Exp. 61, (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hersentrauma is een abrupt, onvoorspelbare gebeurtenis. Hier beschrijven we de diermodel dat een spectrum van pathologische veranderingen waargenomen bij menselijke patiënten na hersenletsel zoals neurodegeneratie, eliminatie van dendrieten, hersenoedeem, gliale litteken, bloedingen in de cerebrale cortex in combinatie met focale subarachnoïdale bloedingen en verhoogde permeabiliteit van de reproduceert bloed-hersenbarrière. Primaire en secundaire pathogenese, evenals herstel na trauma te bestuderen, werd dit letsel mod...

Acuut hersenletsel is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid met een hoge incidentie van letsel bij auto-crashes, valt of aanvallen, en de hoge prevalentie van latere chronische handicap. Therapeutische benaderingen voor de behandeling van hersenbeschadiging blijven volledig symptomatisch, waardoor de doeltreffendheid van preklinische, chirurgische en intensive care beperken. Dit maakt de sociale en economische gevolgen van hersenletsel bijzonder ernstig. Om verschillende redenen, de meeste klinische onderzoeken kon verbeterd herstel na hersenletsel aangetoond middels nieuwe therapeutische benaderingen. Diermodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor een fase waarin drugdoeltreffendheid kan worden voorspeld bij patiënten met hersenletsel. Op dit moment is een aantal gevestigde diermodellen van hoofdtrauma bestaan, inclusief gecontroleerde corticale invloed 1, vloeistof percussie letsel 2, dynamische corticale vervorming 3, gewicht-drop4 en foto verwondingen 5. Een aantal experimentele modellen werden gebruikt om bepaalde morfologische, moleculaire en gedragsmatige aspecten hoofd-trauma geassocieerde pathologie. Echter, geen enkel dier model is volledig in het valideren van nieuwe therapeutische strategieën. Ontwikkeling van betrouwbare, reproduceerbare en gecontroleerde diermodellen van hersenletsel moet de complexe pathologische processen van. De nieuwe combinatie van de nieuwste microscopische beeldvorming technologieën en genetisch-gecodeerde fluorescerende reporters biedt een ongekende kans om alle fasen van hersenletsel, die de primaire letsel omvatten, het verspreiden van het primaire letsel, secundaire schade, en regeneratie onderzoeken. Vooral in vivo twee-foton microscopie is een unieke lineair optische technologie die real-time visualisatie van de cellulaire en subcellulaire structuren zelfs in diepe corticale lagen knaagdierhersenen maakt. Verschillende soorten cellen en orgaNelles tegelijkertijd worden afgebeeld door verschillende fluorescente merkers. Met behulp van deze krachtige tool, kunnen we dynamisch morfologische en functionele veranderingen te visualiseren in levende hersenen onder posttraumatische omstandigheden. De voordelen van in vivo twee-foton microscopie bestuderen hersenletsel werden onlangs aangetoond door Kirov en collega 6. Met behulp van een milde focale corticale kneuzing model, deze auteurs toonden aan dat acute dendritische verwonding in de pericontusional cortex is omheind door de daling van de lokale bloedstroom. Bovendien toonden zij aan dat het metabolisch gecompromitteerd cortex in de kneuzing terrein verder beschadigd door de verspreiding depolarisatie. Deze secundaire gevolgen heeft synaptische circuits, waardoor de gevolgen van traumatisch hersenletsel ernstiger. Hier stellen we de methode van stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige topische drug aanvraag, als een geavanceerd model voor lokale breinletsel en als een hulpmiddel om pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen hersenen van zoogdieren in vivo.

<table><tbody><tr><td>2A-sa dumb Tweezers, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; in needle</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>Animal trimmer, shaving machine</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Binocular Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Blunt microsurgical blade</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate tube with filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Voor glaspijpproductie</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine digluconate</td><td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Disposable drills</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&rsquo;s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ealing microelectrode puller</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Verticale puller voor glaspijpproductie</td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Foredom drill control</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom micromotor handpiece</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia platform for mice</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>Geassembleerd op stereotactisch instrument</td></tr><tr><td>Hemostasis Collagen Sponge</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal holder</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdressing forceps, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>Micro spuit vulcapillairen</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Laser Scanning Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Syringe 10 &mu;l</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton spuit</td></tr><tr><td>Nonwoven swabs 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Chirurgische tampons</td></tr><tr><td>Polyacrylic glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Round glass coverslip&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 dikte&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small animal stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting mouse and neonatal rat adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Geassembleerd op stereotactisch instrument.</td></tr><tr><td>Student iris scissors, straight 11.5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Molecular Probes</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>Microinjector en controller</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

acute brain trauma in muizen gevolgd door longitudinale twee-foton imaging

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Hoewel acuut hersenletsel vaak voort uit hoofd beschadiging verschillende ongevallen en een substantieel deel van de bevolking, is er geen effectieve behandeling voor is. Beperkingen van de momenteel gebruikte diermodellen belemmeren begrip van de pathologie mechanisme. Multifoton microscopie kan bestuderen cellen en weefsels in intacte hersenen van dieren langsrichting onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we twee modellen van acuut hersenletsel onderzocht door middel van twee-foton beeldvorming van de hersenen celgedrag onder posttraumatische omstandigheden. Een geselecteerd gebied van de hersenen wordt verwond met een scherpe naald om een ​​trauma van een gecontroleerde breedte en diepte in de hersenen parenchym produceren. Onze methode maakt gebruik stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige drug toepassing. We stellen dat deze methode kan worden gebruikt als een instrument om geavanceerde cellulaire mechanismen van pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen zoogdierhersenen <em&gt; In vivo. In deze video, combineren we acuut hersenletsel met twee bereidingen: craniale venster en schedel dunner. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van zowel de voorbereidingen voor multisessie beeldvorming van de hersenen regeneratie na een trauma.

1) chronische craniale venster en 2) de schedel dunner, voor posttraumatische beeldvorming van de hersenen in transgene muizen: We hebben twee operatie procedures geoptimaliseerd. Schematische weergave van de experimentele preparaten wordt getoond in Figuur 1. Traumatische prik door stalen naald van 0,3 mm OD (30 G) wordt toegepast op de geboorde put (Figuur 1A). Een succesvolle craniale venster voorbereiding beeldvorming maakt het mogelijk tot een diepte van 650 micrometer onder de pia...

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Hallo, ik ben Michel iv, postdoctoral onderzoeker bij het Neuroscience Center van de Universiteit van Helsinki. Hallo, ik ben Hel Stein, promovendus aan de Universiteit van Helsinki. In deze video beschrijven we een methode voor het toebrengen van een lokaal acuut trauma aan het brein van een muis voor daaropvolgende foto-imaging van het gedrag van hersencellen en posttraumatische condities.Acuut hersenletsel is een ernstige pathologie die een aanzienlijk deel van de bevolking in ontwikkelde landen treft. Multifotonmicroscopie maakt het mogelijk om cellen in hun weefselcontext te bestuderen in een levend knaagdierbrein onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een methode voor acuut hersenletsel, toegepast als een stereotactische prik met een injectienaald, gevolgd door tweefoton-imaging van het gedrag van hersencellen en de posttraumatische omstandigheden.De methode van stereotactische toediening van lokaal hersenletsel is een instrument om de pathofysiologische gevolgen van acuut trauma te bestuderen. In het brein van zoogdieren kan een specifieke hersenregio gericht worden aangepakt en beschadigd met een scherpe naald om een trauma van de gewenste breedte en diepte in het hersenparenchym te veroorzaken. In deze video gebruiken we acuut hersenletsel in combinatie met procedures voor een craniële window of schedelverdunning, gevolgd door tweefoton-imaging van neuronen en glia in het posttraumatische brein.Alle hier gepresenteerde experimenten zijn uitgevoerd volgens de reglementen voor dierproeven van de Universiteit van Helsinki; de muis wordt geanestheseerd door intraperitonele injectie van ketamine en xylazine. Er wordt een stuk huid verwijderd om de schedel bloot te leggen, waarna het dier wordt gefixeerd met oorstaven op de warmtetafel die is bevestigd aan de stereotactische manipulator. Een spuit met een stalen naald van 0,3 millimeter diameter is bevestigd aan de micro-injectieopstelling.De opstelling voor micro-injectie stelt ons in staat om een traumatische prik toe te dienen in een gedefinieerd hersengebied; met behulp van een binoculaire microscoop bepalen we het bregma-punt op de schedel. We identificeren het interessegebied aan de hand van de stereotactische coördinaten. We boren de schedel voorzichtig en nauwkeurig door op het gemarkeerde punt met een chirurgische hogesnelheidsboor.We brengen de prik aan in de geboorde opening en dompelen de naald kortstondig 0,5 tot twee millimeter diep in de hersenen, uitgaande van het niveau van de bodem van de opening. Een opmerkelijk voordeel van deze methode is dat we DI of geneesmiddelen in dezelfde kleine opening kunnen injecteren en oplossingen zo nauwkeurig op de beschadigde plaats kunnen afleveren. Voor het toedienen van oplossingen aan de cortex gebruiken we een micro-injector met elektronische controller en een spuit van 10 µL bevestigd aan een stereotactische manipulator.Wanneer de punt van de glazen pipette het oppervlak van de hersenen raakt, dipsen we deze nog 0,5 tot 1 mm verder naar beneden. Vervolgens gebruiken we de micro-injectiecontroller om 0,5 tot 2 µL van de D- of drugsolutie in de hersenen te injecteren met een snelheid van 5 nL per seconde. Daarna wordt het bot voorzichtig rondom de letselplaats aangeboord en wordt het ronde stuk schedel verwijderd.Het breinoppervlak wordt gespoeld met een cortexbuffer en een dun, rond dekglas wordt op de schedelopening geplaatst. Het dekglas wordt afgedicht met polyacrylamidelijm en de stalen houder wordt bovenop het dekglas gelijmd. Om een stevige bevestiging van het craniële venster aan de schedel te garanderen, wordt er tandheelkundig cement rondom de houder aangebracht.De genarceerde muis wordt op de tweefotonmicroscoop geplaatst en cellen worden afgebeeld op de plaats van het letsel in de levende hersenen. Deze afbeelding is drie uur na het hersenletsel genomen. De letselplaats wordt getoond in de hersenen van een transgene muis die GFP tot expressie brengt onder de GFAP-promotor in astrocyten.Naast de GFP-expresserende groene astrocyten zijn veel astrocytaire cellen rood gekleurd door de injectie van sulfur rumine 1 0 1. De witte vezels vertegenwoordigen het signaal van de tweede harmonische generatie, wat vermoedelijk de vezelstructuren in de extracellulaire matrix visualiseert. De tweede harmonische generatie blijkt een waardevol instrument te zijn om de plaats van het letsel af te bakenen.Het signaal wordt uitgezonden door niet-centrosymmetrische structuren, zoals eiwitvezels, en vereist geen exogene kleuring. Het signaal van de tweede harmonische generatie is het meest intens aan het breinoppervlak en verspreidt zich niet diep in het hersenparenchym. In deze afbeelding is de ophoping van geactiveerde microglia op de plaats van het letsel te zien.De microgliacellen worden in het groen weergegeven en de tweede harmonische generatie in het grijs. In de nabijheid van de letselplaats vertonen geactiveerde microglia een kenmerkende morfologie met weinig vertakkende processen tijdens het voorbereiden van het schedeloppervlak. Gebruik stereotactische coördinaten om het te beelden hersengebied te lokaliseren en markeer dit met een pen.Vermijd interessegebieden die direct boven de craniale hechtingen liggen, omdat de schedel in deze gebieden minder stabiel is en omdat de onderliggende grote vaten in de meninges de beeldkwaliteit zullen beïnvloeden. Plaats de met lijm gecodeerde schedelhouder met minimale druk over het interessegebied op de schedel van het dier. Breng vervolgens tandheelkundig cement rond de houder aan en wacht ongeveer vijf minuten tot de schedelhouder stevig aan de schedel is vastgeplakt.Was de opening van de schedelhouder meerdere keren met PBS om de resterende niet-gepolymeriseerde lijm te verwijderen. Maak onder een binoculaire microscoop een circulair gebied van de schedel dun, doorgaans 0,5 tot 1,5 millimeter in diameter, boven de regio van belang. De muisschedel bestaat uit twee dunne lagen compact bot en een dikke laag sponsachtig bot die daartussen is gesandwiched.Het sponsbeender bevat kleine holtes die in concentrische cirkels zijn gerangschikt en meerdere canaliculi waarin bloedvaten lopen; verwijder bij het uitdunnen de buitenste laag compact bot en het grootste deel van het sponsbeender. Gebruik een hogesnelheidsmicroboor en gebruik tijdens het boren perslucht om het botdebris weg te blazen. Voer het boren intermitterend uit om oververhitting van het bot door wrijving te voorkomen.Koel het geheel af in het vloeistofbad bij kamertemperatuur en breng periodiek de cortexbuffer aan op het verdunningsgebied om de warmte te observeren. Tijdens het verdunningsproces kan er enige bloeding optreden vanuit de vaten die door het sponsachtige bot lopen. Deze bloeding zal gewoonlijk binnen enkele minuten spontaan stoppen.Gebruik second harmonic generation-beeldvorming om er zeker van te zijn dat het grootste deel van dit spongieuze botweefsel is verwijderd. In dit stadium mag de dikte van de schedel niet minder zijn dan 50 micrometers. Dompel de schedel onder in een druppel cortexbuffer en ga verder met de procedure voor het dunner maken van de schedel met behulp van een microsurgisch mesje of een micro-afwerkboor om in de laatste fase van het dunner maken een zeer dunne en gladde preparatie van ongeveer 20 micrometers dik en 700 micrometers in diameter te verkrijgen; controleer de preparatie tijdens dit proces herhaaldelijk met second harmonic generation-beeldvorming.De gekozen regio kan worden afgebeeld vóór en na het toebrengen van het letsel. Verschillende gebieden van de dunne regio moeten worden afgebeeld om te controleren op mogelijke artefacten die door de chirurgie zijn veroorzaakt bij het toebrengen van het trauma. Plaats de naald boven de dunne regio.Zorg ervoor dat er geen grote bloedvaten direct onder de locatie liggen. Steek de naald 0,5 tot twee millimeter diep in de hersenen, overeenkomstig de coördinaten van de insteekplaats. Verwijder de naald en stel bloedingen die optreden na het acute hersenletsel stil.Wacht met een hemostatische tampon tot de bloedstolsels zijn gevormd en de pulsatie op de plaats van het letsel is afgenomen. Oplossingen die bijvoorbeeld sulfur Rumine 1 0 1 of andere kleurstoffen bevatten, kunnen op dezelfde manier in de wondopening worden geïnjecteerd als hierboven gedemonstreerd voor de preparatie van het craniële venster. In tegenstelling tot het craniële venster bij de preparatie van schedelverdunning kan de plek van het letsel herhaaldelijk worden benaderd voor het toedienen van geneesmiddelen en kleurstoffen.Het handhaven van de steriliteit bij alle handelingen helpt om het uitgedunde gebied transparant te houden door ontsteking te voorkomen. Hier ziet u de afbeelding van de letselplaats na het uitdunnen van de schedel. Op de afbeelding aan de linkerkant is de zijde van het letsel te zien, omringd door YFP-gelabelde dendrieten van corticale neuronen 20 minuten na het trauma.De rechter afbeelding representeert hetzelfde hersengebied in hetzelfde dier vijf dagen na het trauma. In deze afbeelding ziet u een ander voorbeeld van twee-foton microscopie van de hersenen. Na het dunner maken van de schedel is het bot zichtbaar via het signaal van tweede harmonische generatie, weergegeven in grijs.In het linkerpaneel zijn de microglia in het groen weergegeven. In deze experimentele opstelling kunnen de microglia onder het bot rondom de letselplaats worden waargenomen, zoals getoond in het rechterpaneel. In de huidige studie hebben we zowel de chronische craniale window- als de schedelverdunningspreparaten gebruikt om het celgedrag onder posttraumatische omstandigheden in de levende hersenen te bestuderen.Beide methoden hebben bepaalde voordelen en beperkingen. Het chronische craniale venster biedt een betere resolutie, een diepere penetratie in het hersenweefsel en het gemak van meerdere beeldvormingssessies. Aan de andere kant is de kans dat de procedure voor schedelverdunning ontstekingen veroorzaakt op de beeldvormingslocatie kleiner, en maakt het herhaaldelijke toedieningen van geneesmiddelen en kleurstoffen mogelijk.

acute-brain-trauma-in-mice-followed-by-longitudinal-two-photon-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

This video demonstrates the delivery of Traumatic Brain Injury (TBI) in mice. After exposing the skull, the TBI site is marked. The mouse is then positioned under the TBI device. The impact is delivered by lifting the metal rod and allowing it to drop freely onto the impactor, which is in contact with the skull.

Delivery of a Traumatic Brain Injury to a Mouse Brain

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Atleten absorberen jaarlijks enkele honderden milde traumatische hersenletsels (mTBI) / hersenschudden; Het gevolg van deze op de hersenen is echter slecht begrepen. Daarom, een diermodel van enkelvoudige en herhalende mTBI die consequent repliceren klinisch relevante symptomen, biedt de middelen om de studie van mTBI en hersenschudding te bevorderen.

Een muismodel van een- en herhalende milde traumatische hersenbeschadiging

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Het protocol beschrijft licht traumatisch hersenletsel in een muismodel. In het bijzonder wordt een stapsgewijs protocol om een milde middellijn gesloten hoofdletsel en de karakterisering van het diermodel te induceren volledig uitgelegd.

Elektromagnetisch gecontroleerd gesloten-hoofd model van mild traumatisch hersenletsel bij muizen

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Pseudofracture, een reproduceerbaar muizenmodel van steriele trauma van het bewegingsapparaat, maakt voor de evaluatie van late term post-traumatische immuunrespons. Dit artikel beschrijft de procedurele uitvoering van het model stap voor stap, met inbegrip van de mogelijkheid voor experimentele model combinaties te bestuderen van meerdere trauma mogelijk te maken.

Pseudofracture: Een acute perifere Tissue Trauma Model

Leer een methode voor acute hersentrauma bij muizen met longitudinale twee-foton imaging. Deze techniek maakt real-time observatie van celgedrag mogelijk voor onderzoek naar post-traumatische aandoeningen en therapeutische strategieën.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Meer video's verkennen