Name: Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca 2 + Signalen in reeksen afbeeldingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Leer een geautomatiseerde ROI-analyse voor endotheliale Ca²⁺-activiteit in varkenscoronaire arteriën. Deze methode vermindert gebruikersbias en verhoogt de efficiëntie bij cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 en MOP-93676.

1. Vessel Dissection en Imaging <ol><li> Oogst weefsel van binnenlandse juveniele varkens zoals beschreven in Martens et al. 27. Plaats geoogst varkens rechterventrikel in een polydimethylsiloxaan (PDMS) bodem dissectie schotel met HEPES gebufferde fysiologische zoutoplossing (PSS). <ol><li> Met behulp van een stereomicroscoop, ontleden en verwijderen van een segment van de linker anterieure dalende kransslagader (~ 8 mm lengte, 0,5 mm diameter) van omringende weefsel met behulp van een tang en veer schaar door het verwijderen van het segment vaartuig het omringende hartweefsel lagen. OPMERKING: Zorg ervoor dat de vaatwand niet doorboren. </li><li> Plaats een PDMS blok (1 x 0,5 x 0,5 cm) in de dissectie schaal, en gebruik een naald om het vastmaken aan de bodem. Snij een ongeveer 40 micrometer diameter wolfraam draad in twaalf ~ 0,3 cm lengte segmenten, vormen micropins, en plaats deze in de schotel. Behulp van een tang, veilig ene uiteinde van het segment vaartuig naar het blok met een micropin. </li><li> Steek kleine lente een schaar in het lumen van het vat, en snijd lengterichting langs een kant van het schip om het volledig te openen. Richt het geopende vat segment met de endotheel omhoog. </li><li> Gebruik de resterende micropins de randen van de geopende bloedvatsegment veilig blokkeren zodat het vaartuig vormt een vlakke rechthoek. OPMERKING: Micropin toppen moeten worden gebogen tot 90 ° en ingebracht tot gelijk met het blok oppervlak. Zorg moeten worden genomen om de voorbereiding vat uitrekken zonder overstrekken; uiteindelijke breedte moet worden ~ 1,5 x het starten zonder rek breedte. </li><li> Bereid een klein volume (~ 1 ml) van TL 04:00 beladingsoplossing door mengen Fluo-4 AM (10 uM) opgelost in DMSO met pluronic (0,03%) in een HEPES gebufferde PSS (die in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose) en plaats het gehele blok in de laad oplossing gedurende ongeveer 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Na het laden, was het blok in HEPES gebufferdPSS gedurende 5-10 minuten. </li><li> Monteer het blok op 50-100 um dikke afstandhouders in een dekglaasje onderste kamer met HEPES gebufferd PSS. OPMERKING: Metalen kunnen worden gebruikt als afstandhouders en waarborgen het segment schip naar beneden en de afstandhouders niet raken. </li><li> Plaats de ruimte op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust voor confocale beeldvorming en focus op de endotheliale cellaag. </li><li> Capture time beeld lapse sequenties van basale relatieve fluorescentie voor ~ 3 min bij 20x vergroting en een beeldsnelheid van ~ 8 beelden per seconde met behulp van beeld confocale sequence acquisitie software. </li><li> Na ca. 3 min. opnametijd basale fluorescentie vervangen HEPES gebufferde PSS oplossing met hetzelfde volume (~ 1 ml) van Substantie P (100 pM) opgelost in HEPES gebufferd PSS, en opnemen van een additionele 3 minuten. </li></ol></li></ol> 2. Geautomatiseerde analyse <ol><li> Render afbeelding sequentie (s) van fluorescente calcium activiteit van confocale acquisitie software als 8 bit, grayscale &#39;. tif&#39;-bestanden zonder schaal informatie. </li><li> Open ImageJ, klikt u op &#39;open&#39; in het menu Bestand, en selecteer de juiste reeks beelden in de verkenner om het beeld sequentie (s) in ImageJ bekijken. </li><li> Bepaal een geschikte ROI diameter met het rechthoekige ROI gereedschap te schatten de bovenste en onderste grenzen van de ruimtelijke spreiding van activiteit in het beeld sequentie (s). OPMERKING: De gemiddelde rechthoekige doorsnede is een geschikte keuze voor ROI diameter. </li><li> Maak een nieuwe map op de harde schijf, en voeg het beeld sequentie (s) in de map directory. </li><li> In ImageJ, klikt het venster &#39;plugins&#39;, klik op &#39;LC_Pro&#39; om de analyse te starten. </li><li> Voer de waarde diameter ROI en selecteer het filter drempelwaarde (ofwel 0,05 of 0,01). </li><li> Klik op het selectievakje &#39;medicamenteuze behandeling&#39; en voer het tijdstip waarden onmiddellijk vóór en na de drug werd toegevoegd (in seconden). </li><li> Klik op &#39;ok&#39;, envoer de beeldsequentie directory in de file explorer venster. </li></ol> 3. Grafische uitvoer <ol><li> Download R versie 3.0.2 van <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Open de 32 bits versie van R. </li><li> Klik op &quot;bestand&quot;, vervolgens &#39;open script&#39; en selecteer de &#39;traceplot.R&#39; R-script voor het genereren van grafische experimentele rapporten. </li><li> Installeer het kalibreren, en gplots pakketten door &#39;pakketten&#39;, &#39;install packages&#39;, en het selecteren van de dienstige pakketten. </li><li> Klik op &#39;file&#39; en dan &#39;change directory&#39; commando, en gebruik de Explorer-venster naar de map die overeenkomt met de LC_Pro analyse uitvoer te selecteren. </li><li> Klik op het script-venster en vervolgens de &#39;run all&#39; commando om het script uit te voeren. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Decoderen van complexe Ca 2 +-signalen op cellulair en meercellige niveau strenge experimentele en analytische benaderingen vereisen. Hier wordt een aanpak beschreven waarin tijdsopgeloste beeld confocale sequenties van Ca2 +-afhankelijke fluorescentie worden onderworpen aan een geautomatiseerde analyse die statistisch relevante Ca2 + signalen in intacte cellulaire domeinen In het specifieke geval gepresenteerd identificeert en kwantificeert, een slagader segment geïsoleerd van varken ha...

Ca 2 + is een alomtegenwoordige tweede boodschapper signalering molecuul en cytosolische Ca 2 + niveaus zijn sterk gereguleerd. Intracellulaire Ca 2 +-signalen zijn complex en omvatten geïsoleerde transiënten, trillingen en golven propageren 1-4. Ruimtelijke en tijdelijke besturing van Ca2 + wordt gedacht fysiologische signaal specificiteit ten grondslag liggen, en derhalve de analyse van Ca2 + signaal patronen van groot belang voor onderzoekers in meerdere velden 5. Ca 2 +-indicator kleurstoffen zoals Fluo-4 en Fura-2 worden gewoonlijk gebruikt om intracellulaire Ca2 +-signalen meten met fluorescentiemicroscopie 5-12. Meestal worden tijdelijke Ca 2 +-signalen geëvalueerd als tijdsafhankelijke veranderingen in de gemiddelde fluorescentie binnen een door de gebruiker gedefinieerde gebied of regio van belang (ROI) 5,6,13 - 16. Momenteel handmatige ROI-analyse is zowel tijdrovend en arbeidsintensief inSpannend, want het vereist dat gebruikers veel ROI&#39;s te identificeren en uit te voeren repetitieve berekeningen 17-19. Deze technieken kunnen ook onderhevig zijn aan aanzienlijke fouten van gebruikers, met inbegrip van de invoering van kunstmatige signaal modes en uitsluiting van lage amplitude of diffuse signalen 18,20. Geautomatiseerde ROI detectie algoritmen eerder zijn uitgevoerd met verschillende statistische benaderingen optimale ROI plaatsing bepalen, maar over het algemeen beperkt tot de analyse van lijn scan of pseudo-line scans, die analyse beperkt tot een ruimtelijke dimensie tijd 17 19-22. Daarnaast hebben veel bestaande algoritmen niet toereikend zijn om de diversiteit van de Ca 2 + gebeurtenissen release die variëren van periodieke, gelokaliseerde transiënten op teeltmateriaal golven 23,24 omvatten. Uitgebreide evaluatie van fysiologische Ca 2 +-signalen wordt vaak verder gecompliceerd door de aanwezigheid van aanzienlijke image artifhandelen die verwart signaal om discriminatie ruis in veel experimentele systemen. Voorheen, een geautomatiseerde ROI algoritme oplossing Ca2 + signaal transiëntdetectie, uitgevoerd als een plugin voor NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), werd ontwikkeld en gevalideerd 25,26. Dit algoritme, genaamd LC_Pro, werd ontworpen om ROI allesomvattende Ca 2 + transiënten signaal in twee-dimensionale time lapse beeld sequenties te identificeren en te analyseren. Hier een praktische experimentele protocol en representatieve demonstratie van een toepassing van het algoritme in varkens coronaire endotheel is voorzien, met extra postprocessing met behulp van de open source statistische verwerking software R bruikbare grafische output te genereren.

<table><tbody><tr><td>Dissectiebakje</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>elastomer kit, moet in bakjes worden gegoten</td></tr><tr><td>HEPES-gebufferd PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES-zuur</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon Inst.</td><td>#MNA42000</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Verenschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamdraad</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td>#P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Metalen pinnen</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Kamer met glazen bodem</td><td></td><td></td><td>Op maat ontworpen</td></tr><tr><td>Spinning disc confocale microscoop</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">downloaden op: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin voor imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">downloaden op: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">downloaden op: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">downloaden op: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde analyse van dynamic ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; signalen in reeksen afbeeldingen

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellulaire Ca2 + signalen worden vaak bestudeerd fluorescente Ca2 + indicator kleurstoffen en microscopische technieken. Echter, kwantitatieve analyse van Ca 2 + beeldgegevens is tijdrovend en onder voorspanning. Geautomatiseerde signaalanalyse algoritmes gebaseerd op de regio van belang (ROI) detectie is geïmplementeerd voor een-dimensionale lijn scan metingen, maar er is geen stroom algoritme dat geoptimaliseerd identificatie en analyse van ROI in twee-dimensionaal beeld sequenties integreert. Hier een algoritme voor snelle acquisitie en analyse van ROI in beeld sequenties wordt beschreven. Het maakt gebruik van ellipsen passen aan lawaai gefilterde signalen om een optimale ROI plaatsing bepalen en berekent Ca 2 +-signaal parameters van amplitude, duur en ruimtelijke spreiding. Dit algoritme werd geïmplementeerd als een vrij beschikbare plugin voor ImageJ (NIH) software. Samen met analyse scripts geschreven voor de open source statistische verwerking software R,Deze aanpak zorgt voor een hoge capaciteit pijpleiding voor het uitvoeren van snelle statistische analyse van de output. De auteurs suggereren dat het gebruik van deze analyse protocol leidt tot een meer volledige en onpartijdige karakterisering van fysiologische Ca2 +-signalen.

Een aangepaste algoritme, LC_Pro, werd ontwikkeld en geïmplementeerd om geautomatiseerde analyse van Ca 2 + uitvoeren dynamiek op confocale afbeelding sequenties. Zoals weergegeven in figuur 1, het algoritme gebruikt sequentiële procesmodules A) detecteren en volgen plaatsen dynamische Ca2 + wijzigen hierboven statistisch (p &lt;0.01) ruis, B) definiëren gebieden van belang (ROI) automatisch actieve plaats centra en C) bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten ROI specifiek...

Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio&#39;s positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca 2 +-signalen met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de endotheliale calciumactiviteit in varkensslagaders van de kransslagader te analyseren met behulp van geautomatiseerde ROI-analyse. Dit wordt bereikt door varkensslagaders van de kransslagader te dissekeren en te openen om in een tweede stap de endotheliale calciumactiviteit te meten. De geautomatiseerde ROI-analyse wordt uitgevoerd op de verkregen calciummetingen, wat resulteert in een samengevat overzicht van de calciumactiviteit.Vervolgens worden er softwarescripts uitgevoerd op de output om de resultaten van de calciumactiviteitsanalyse statistisch te analyseren en grafisch weer te geven, waardoor resultaten worden verkregen die de parameters van de calciumsignaaltransiënten tonen op basis van de geautomatiseerde ROI-analyse en statistische verwerking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige ROI-analyse, is dat geautomatiseerde analyse sneller is, uitgebreider is en minder gevoelig is voor gebruikersfouten. Plaats bij deze procedure de geoogste rechter ventrikels van varkens in een A-P-D-M-S dissectieschaal met een vlakke bodem die HEPES-gebufferde fysiologische zoutoplossing bevat.Verwijder onder de stereomicroscoop een segment van de linker anterior descenderende kransslagader door deze te dissekeren uit de omringende weefsellagen van het hart. Let erop dat de vaatwand niet wordt doorgeprikt. Plaats vervolgens het PDMS-blok in de dissectieschaal en zet het met een naald vast aan de bodem.Voeg buffer toe aan de schaal. Knip vervolgens een wolfraamdraad met een diameter van ongeveer 40 micron in 12 segmenten van 0,3 centimeter lengte om micropinnen te vormen en plaats deze in de schaal. Gebruik de pincet om één uiteinde van het vatsegment met een micropin aan het blok te bevestigen.Voer de kleine veerscharen voorzichtig in het lumen van het vat in en knip langs één zijde van het vat in de lengte om het volledig te openen. Orienteer daarna het geopende vatsegment zodanig dat het endotheel naar boven is gericht. Gebruik de resterende micropinnen om de randen van het geopende vatsegment aan het blok te bevestigen, zodat het vat een platte rechthoek vormt.Bereid vervolgens één milliliter flu oh 4:00 AM laadoplossing. Plaats het gehele blok gedurende ongeveer 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker in de laadoplossing; was na het laden het blok met heaps gebufferde PSS gedurende vijf tot 10 minuten. Monteer het blok vervolgens op spacers met een dikte van 50 tot 100 micron in een kamer met een bodem van dekglas die heaps gebufferde PSS bevat.Plaats de kamer op de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust voor confocale beeldvorming en focus op de endotheliale cellaag. Gebruik software voor de acquisitie van confocale beeldsequenties om time-lapse beeldsequenties van de basale relatieve fluorescentie vast te leggen gedurende drie minuten bij een 20 x vergroting en een framerate van acht frames per seconde. Vervang na drie minuten opname van de basale fluorescentie de HEPES-gebufferde PSS-oplossing door hetzelfde volume 100 picomolaire substance P opgelost in HEPES-gebufferde PSS en neem nog eens drie minuten op. Exporteer in deze procedure de beeldsequentie van de fluorescente calciumactiviteit uit de confocale acquisitiesoftware als een 8-bit grijswaarden TIFF-bestand zonder schaalinformatie.Open vervolgens ImageJ. Klik op 'Openen' in het bestandsmenu en selecteer de juiste beeldsequentie in het verkennervenster. Om de beeldsequentie in ImageJ te bekijken, bepaalt u een geschikte ROI door de rechthoekige ROI-tool te gebruiken om de bovenste en onderste grenzen van de ruimtelijke verspreiding van de activiteit binnen de beeldsequentie te schatten. Maak daarna een nieuwe map aan op de harde schijf van de computer en voeg de beeldsequentie toe aan de mapdirectory.Klik in ImageJ op het venster Plugins. Klik vervolgens op lc pro. Voer ter start van de analyse de waarde voor de ROI-diameter in en selecteer daarna de drempelwaarde van het filter.Vink het selectievakje voor drug treatment aan en voer de tijdspunten in direct voor en na de toevoeging van het geneesmiddel. Klik vervolgens op oké en voer het directorypad van de beeldsequentie in het bestandsverkenner-venster in. Download in deze stap R versie 3.0 0.2 en installeer deze.Open vervolgens de 32-bit versie van R. Klik daarna op bestand. Open vervolgens het script en selecteer het trace plot RR-script voor het genereren van grafische experimentele rapporten. Installeer de pakketten calibrate en gpls via de optie pakketten.Installeer de pakketten en selecteer vervolgens de juiste pakketten. Klik op bestand, gebruik vervolgens het commando voor het wijzigen van de directory en gebruik het verkenner-venster om de directory te selecteren die overeenkomt met de output van de lc pro-analyse. Klik daarna op het scriptvenster en vervolgens op het commando 'alles uitvoeren' om het script hier uit te voeren.De time-lapse beelden van een input-beeldsequentie van een basaal bemonsteringsinterval, gevolgd door een met substance P gestimuleerd bemonsteringsinterval, worden getoond in grijswaardige time-lapse beeldsequenties; de beste lyses voor basale en gestimuleerde intervallen werden gerenderd door lc Pro en de tijdsafhankelijke geschaalde intensiteitscurves van elke automatisch geplaatste ROI worden hier getoond. Histogrammen van de piekamplitude, duur bij de helft van het maximum en maximale ruimtelijke spreiding voor zowel controle- als substance P-gestimuleerde gebeurtenissen uit een representatief experiment werden gerenderd. R werd gebruikt om de output van lc Pro grafisch te verwerken.Opmerkelijk genoeg breidde stimulatie met substance P het aantal gebeurtenissen uit en veroorzaakte een significante verschuiving naar rechts in de mediane amplitude en duur, bepaald via een Mann-Whitney U-toets. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om beeldartefacten door beweging van het brandvlak of incorrecte contrastinstellingen te minimaliseren, aangezien dit de analyse-output sterk kan beïnvloeden.

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

In hartspiercellen vormen tubulaire membraanstructuren intracellulaire netwerken. We beschrijven geoptimaliseerde protocollen voor i) isolatie van myocyten uit muizenhart inclusief kwaliteitscontrole, ii) live celkleuring voor state-of-the-art fluorescentiemicroscopie, en iii) directe beeldanalyse om de componentcomplexiteit en de plasticiteit van intracellulaire membraannetwerken te kwantificeren.

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

We presenteren een protocol voor de real-time optische detectie van één labelloze eiwitten zoals ze worden uitgescheiden uit levende cellen. Dit is gebaseerd op de microscopie interferometrische verstrooiing (iSCAT), die kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende biologische systemen en configuraties.

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca2 + imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca2 + signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Dit protocol presenteert stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Deze technieken zijn nuttig voor studies van de fysiologie van muurschilderingscellen en kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype te onderzoeken.

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) is een open-source ImageJ-plug-in voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse die beweging op de z-as onderzoekt en de maximale waarde van elke z-stack identificeert om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Het kan neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar op verschillende z-vlakken.

TACI: Een ImageJ Plugin voor 3D Calcium Imaging Analyse

In dit protocol presenteren we een nieuwe techniek voor het registreren en analyseren van Ca2+ -signalen in intrapulmonale aders (kleine longaders of PV's) bij fysiologische intraluminale druk. De techniek omvat het isoleren van kleine PV's, het incuberen ervan met een Ca2+ -indicator, het canuleren en onder druk zetten, confocale beeldvorming van Ca2+ -signalen en gegevensanalyse.

Beeldvorming van Ca2+ -signalen in kleine longaders bij fysiologische intraluminale druk

In dit rapport stellen we een nieuwe toepassing van licht-uithardende tandheelkundige harsen voor montageplaat van elektroden of microdialyse probes in chronische experimenten. Dit materiaal maakt directe binding aan de schedel.

Toepassing van de Light-cured Dental lijm hars voor permanente montage elektroden of Microdialyseprobes bij chronische experimenten

Leer een geautomatiseerde ROI-analyse voor endotheliale Ca²⁺-activiteit in varkenscoronaire arteriën. Deze methode vermindert gebruikersbias en verhoogt de efficiëntie bij cardiovasculair onderzoek.

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca

Meer video's verkennen