Name: qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer qPCR voor de detectie van cytomegalovirus DNA in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde gastro-intestinale biopsies. Deze gevoelige methode verbetert de diagnostische nauwkeurigheid bij twijfelachtige bevindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Amy Thomasson voor haar hulp bij de voorbereiding van dit manuscript, en Fredrik Skarstedt en Ryan Christy voor hun inspanningen bij de voorbereiding van de cijfers.

Met de goedkeuring van de Institutional Review Board, werd een onderzoek van de elektronische databank laboratorium uitgevoerd om in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) blokken die gevallen van cytomegalovirus (CMV)-infectie bij gastro-intestinale (GI) biopten gediagnosticeerd door histopathologie (hematoxyline en identificeren eosine (H &amp; E) en / of immunohistochemie (IHC)). 1. Weefsel bewerken van FFPE GI biopsieweefsel <ol><li> Verzamel FFPE GI biopsieweefsel blokken voor het cytomegalovirus (CMV) kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). Deze blokken worden opgeslagen bij kamertemperatuur. </li><li> Pre-label 1,7 ml microfugebuizen met het blok uniek identificatienummer. </li><li> Blokkeer de microtoom handwiel. </li><li> Seat het weefsel blok in de cassette klem. </li><li> Met behulp van een nieuwe, ongebruikte blad, lijn de blok aan het mes hoek op de microtoom. </li><li> Pas de microtoom tot 10 micrometer dikke secties gesneden. </li><li> Unlock the handwiel en vooraf het blok in de richting van het blad. </li><li> Snijd 5 delen van het blok bij 10 micrometer dik intervallen, waardoor elke snede te rollen in een rol van weefsel. Zorg ervoor dat elke scroll bevat een adequate vertegenwoordiging van de gewenste biopsie weefsels. </li><li> Blokkeer de microtoom handwiel. </li><li> Met een pincet, plaats alle 5 rollen van weefsel in de pre-gelabelde centrifugebuis, terwijl u alleen manipuleren van de scroll door de paraffine om mogelijke kruisbesmetting te verminderen. Snap de dop op de tube en plaats het terug op het rek. </li><li> Verwijder het weefsel blok van het microtoom. </li><li> Verwijderen en het blad verwijderen. </li><li> Ontsmet elk oppervlak of instrumenten die mogelijk in contact zijn gekomen met de vorige weefsel. </li><li> Zet een nieuwe, ongebruikte mes in de meshouder. </li><li> Herhaal stap 1,4-1,14 per extra blok te verwerken. De microfuge buizen die het weefsel rollen kan worden bewaard bij kamertemperatuur totdat de time van DNA-extractie. </li></ol> 2. DNA-extractie van Scrolls van FFPE GI biopsieweefsel OPMERKING: Dit protocol is een bewerking van de bijsluiter van de FFPE weefsel DNA-extractie kit (LET OP: zie Material Safety Data Sheet (MSDS)). <ol><li> Voeg 1 ml xyleen (LET OP: Raadpleeg MSDS) aan elk monster microfugebuis. Sluit het deksel en vortex krachtig gedurende 10 sec. </li><li> Ga verder met de DNA-extractie zoals specifiek in product insert van de fabrikant beschreven met de volgende wijzigingen. </li><li> Voeg eerst 6 pl van de interne controle (IC) aan elk microfugebuis. <ol><li> Na de ATL / proteinase K lysis incubatie bij 56 ° C gedurende 1 uur incuberen bij 99 ° C gedurende 30 min, dan 90 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Tijdens de uiteindelijke DNA elutiestap, open de deksel van de kolom DNA zuivering en 50 pl gedestilleerd DNAse / RNAse-vrij water toegepast in het midden van het membraan, in plaats buffer ATE. OPMERKING: Raadpleeg de bijsluiter voor de juiste opslag en de bereiding van reagentia. DNA moet worden geëxtraheerd uit alle 5 FFPE scrolls. Voer alle centrifugatiestappen bij kamertemperatuur (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR voor CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) procedure <ol><li> Genereer een Excel-PCR werkblad voor de CMV-test run. Dit Excel-werkblad berekent de totale hoeveelheid van elk reagens dat nodig is om de master mix met Mg. Het vermenigvuldigt de hoeveelheid van elk reagens dat nodig is per monster (zie hieronder) maal het aantal monsters en controles plus een (om te compenseren voor verliezen als gevolg van pipetteren). <ol><li> Neem de volgende reagentia in elke PCR-reactie in de hoeveelheid aangegeven: Reagens0; Bedrag per Sample CMV LC master mix flacon 12,5 ul Mg Oplossing gele flacon 2,5 pl Totale volume 15,0 ul </li></ol></li><li> Opnemen in elke test, lopen een water of geen doel controle (NTC), negatieve controle, een lage positieve controle, een hoge positieve controle, en ofwel QS3 of QS4, en alle patiënten monsters. De haarvaten moeten worden opgezet in deze volgorde. </li><li> Haal het koelblok specifiek voor de real-time PCR instrument wordt bewaard bij 4 ° C. Plaats de geschikte capillaire buisjes in het koelblok. Raak het oppervlak van de capillaire buizen niet aan. Gebruik altijd handschoenen bij het hanteren van de haarvaten. </li><li> Stel alle polymerase kettingreacties in een schone kap niet verontreinigd zijn met versterking productiets. <ol><li> Verwijder het juiste aantal master flacons uit de PCR-kit om alle monsters van patiënten, plus 5 controles te testen. Laat de meester flesjes, Mg-oplossing, en PCR kwaliteit water dooi in het koelblok. Elke meester flacon bevat voldoende reagentia voor 12 testen. </li><li> Voorzichtig vortex de meester flesjes en ze snel draaien in de centrifuge bij de maximale snelheid. </li><li> Combineer de inhoud van elke master flacon in een flesje, en opnieuw voorzichtig geschud. </li><li> Combineer de master mix en Mg oplossing in de op de PCR-werkblad aangegeven in een enkele steriele microfugebuis bedragen. </li><li> Meng voorzichtig en aliquot 15 pi master mix met Mg in de capillaire buisjes, met uitzondering van de capillaire op positie 5 die voor de kwantificatie standaard (QS). </li></ol></li><li> Verplaats het koelblok met de capillaire buizen en master mix met Mg van het schone kap naar een verwerkingsbedrijf kap. </li><li> Voeg 2 pi van interne controle (IC) om de resterende 30 ul van meestermengen met Mg. Meng voorzichtig en aliquot 15 pi in het capillaire op positie 5 (positie voor de QS). </li><li> Pipetteer 10 ul water, controle DNA of DNA-monster in de juiste capillaire buis. Cap de capillaire buizen met behulp van de aftopping tool. </li><li> Neem koelblok / monsters naar de real-time PCR-instrument. </li></ol></li><li> Programmeer de real-time PCR-instrument (zie tabel 1) </li><li> Amplificatie en detectie uitgevoerd op de real-time PCR-instrument <ol><li> Log in op de computer </li><li> Dubbelklik op het pictogram instrument en log in op de software. </li><li> Schakel de real-time PCR-instrument </li><li> Klik op &quot;CMV / EBV&quot; van de voorruit. </li><li> Volg de aanwijzingen van de macro-wizard. </li><li> Selecteer het vakje om een ​​zelf-test uit te voeren wanneer hierom wordt gevraagd door de software. Er moet een zelftest worden uitgevoerd eenmaal per dag het apparaat in gebruik is. </li><li> Noem de run. </li><li> Pas het aantal monster zich in de bovenste LEFt hoek van de pagina om de som van de controles en patiënten die in de run en voer het identificatienummer van elke patiënt monster. </li><li> Klik op het tabblad &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Onder &quot;Sample type &#39;, kent u de juiste monster type voor de standaard. </li><li> Typ in de verwachte concentraties voor de kwantificatie standaard (QS). </li><li> Verwijder de capillaire buisjes van de koeler blok en plaats ze in de overeenkomstige positie in de carrousel (koelblok monster # 1 in positie # 1 moet worden geplaatst op de carrousel, enz.). </li><li> Plaats de carrousel in de centrifuge en druk op start het instrument. </li><li> Open centrifuge en verwijder de carrousel. </li><li> Plaats de carrousel in de real-time PCR-instrument. Sluit het deksel. </li><li> Druk op &quot;Start Uitvoeren&quot;. </li><li> De real-time PCR-instrument zal elke positie controleren of er een monster. Loop niet weg van het instrument lopen totdat deze controle is voltooid, BWSwannneer een van de capillairen niet in de carrousel. Het instrument zal deze mee en vragen of de run wordt voortgezet. Antwoord ja voor vertrek. </li><li> Zodra de run is voltooid, sluit u het rapport dat werd gegenereerd. </li><li> Klik op &quot;Absolute Kwantificering&quot;. </li><li> Klik op de pijl naast Kleur compensatie. </li><li> Klik op &quot;Selecteer Kleur compensatie&quot; van de drop-down box. </li><li> Kies de meest recente kleurcompensatie bestand toe te passen op de run. </li><li> Klik op OK wanneer de doos opduikt. </li><li> Klik op de pijl door Standard Curve. </li><li> Selecteer &quot;gebruik maken van externe&quot; uit het drop-down menu. </li><li> Selecteer de meest recente externe standaardcurve bestand en klik op OK. </li><li> Kijk naar elke bocht onder de absolute kwantificatie menu om ervoor te zorgen dat de bochten aanwezig zijn en niet vlakke lijn, als een concentratie wordt toegewezen. De absolute kwantificatie van de 705/Back 530 wordt automatisch geanalyseerd. </li></ol></li><li> Quliteit controle <ol><li> Genereer een nieuwe standaard curve na elk nieuw lotnummer reagentia wordt ontvangen, of om de zes maanden, wat vaker is. </li><li> Voeg 10 ul van elke norm voor de master mix met Mg. Denk aan de normen die bij de kit zoals eerder uitgepakte DNA. </li><li> Voeg 1 ul van de interne controle voor elke standaard tot de master mix met Mg gebruikt bij het genereren van de standaard curve om nauwkeurige kwantificering te verzekeren. Heeft IC niet toe te voegen aan de master mix met Mg voor de No Template Controle (NTC). </li><li> Bereid een NTC en drie herhalingen van Kwantificering Standards QS 4, 3, 2, 1, en een 1:10 verdunning van QS4 voor de run naar de standaard curve te genereren, in totaal in 16 datapunten. </li><li> Selecteer &quot;repliceren van&quot; in het drop down menu voor herhaalde normen </li><li> Kies kanaal 530/back niets en zet kleurcompensatie bij het analyseren van de run, </li><li> Onder &quot;Standard Curve (In Run)&quot;, selecteert u &#39;opslaan als exexterne &quot;en de naam van de curve. Voer de opmerking in &quot;toegepast als standaard curve&quot; bij het opslaan. </li><li> Grafiek van het resultaat. De resulterende lineariteit coëfficiënt moet ≥ 0,81. </li><li> Voor de dagelijkse runs, onder meer een kopie van QS3 of QS4 als een controle in de aanloop. De huidige externe standaardcurve kunnen in de aanloop worden ingevoerd tijdens de analysefase. </li><li> Run Controls: geen DNA controle, negatieve controle, lage en hoge positieve controles. Verwachte viral load wordt bepaald en aangepast voor elke verkoper en lotnummer. </li><li> Voeg een IC aan elk monster en controle tijdens de DNA-extractie. </li><li> Als een van de controles vallen buiten bereik, noteer de onaanvaardbare resultaten en verwijzen de test voor het oplossen van problemen. </li></ol></li><li> Frequentie van de controles <ol><li> Opnemen in elke run: een NTC, negatief, lage positieve, hoge positieve, en de standaard controle. </li></ol></li></ol> Opmerking: acceptabele grenzen voor de controles. Geen pieken moeten worden in achtd voor de no template (NTC) en negatieve controles. Pieken moet aanwezig zijn in het 530 kanaal en verwachte virale ladingen worden bepaald en aangepast voor elke verkoper en lotnummer voor de lage en hoge positieve controles.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
<li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li>
<li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded%2C+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li>
<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veel laboratoria methoden beschikbaar zijn voor de diagnose van cytomegalovirus (CMV), waaronder serologie, virale cultuur, moleculaire viremie testen histologie biopsie materiaal en, zoals onlangs aangetoond moleculaire analyses van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefsel 5,6. Serologie, ooit een steunpilaar van de diagnose, alleen betrouwbaar identificeert blootstelling en niet goed correleert met een acute CMV-infectie 7. Viruskweek, zowel conventionele als vroege antige...

Interpretatie van cytomegalovirus (CMV) in klinische monsters is van cruciaal belang. CMV is een lid van de subfamilie van betaherpesvirinae herpesvirussen. Net als andere herpesvirussen, CMV heeft de mogelijkheid om hardnekkige of latente infectie te vestigen gekenmerkt door een gebrek aan actieve virale replicatie 1. Reactivering virus kan optreden in tijden van stress of andere immunosuppressie, waardoor actieve virale replicatie gekenmerkt door virion afgifte, eventueel vergezeld ziektemanifestaties 2-4. Gastro-intestinale (GI) CMV ziektesymptomen vaak buikpijn en / of bloederige ontlasting 1. De diagnose van CMV gastro door histologie gebruikt hematoxyline en eosine (H &amp; E) CMV virale insluitsels identificeren. In gevallen waarin klinisch vermoeden wordt hoog nog geen duidelijke insluitingen worden waargenomen, is immunohistochemie (IHC) vaak gebruikt als aanvulling testmethode. Echter, IHCkan ook worden belemmerd door zeldzame niet-klassieke verschijnen cellulaire kleuringspatronen (dubbelzinnig), waardoor de interpretatie moeilijk (figuur 2) 5. Er werd getracht DNA geëxtraheerd uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) GI biopsie weefsel en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) CMV detecteren GI biopsieën gebruiken. Deze techniek is gebleken waardevol bij de detectie van CMV in GI biopsieën, en is bijzonder nuttig in gevallen onduidelijke IHC 5,6. Ook is qPCR ook aangetoond goed correleren met aanvullende klinische CMV testgegevens wanneer het beschikbaar 6. Gebruik van qPCR opsporen CMV kan leiden tot een vroegere diagnose en behandeling wanneer klinisch vermoeden CMV is hoog, maar H &amp; E en CMV IHC negatief.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Microfuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Serrated forceps</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>62086-1S</td><td>Micro Forceps MF-1</td></tr><tr><td>Tabletop centrifuges (microfuge)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 gallon</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100%</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Supplement Kit</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler centrifuge</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Cooling Block</td><td>Roche</td><td>10800058001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Capping Tool</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Color Compensation Kit</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu;l Capillaries</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge low profile</td></tr></tbody></table>

qpcr is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van cytomegaloviral dna in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Het is cruciaal om cytomegalovirus (CMV) hebben bij het gastro-intestinale (GI) stelsel van immunogecompromitteerde patiënten, gezien hun grotere kans op het ontwikkelen van ernstige infecties. Veel laboratoriummethoden voor de detectie van CMV-infectie ontwikkeld, waaronder serologie, virale cultuur en moleculaire methoden. Vaak zijn deze methoden reflecteren systemische betrokkenheid met CMV en niet specifiek identificeren lokale betrokkenheid weefsel. Daarom wordt de detectie van CMV-infectie in het maag-darmkanaal vaak gedaan door traditionele histologie van biopsie weefsel. Hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring in combinatie met immunohistochemie (IHC) zijn de pijlers van onderzoek van deze biopten gebleven. H &amp; E en IHC soms resulteren in atypische (dubbelzinnige) vlekken patronen, waardoor de interpretatie bemoeilijkt. Er werd aangetoond dat kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) voor CMV succes kan worden uitgevoerd op formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel voor biopsie zeerhoge gevoeligheid en specificiteit. Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe qPCR testen uit te voeren voor de detectie van CMV in FFPE biopsie weefsel in een klinisch laboratorium setting. Deze werkwijze is waarschijnlijk van groot voordeel voor patiënten in gevallen van twijfelachtig kleuring CMV GI biopsieën.

Een totaal van 228 weefselblokken werden getest door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), die bestond uit 91 cytomegalovirus (CMV) positieve gevallen op basis van histologie en positieve immunohistochemie (IHC), 18 met dubbelzinnige CMV IHC en 79 negatieve controles. Zoals geïllustreerd in figuur 2, zou CMV positieve gevallen aangetoond typische CMV virale insluitingen (A) en / of positief IHC kleuring (B). Dubbelzinnige gevallen zou hebben aangetoond zeldzame...

Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het verhogen van de gevoeligheid voor het detecteren van cytomegalovirus-DNA in gastro-intestinale biopten, in het bijzonder biopten die een dubbelzinnig resultaat geven bij conventionele kleuringsmethoden. Dit wordt bereikt door eerst rollen van gefixeerd en in paraffine ingebed gastro-intestinaal bioptweefsel te snijden en te verzamelen. Vervolgens wordt het DNA uit de weefselrollen geëxtraheerd voor amplificatie.De specifieke primers die worden gebruikt, amplificeren selectief elk cytomegalovirus-DNA. Wanneer conventionele methoden die op gastro-intestinale biopsieweefsels worden toegepast dubbelzinnige resultaten opleveren, kan deze gevoelige methode cytomegalovirus-DNA detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden in het vakgebied, zoals hematoxyline, aniline en immunohistochemie, is dat deze methode geen interpretatie van atypische kleuringspatronen vereist. Op de dia die het snijden van gastro-intestinale biopsieweefsels demonstreert, zal Zainab van Horn, een histotechnoloog in het laboratorium, de extractie van nucleïnezuren demonstreren, evenals de RT-PCR-opstelling in het laboratorium.Rebecca Jocelyn voor dit protocol. Zorg dat de FFPE GI-biopsie weefselblokken op gebroken ijs klaarstaan. Label vervolgens bij de microtoom voor elk monsterblok een microcentrifugebuisje met het identificatienummer van het weefselblok.Zorg ervoor dat het handrad vergrendeld is en plaats het weefselblok in de cassetteklem. Zorg ervoor dat u een nieuw mesje gebruikt om kruiscontaminatie tussen monsters te voorkomen. Het is essentieel dat u voor uw eerste monster een ongebruikt mesje gebruikt.Wissel tussen monsters naar een ander mes en om de microtoom tussen monsters te decontamineren. Richt vervolgens het blok uit op de hoek van het mes en stel de snijdiktheid in op 10 microns. Ontgrendel nu het handrad en beweeg het blok richting het mes.Snijd vijf secties van het blok met intervallen van 10 micron, waarbij elke sectie zich tot een weefselrol oprolt. Controleer of elke rol een adequate representatie bevat van het gewenste biopsieweefsel. Wanneer de vijf rollen zijn gesneden, blokkeer dan het handrad.Zorg er bij het overbrengen van de vijf rollen naar het gelabelde centrifugebuisje dat de pincet alleen de paraffine aanraken en niet direct het weefsel. Sluit het buisje af en verwijder vervolgens het blok uit de cassetteklem om rollen van het volgende monster te verzamelen. Verwijder eerst het mesje en gooi dit weg.En voordat u een nieuw, ongebruikt mesje plaatst, dient u alle oppervlakken te ontsmetten die mogelijk in contact zijn gekomen met het vorige monster. Totdat de monsters verder worden verwerkt, kunnen ze bij kamertemperatuur worden bewaard. Het volgende protocol is aangepast van de FFPE-weefsel DNA-extractiekit.Raadpleeg vóór aanvang zeker het veiligheidsinformatieblad. Begin met het toevoegen van een milliliter xyleen aan elke monsterbuis en vortex deze vervolgens krachtig gedurende 10 seconden. Volg daarna de instructies van de fabrikant met de volgende aanpassingen.Voeg eerst zes µL van de interne controle toe aan elke buis. Ten tweede, na de incubatie van de A TL proteinase K lysis bij 56 °C gedurende één uur, worden de monsters 30 minuten bij 99 °C geïncubeerd in plaats van één uur bij 90 °C.Ten derde, pas bij het voltooien van de elutiestap in plaats van TE-buffer voorzichtig 50 µL gedistilleerd DNA- en RNA-vrij water toe in het midden van het membraan van de elutiekolom. Ten slotte moeten alle centrifugatiestappen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Stel de reacties op in een schone zuurkast die vrij is van contaminanten van amplificatieproducten van de kit.Verwijder voldoende mastervials en magnesiumoplossing voor de monsters plus vijf controles. Elke mastervial bevat voldoende reagens voor 12 tests. Vortex na het ontdooien de mastervials en centrifugeer ze kort op maximale snelheid.Combine vervolgens, volgens het PCR-werkblad, de magnesiumoplossing en de mastermix. Meng de oplossingen voorzichtig door te pipetteren en plaats ze in het koelblok. Voeg 15 µL van het mengsel toe aan de testcapillairen in het koelblok, met uitzondering van positie vijf.Deze capillair wordt apart gehouden voor de kwantitatieve standaard. Verplaats het koelblok met de capillairen en de mastermix met magnesium van de schone zuijkast naar een aparte verwerkingskast. Voeg hier twee µL interne controle toe aan de resterende 30 µL mastermix.Meng de oplossing door herhaaldelijk te pipetteren en breng 15 µL van dit mengsel aan in de capillair op positie vijf. Voeg vervolgens 10 µL watercontrole-DNA of monster-DNA toe aan de overeenkomstige positie. Sluit de capillairen na het laden af met het afsluitgereedschap bij de capillaircentrifuge.Verplaats de capillairen van het koelblok naar de overeenkomstige positie in het carrouselrek. Plaats vervolgens de carrousel in de centrifuge en start de cyclus na het centrifugeren. Verplaats de carrousel naar het real-time PCR-apparaat en voer de reactie later uit tijdens de analyse.Bekijk de gegevens met behulp van absolute kwantificering om er zeker van te zijn dat er een curve beschikbaar is voor het uitvoeren van kwantificeringen voor in totaal 228 monsters. Weefselblokken werden getest via QPCR 91. De blokken waren CMV-positieve gevallen op basis van histologie en positieve immunohistochemie.18 blokken hadden een equivocale C-M-V-I-H-C. De overige 79 waren negatieve controles. CMV-positieve gevallen werden aangetoond.Typische CMV-virale inclusies en positieve IHC-kleuring, of ten minste één van de twee. De twijfelachtige gevallen vertoonden zeldzame, niet-klassieke kleuringspatronen, terwijl negatieve controles geen verdachte histologie of IHC-kleuring vertoonden van de 91 weefsels die positief waren voor CMV 88. Getest positief via QPCR van de 71 negatieve controles testte één positief voor CMV via QPCR.A. Een bespreking van de biopten met dubbelzinnige C-M-V-I-H-C-kleuring wordt gegeven in het tekstprotocol. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA-extractie wordt uitgevoerd uit in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed GI-bioptweefsel, en vervolgens de daaropvolgende detectie van cytomegalovirus-DNA via real-time PCR.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Ontworpen chromosomen van het Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, kunnen worden onderscheiden van hun natuurlijke tegenhangers met behulp van een PCR-gebaseerde genotyperingstest genaamd PCRTagging, die een aanwezigheid/afwezigheid-endpoint heeft. Hier beschrijven we een high-throughput real-time PCR detectiemethode voor PCRTag genotypering.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

Het manuscript beschrijft een chip gebaseerde digitale PCR assay om te ontdekken een zeldzame CDH1 transcript variant (CDH1a) in normale vers bevroren en tumor weefsels verkregen van patiënten met maagkanker.

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Identificatie van mechanismen die ten grondslag liggen aan spierschade is cruciaal. Hier presenteren we de histologische techniek voor het bereiden van in paraffine ingebedde en bevroren delen van Drosophila thoracale spieren. Dit maakt analyse van de spier-morfologie en lokalisatie van eiwitten en andere spiercel componenten.

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

Leer qPCR voor de detectie van cytomegalovirus DNA in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde gastro-intestinale biopsies. Deze gevoelige methode verbetert de diagnostische nauwkeurigheid bij twijfelachtige bevindingen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel (Video) | JoVE Journal

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

Meer video's verkennen