Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren
4 februari 2014
Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkanker cellen van vaste klinische monsters. Eierstokkanker klinische monsters worden onderworpen aan enzymatische vertering om levensvatbare, fibroblast gratis ovariumcarcinoom (EOC) cellen zeer geschikt voor verdere toepassingen te verkrijgen.
Het algemene doel van deze procedure is om primaire ovariële kankercellen te isoleren en te karakteriseren uit vaste klinische monsters. Dit wordt bereikt door eerst het ovariële tumormonster te verzamelen en het in een petrischaal te plaatsen. De tweede stap is om het monster in stukken te snijden en de stukken over te brengen naar een conische buis met verteringsreagentia voor incubatie.
Vervolgens wordt de cellenslurry door een filter geleid waarbij alleen de cellen worden verzameld. Voor centrifugatie is de laatste stap het weggooien van de supernatant en het opnieuw oplossen van de cellen in media voor overnachtelijke incubatie. Uiteindelijk zullen de epitheliale ovariële kankercellen weken in cultuur groeien, wat downstream toepassingen mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het ovariumkankerveld, zoals wat de beste behandelingsoptie is voor elke individuele patiënt.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de behandeling van ovariële kanker omdat het ons in staat stelt om realistischere celculturen te gebruiken, die zeer vatbaar zijn voor genetische manipulatie en nuttiger zijn voor medicijnscreeningstests. Om te beginnen, suppleer 500 milliliter delcos, gemodificeerd eagles medium of DMEM met 10% foetaal bovien serum of FBS en 1% penicilline, streptomycine of ps. Bewaar het medium op vier graden Celsius.
Verzamel het monster uit de OR en vervoer het op ijs naar het lab, nog steeds in de vervoerscontainer. Plaats het monster in een biologische veiligheidskast. Breng het monster over vanuit een conische buis van 50 milliliter naar een petrischaal van 60 millimeter bij 60 millimeter met 10 milliliter vers ijskou PBS.
Snijd vervolgens het monster met behulp van een steriele scheermes verder in stukken van twee millimeter of kleiner. Behandel vervolgens DMEM met discs pasta in een conische buis van 15 liter. Breng de gehakte weefsels over naar de DMEM dispa twee mengbuis.
Vervolgens incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Roer de cellenslurry elke vijf minuten handmatig om optimale vertering te garanderen. Na incubatie brengt u de cellenslurry over door een celstrainer met een mesh van 70 micrometer die bovenop een conische buis van 50 milliliter is geplaatst.
Oefen voorzichtig druk uit met behulp van een spuitkolf, gooi eventueel los weefsel dat bovenop het gaas blijft zitten weg en verzamel de verkregen cellenslurry in de steriele conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer vervolgens. De conische buis gedurende zeven minuten bij 320 keer G op vier graden Celsius.
Gooi de supernatant weg en suspendeer het cellenpellet in 10 milliliter DMEM met 10% FBS en 1% ps. Breng vervolgens de cellenslurry over naar een petrischaal en incubeer de suspensie bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Ververs het medium 24 uur na de initiële beplanting om de cellulaire puinhopen en het grootste deel van de in de cultuur aanwezige erytrocyten te verwijderen.
Ververs vervolgens het medium elke drie dagen gedurende de volgende twee weken, waarna de culturen van primaire EOC-cellen klaar zijn voor downstream toepassingen. Direct na het beplanten. De epitheliale ovariële kankercellen of EOC-cellen verschijnen als enkele celsuspensies en in klonten met overvloedige erytrocyten en celdebris.
EOC-celcultuur drie dagen na beplanting toont semi-adherente EOC-celclusters en minder erytrocytverontreiniging. Een week na de initiële beplanting wordt de EOC-celcultuur een wervelachtige cluster van cellen die zich verspreiden op het weefselkweekplastic. De typische epitheliële kasseienmorfologie kan worden gezien in een confluente monolaag van EOC-cellen na 14 dagen in cultuur.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire ovariële kankercellen kunt isoleren en karakteriseren uit vaste klinische monsters.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkankercellen uit solide klinische monsters. De procedure maakt de groei van epitheliale eierstokkankercellen in culture mogelijk, wat verdere toepassingen faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Oncologie
- Celbiologie
- Klinisch onderzoek
Achtergrond
- Eierstokkanker is een aanzienlijk gezondheidsprobleem met complexe behandelopties.
- De isolatie van levensvatbare kankercellen is cruciaal voor gepersonaliseerde geneeskunde.
- Huidige methoden leveren mogelijk geen zuivere epitheliale eierstokkankercellen op.
- Deze studie heeft tot doel het isolatieproces te verbeteren voor betere onderzoeksresultaten.
Doel van de studie
- Het isoleren van primaire eierstokkankercellen uit klinische monsters.
- Het karakteriseren van de geïsoleerde cellen voor verdere toepassingen.
- Het verbeteren van het inzicht in behandelopties voor patiënten met eierstokkanker.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van eierstoktumorspecimens.
- Enzymatische digestie van weefselmonsters.
- Filtratie om levensvatbare cellen te isoleren.
- Centrifugatie en resuspensie in medium voor kweek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van fibroblast-vrije epitheliale eierstokkankercellen.
- Cellen kunnen gedurende weken worden gekweekt, wat uitgebreide studie mogelijk maakt.
- De methode biedt een betrouwbare bron van kankercellen voor onderzoek.
- Potentieel om gepersonaliseerde behandelstrategieën te informeren.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van eierstokkankercellen.
- Het ondersteunt verder onderzoek naar behandelingen van eierstokkanker.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om de patiëntuitkomsten te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het vestigen van primaire eierstokkankercellen uit solide klinische specimens maakt patiëntrelevante modellen mogelijk die de afhankelijkheid van gepasseerde cellijnen met geaccumuleerde genetische artefacten verminderen. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie bij doelwitvalidatie door tumorheterogeniteit en locatie-specifieke biologie van primaire of metastatische laesies te behouden. De resulterende culturen bieden een hernieuwbare bron voor downstream screening, wat het voorspellende vertrouwen bij preklinische besluitvorming verbetert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van cellen die het genetische en fenotypische profiel van het oorspronkelijke klinische specimen weerspiegelen.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door artefacten te vermijden die geassocieerd worden met langdurig gepasseerde cellijnen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage via biologisch gede-riskt target-validatie in een ziekte-relevant systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert epitheliale ovariumkankercellen die geschikt zijn voor drugscreening met behoud van tumorigenische eigenschappen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare celsuspensies na enzymatische digestie en filtratie.
- Schaalbaarheid: Maakt de preparatie van meerdere primaire culturen uit diverse monsters mogelijk voor parallelle assay-testen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen fundamenteel onderzoek en preklinisch werk door gebruik te maken van cellen die direct zijn afgeleid van patiëntmonsters.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de evaluatie van targets en biomarkers in een context die representatief is voor de tumor van de patiënt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van responsen in primaire cellen die klinische uitkomsten beter voorspellen.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege biologie tot identificatie van lead-verbindingen, waarbij primaire cellen worden geleverd die de relevantie van downstream screening- en validatie-inspanningen vergroten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden met gebruik van cellen met intacte tumorspecifieke kenmerken.
- Screening: Levert assay-klare primaire epitheliale eierstokkankercellen met kwantificeerbare groei en morfologie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Maakt meting van medicumrespons, proliferatie en fenotypische veranderingen mogelijk in een genetisch stabiel systeem met een laag passagegetal.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de klinische relevantie door directe afleiding uit specimens, ter ondersteuning van biomarker- en targetvalidatie.
- Bedrijfbrede herutilisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van primaire culturen uit diverse specimens, waardoor de afhankelijkheid van eindige cellijnen wordt verminderd.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door gebruik te maken van cellen die de heterogeniteit en biologie van de oorspronkelijke tumor weerspiegelen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor enzymatische digestie, filtratie en het starten van de cultuur.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het risico op falen in een laat stadium te verminderen via betere preklinische targetvalidatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van activiteit in primaire cellen afgeleid van patiënten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in steriele weefselbehandeling, enzymatische digestie en technieken voor primaire celkweek.
- Is afhankelijk van de toegang tot verse of correct geconserveerde eierstoktumorsamples die onder steriele omstandigheden zijn verzameld.
- Vereist centrifugatie-, filtratie- en kweekapparatuur, waaronder biologische veiligheidskasten en CO2-incubatoren.
- Omvat de optimalisatie van de digestietijd en mechanische dissociatie om de epitheliale opbrengst te maximaliseren en fibroblastcontaminatie te minimaliseren.
- Wordt beperkt door de beschikbaarheid en levensvatbaarheid van de monsters, welke kunnen variëren afhankelijk van het tijdstip van de chirurgische ingreep en de transportcondities.
