Name: Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer elektrospinnen van poly(glycerol-dodecanedioaat) vezels voor zenuwweefselengineering met muizenembryonale stamcellen. Deze methode ondersteunt celgroei en differentiatie naar neurale cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd met behulp van de faciliteiten van de faculteit Biomedische Technologie aan de Florida International University.

1. Electrospinning Collector Setup <ol><li> Snijd de aluminiumfolie in een rechthoekig stuk. </li><li> Vouw het rechthoekig stuk in een rechthoekige strook, en bevestig deze loodrecht op een vlakke metalen plaat met tape (Figuur 1). Opmerking: De grootte van de vezelmat afhankelijk van de lengte en breedte van de strook. Zo kan de strook afmetingen aangepast indien nodig. </li></ol> 2. Polymeer Oplossing Voorbereiding <ol><li> Meng glycerol en dodecaandizuur (DDA) in 1:1 molverhouding in een beker bij 120 ° C gedurende 100 uur PGD polymeer te verkrijgen. </li><li> Los poly (ethyleenoxide) (PEO) en gelatine in 65% ethanol met een gewichtsverhouding van 1.5:3:95.5 in een 15 ml buis, draai de kap en verwarm het mengsel in een oven bij 60 ° C gedurende 1 uur onder roeren tot het een homogene oplossing (Basal oplossing). </li><li> Voor electrospinning, meng de PGD polymeer en de basale oplossing in 04:06 gewichtsverhouding. Opmerking: PGD concentratie heeft een big effect op glasvezel diameter. 30% -50% procent PGD aanvaardbaar vezels langer dan 5 cm diameter met meer vezels te produceren. </li><li> Voeg 0,1% riboflavine aan de polymere oplossing en meng. </li></ol> 3. Electrospinning <ol><li> Voer de polymere oplossing in een 5 ml standaard spuit met een 18 G afgestompt roestvrijstalen naald. </li><li> Plaats de spuit in een injectiepomp. </li><li> Bevestig de geaarde leiding van een hoog voltage stroombron om de metalen plaat en de positief geladen leiden tot de naald. </li><li> Stel de afstand tussen de naald en de aluminiumfolie strip 15 cm. </li><li> Plaats de spuit pomp in een hoek van ongeveer 15 ° met de horizontale aggregatie van de vezels aan de voorzijde van de strip te voorkomen. </li><li> Schakel de spuitpomp en stel het debiet van de pomp tot 0,6 ml / uur. </li><li> Schakel de hoogspanning voedingsbron en zet de werkspanning tot 14,6 kV. </li></ol> 4.Vezelverwerking <ol><li> Nadat het verzamelen is voltooid, bloot de vezel mat aan UV-licht gedurende 60 min voor cross-linking. </li><li> Breng de vezel mat van de aluminiumfolie strip om een ​​100 mm petrischaal en bloot aan UV-licht voor nog eens 20 minuten voor sterilisatie. </li><li> In een bioveiligheid kast, snijd de vezel mat in ronde stukken van dezelfde grootte met een chirurgisch mes en leg de stukken in een 24-well plaat. </li><li> Voor cellen pre-seeding behandeling onderdompelen vezelmonsters in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. </li><li> Op de volgende dag, aspireren PBS voorzichtig, voeg 1 ml van differentiatie medium (DMEM/F12, N2, en FGF2) (zie recept in Materials tabel) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur. </li><li> Zuig differentiatiemedium voorzichtig, voeg 0,2 ml Matrigel elke vezel monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: laminine kan ook worden gebruikt voor vezels coating. Voeg 0,2 ml van 20 ug / ml lamininede vezel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Verwijder overtollig matrigel zorgvuldig uit elk putje. Spoelen met 2 ml van differentiatie medium eenmaal. Opmerking: De vezel monsters zijn klaar voor celkweek. </li></ol> 5. Cel zaaien op Fibers <ol><li> Voeg 1 ml van Accutase de MES celkweekschaal en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na 10 min worden de MES cellen losgemaakt van de kweekschaal. Voeg 4 ml differentiatiemedium aan de plaat. Verzamel de drijvende MES cellen in een 15 ml buis en pipet cellen op en neer om kolonies (ongeveer 15x) breken. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer cellen in 4 ml differentiatiemedium. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer. Breng 200 pi van de celsuspensie in een 15 ml buis en verdunnen 10x met differentiatiemedium. Transfer 15 pi van de verdunde celsuspensie om een ​​kamer op de hemocytometer met een cover-slip op zijn plaats. Tellende cellen in de 1 mm midden plein en de vier hoeken vierkantjes van de hemocytometer onder de microscoop. Opmerking: Mobiele per ml = het gemiddelde aantal per vierkante x de verdunningsfactor x 10 4 </li><li> Plaats ongeveer 5 x 10 4 MES cellen op elk putje. Langzaam vallen de celsuspensie op het midden van de vezel monsters, in plaats van glijden aan de zijkant van de put, om de oplossing te voorkomen aftappen van de vezelmat. </li><li> Voeg 1 ml differentiatiemedium aan elk putje, en houdt de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 cellen hechting, groei en differentiatie mogelijk. </li><li> Zuig het oude medium uit elk putje en vervangen door 1 ml verse differentiatie medium elke andere dag. </li></ol> 6. Levensvatbaarheid van de cellen <ol><li> Zuig het oude medium uit elk putje. </li><li> Meng 1/10 ste hoeveelheid Resazurin fluorescentie reagens met kweekmedium en voeg 1 ml in elk putje. </li><li> Incubaten bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 4 uur, beschermd tegen direct licht. </li><li> Na 4 uur, overdracht 100 ul 3x van het reagens uit elk putje van een 96-well plaat, en vervolgens de monsters zijn klaar om te worden gemeten op een fluorescentie spectrofotometer met behulp van 560EX nm/590EM filter instellingen. </li></ol> 7. Real Time PCR <ol><li> Na 14 dagen kweken voeg lysisbuffer de monsters en isoleren totaal RNA uit de cellen op de vezelmonsters. </li><li> Gebruik 4 pi totaal RNA in cDNA synthetiseren in 20 ul reactie schalen door reverse transcriptie. </li><li> Maak de PCR mengsel in beide optische buis: 10 pi Master Mix (2x), 0,2 pl kleurstof, 8 pi Nuclease-vrij water, 1 ui cDNA, en 1 pi primer (Primers die in deze studie worden in Tabel 1). </li><li> Het opzetten van de PCR-programma: een. 95 ° C 2:20 min, 1 cyclus b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 cyclus c. 95 ° C 15 sec, 1 cyclus d. 60 ° C 1min, 1 cyclus e. 95 ° C 15 seconden, 1 cyclus. Kies vergelijkende CT methode om relatieve genexpressie te bepalen. </li><li> Na PCR is voltooid, analyseert de real-time PCR resultaten StepOne software en de resultaten exporteren naar Excel. </li></ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approximate+linear+confidence+and+curvature+of+a+kinetic+model+of+dodecanedioic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+preparing+electrospun+nanofibers%3A+designing+an+electrospinning+process+for+nanofiber+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Internationa+l%22%5BJournal%5D)">Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication.</a> Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).</li>
<li>Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+technology%3A+designing+the+next+generation+of+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds.</a> Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).</li>
<li>Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds%3A+production%2C+characterization%2C+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review.</a> Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).</li>
<li>Lim, S. H., Mao, H. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for stem cell engineering.</a> Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).</li>
<li>Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter%2C+pore+size+and+seeding+method+on+growth+of+human+dermal+fibroblasts+in+electrospun+poly+%28epsilon-caprolactone%29+fibrous+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats.</a> Biomaterials. 31, 491-504 (2010).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30, 583-588 (2009).</li>
<li>Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayered+scaffold+for+engineering+cellularized+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels.</a> Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).</li>
<li>McCullen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+collagen+polymerization+of+layered+cell-seeded+electrospun+scaffolds+for+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De beperkingen van collectoren of de complexiteit van roterende verzamelaars die momenteel worden gebruikt voor elektrospinning verhogen de beperking van het verkrijgen van de gewenste lengte en grootte vezelmat voor sommige toepassingen. Bovendien, het overbrengen van vezels van de grond collector naar de cultuur schotel of andere substraten is een uitdaging 5. In dit verslag, een nieuw ontworpen verzamelaar eenvoudig gemaakt door het aanbrengen van een aluminium foliebaan de geaarde collector, kon vergroot ...

Electrospinning is een van de effectieve verwerkingsmethoden micro naar nanometer vezel steigers produceren. Het basisprincipe van electrospinning omvat een Taylor kegel oplossing die bij de opening van de naald wordt vastgehouden door toepassing van hoge spanning tussen de punt van de naald en een geaarde collector. Wanneer de elektrostatische afstoting in de oplossing overwint de oppervlaktespanning, wordt een geladen fluïdumstraal uitgeworpen uit de naald tip, reizen door de lucht met oplosmiddel verdamping, en wordt uiteindelijk afgezet op de geaarde collector. De spuitpomp verschaft een continue stroom van de oplossing die uit de spindop en dus meerdere kopieën van de electrospun vezels kunnen worden vervaardigd binnen een korte tijd. Tijdens het verlaten van de spindop te komen tot de collector, zal de geladen jet ondergaan rekken en zweep volgens een aantal parameters die de viscositeit en oppervlaktespanning van de polymeeroplossing bevatten de elektrostatischc kracht in de oplossing, en de interactie van het externe elektrische veld, enz. 2. In het elektrospinproces, een collector fungeert als een geleidend substraat waarbij het micro-naar nanometer vezels kunnen worden afgezet. In deze studie werd een nieuw type vezel collector is ontworpen om vezelmatten verkrijgen met de gewenste afmetingen (lengte x breedte). Traditioneel wordt aluminiumfolie als verzamelaar maar het is moeilijk om de vezels te brengen van het vlakke oppervlak naar het andere substraat. De moeilijkheid van het oogsten van een intacte vezel mat van een traditionele verzamelaar was voornamelijk te wijten aan het feit dat de electrospun vezels hechten sterk aan het oppervlak van de collector&#39;s. Daarom pasten we de collector door het vouwen van een stuk aluminiumfolie in een rechthoekige strook en het bevestigen van het loodrecht op een vlakke metalen plaat. De electrospun vezels zijn uitgerekt over het gebied tussen het uiteinde van de strip en de metalen plaat, die gemakkelijk kunnen worden overgedragen naar andere Substrate. Interesse in thermisch verknoopte elastomeerpolymeren groeit snel vanwege het baanbrekende werk van Robert Langer&#39;s groep, die poly (glycerol sebacaat) (PGS), een polyester dat analoog is aan gevulkaniseerd rubber in 2002 3. Net als bij PGS geïntroduceerd, hebben we met succes poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) door thermische condensatie van glycerol en dodecaandizuur en toonde haar unieke vormgeheugen eigendom 1. Unlike stijvere kunststoffen poly (hydroxy butyraat) of poly (L-lactide) (Young&#39;s modulus van 250 MPa en 660 MPa, respectievelijk), PGD vertoont elastomere eigenschap rubber, met een Young&#39;s modulus van 1,08 MPa bij een temperatuur boven 37 ° C, hetgeen een goede overeenkomst met de in-situ perifere zenuwen (0,45 MPa). Bovendien PGD is biologisch afbreekbaar en degradatietijd kan worden afgestemd door het variëren van de verhouding van glycerol en dodecaandizuur. Dodecaandizuur is een twaalf-carbon subhouding met twee eindstandige carboxylgroepen, HOOC (CH2) 10 COOH. Zelfs genummerde dicarbonzuren zoals sebacinezuur en dodecaandizuur kunnen worden gemetaboliseerd tot acetyl-CoA en voer de citroenzuur (TCA) / (citroenzuur) cyclus. De metaboliet van dicarbonzuren, succinyl-CoA, een gluconeogenetic precursor en tussentijdse TCA cyclus 4. Dus sommige studies gesuggereerd dat ze kunnen worden gebruikt als alternatieve brandstof substraat voor enterale en parenterale voeding, met name in de pathologische omstandigheden. Bovendien PGD vertoont unieke vormgeheugen omdat de glasovergangstemperatuur 31 ° C, waardoor toont verschillende mechanische eigenschappen bij kamertemperatuur en bij lichaamstemperatuur. Kortom, PGD is biologisch afbreekbaar, biocompatibel, vertonen unieke elastische eigenschappen met mechanische eigenschappen vergelijkbaar met zenuwweefsel; Daarom is een geschikt materiaal voor zenuwweefsel technische toepassingen. In dit protocol, de electrospunlange vezels verspreid over een grote storting gebied werden gefabriceerd via de nieuw ontworpen collector van PGD. De vezel steigers kan de groei en differentiatie muis pluripotente stamcellen te ondersteunen.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Dodecanedioic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene oxide) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Mouse embryonic stem cells</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin fluorescence dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV Total RNA Isolation System</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>High voltage power source&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>UV light</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospun stapel stellingen van poly (glycerol-dodecanedioate) voor engineering zenuwweefsel van muis embryonale stamcellen

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Voor tissue engineering toepassingen, de bereiding van biologisch afbreekbaar en biocompatibel steigers is het meest wenselijk, maar uitdagende taak. Van de verschillende fabricagemethoden, electrospinning is het meest aantrekkelijk door zijn eenvoud en veelzijdigheid. Daarnaast electrospun nanovezels na te bootsen de omvang van de natuurlijke extracellulaire matrix zorgen voor extra ondersteuning voor de overleving en groei. Deze studie toonde de levensvatbaarheid van de vervaardiging van lange vezels verspreid over een groter stortterrein voor een nieuw biologisch afbreekbaar en biocompatibel polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) 1 met een nieuw ontworpen collector voor electrospinning. PGD ​​vertoont unieke elastische eigenschappen met vergelijkbare mechanische eigenschappen aan zenuwweefsel, dus het is geschikt voor zenuwweefsel technische toepassingen. De synthese en fabricatie set-up voor het maken van vezelige steigermateriaal was eenvoudig, zeer reproduceerbaar, en goedkoop. In biocompatibiliteittesten, kunnen cellen uit muis embryonale stamcellen hechten aan en groeien op de electrospun PGD vezels. Kortom, dit protocol voorzien in een veelzijdige vervaardigingswerkwijze voor het vervaardigen PGD electrospun vezels om de groei van muis embryonale stamcellen afgeleide neurale stam cellen ondersteunen.

De belangrijkste componenten van de electrospinning worden getoond in Figuur 1. Een groot formaat vezelmat werd meestal verkregen via loodrecht bijgevoegde aluminiumfolie strippen en een vlakke metalen plaat. Figuur 2 toont het ontwerp en de collector electrospinning vezelmat. De breedte en lengte kan worden aangepast voor verschillende toepassingen. De lengte van de vezel die met PGD polymeer en basale oplossing mengsel wordt tot 10 cm. De morfologie van electrospun vezels wordt getoon...

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Deze procedure fabriceert Electros gesponnen lange vezels van een nieuwe biologisch afbreekbare polymeer genaamd poly glycerol Dote Cano acht. Stel eerst de nieuw ontworpen collector in en bereid de polymere oplossing voor voor elektrospinnen, gebruik een spuit en pomp, breng de oplossing naar de collector. Breng vervolgens het resulterende vezelmattendoek over naar een kweekschaal voor cross-linking.Zaai vervolgens muis embryonale stamcellen op de gesneden vezels. Uiteindelijk kunnen de resultaten aantonen dat de muis embryonale stamcellen kunnen overleven en differentiëren in neurale cellen op de vezelstructuren. In de video van vandaag hebben we je laten zien hoe je het biomateriaal van de syncellenfabricage bereidt en uiteindelijk die elektrospanvezels voor celkweek gebruikt.Vooral wanneer we combineren met de cel afkomstig van poly en stamcel. Ze kunnen een zeer belangrijke toepassing hebben in de toekomst voor de celbezorging en het maken van een functioneel weefsel. Weefsel invis vandaag dat ze een verschrikkelijke procedure voor je zullen demonstreren.Zij is het grootste ding in mijn laboratorium. Snijd aluminiumfolie in een rechthoekig stuk. Vouw het rechthoekige stuk tot een rechthoekige strook en bevestig het loodrecht aan een vlakke metalen plaat met plakband.De lengte van de strook hangt af van de grootte van de vezelmattendoek die nodig is voor de polymere oplossing. Meng glycerol en do decaan diic zuur in een een-op-een molaire verhouding bij 120 graden Celsius gedurende 100 uur. Om een poly glycerol, do decanoïsch polymeer te verkrijgen, lost u polyethyleenoxide en gelatine op in 65% ethanol met een gewichtsverhouding van 1,5 tot drie tot 95,5 in een 15 milliliter buis.Draai de dop vast en verwarm het mengsel in een oven op 60 graden Celsius gedurende een uur, elke 15 minuten roerend tot de basale oplossing homogeen is. Voor elektrospinnen, meng de PGD polymeer en de basale oplossing. In een vier tot zes gewichtsverhouding, voeg 0,1% riboflavine toe aan het mengsel en meng het goed.Leid de polymere oplossing in een standaard spuit van vijf milliliter met een 18 gauge afgeronde roestvrijstalen naald. Plaats vervolgens de spuit in een spuitpomp. Bevestig de geaarde draad van een hoogspanningsvoeding aan de metalen plaat en de positief geladen draad aan de naald.Pas ook de afstand tussen de naald en het aluminiumfolie aan. Strook tot 15 centimeter. Plaats nu de spuitpomp onder een hoek van ongeveer 15 graden met de horizontale om aggregatie van de vezels aan de voorkant van de strook te voorkomen.Schakel de spuitpomp in en pas de stroomsnelheid van de pomp aan op 0,6 milliliter per uur. Schakel de hoogspanningsvoeding in en stel de bedrijfsspanning in op 14,6 kilovolt. Nadat de verzameling is voltooid, stelt u de vezelmattendoek bloot aan UV-licht gedurende 60 minuten voor cross-linking.Breng de vezelmattendoek over van de aluminiumfoliestrook naar een 100 millimeter Petri-schaal. Snijd de vezelmattendoek in ronde stukken van dezelfde grootte met het chirurgische mes en plaats de stukken in een 24-puttenplaat. Breng vervolgens de plaat bloot aan UV-licht gedurende nog eens 20 minuten voor sterilisatie voor celvoorafgaande behandeling.Dompel vezelmonsters in één milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing en incubeer een nacht op 37 graden Celsius. Aspireer de PBS voorzichtig. Voeg één milliliter differentiatiemedium toe aan elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie uur.Na het voorzichtig aspireren van het differentiatiemedium voegt u 0,2 milliliter matri gel toe aan elk vezelmonster en incubeert u bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder voorzichtig het overtollige matri gel van elk. Spoel eenmaal met twee milliliter differentiatiemedium.Voeg na 10 minuten één milliliter tase toe aan de muis embryonale stamcelkweekschaal op 37 graden Celsius. Wanneer de MES-cellen loslaten, voegt u vier milliliter differentiatiemedium toe. Verzamel de drijvende MES-cellen in een 15 milliliter buis, centrifugeert bij 400 Gs gedurende vijf minuten.Re suspendeer de gepelletiseerde cellen in vier milliliter differentiatie.Medium. Breng 200 microliter van de celsuspensie over in een 15 milliliter buis en voeg 10 volumes toe van differentiatie.Medium. Breng 15 microliter van de verdunde celsuspensie over naar een kamer op de hemo cytometer.Met een dekglas op zijn plaats, tel de cellen in het ene millimeter middelste vierkant en de vier hoekvierkanten van de hemo cytometer. Laat nu vijf keer 10 tot de vierde muis ES-cellen langzaam op het midden van de vezelmonsters vallen.Voeg één milliliter differentiatiemedium toe aan elke put en kweek bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor celanhechten. Groei en differentiatie. Vul elke andere dag het ene milliliter differentiatiemedium aan.Om de cellevensvatbaarheid te meten, aspireer het oude medium uit elke put en voeg één milliliter van een een op tien verdunning abre en fluorescentiereagens in cultuur toe. Medium incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vier uur beschermd tegen direct licht. Breng vervolgens drievoudige monsters van 100 microliter uit elke put over naar een 96-puttenplaat en meet de fluorescentie. Scanning-elektronenmicroscoopbeelden werden gebruikt om de morfologie van de electros gesponnen vezels te evalueren.De diameters van deze vezels gemaakt van 40% PGD-concentratie liggen hier in de micrometerbereik. Gedifferentieerde muis embryonale stamcellen werden gedurende drie dagen op de vezels gekweekt en confocale microscopie werd gebruikt om overgeexpresseerd groen fluorescerend eiwit te visualiseren. Het toegenomen aantal groen fluorescerende cellen op dag zes geeft aan dat de vezelstructuren zowel celadhesie als celproliferatie kunnen ondersteunen.Zu en fluorescentiemetingen toonden aan dat coating met matrigel en laminine resulteerde in equivalente cellevensvatbaarheid en relatief hogere proliferatie. Flury potentie en neurale celmarkers werden gekwantificeerd door real-time PCR op dag één. De meerderheid van de op vez

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Uitgelijnd electrospun vezels direct de groei van neuronen in vitro en zijn een potentieel onderdeel van de zenuw regeneratie steigers. We beschrijven een procedure voor het bereiden van electrospun vezels substraten en de serum-vrije cultuur van primaire rat E15 sensorische (DRG) en de motor neuronen. Visualisatie van de neuronen door middel van immunocytochemie is ook inbegrepen.

De cultuur van primaire motorische en sensorische neuronen in de gedefinieerde media op electrospun Poly-L-lactide Nanovezel Steigers

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Inzicht in de complexe werkingen van de hersenen vereist geavanceerde onderzoeksinstrumenten. Hier demonstreren we een nieuwe op zijde-collageen gebaseerd 3D-geengineerd model van zenuwweefsel dat lijkt op een hersen-achtige architectuur. Het model kan worden gebruikt om de assemblage van neuronale netwerken, axongeleide, cel-cel interacties en elektrische activiteit te bestuderen.

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.

Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Leer elektrospinnen van poly(glycerol-dodecanedioaat) vezels voor zenuwweefselengineering met muizenembryonale stamcellen. Deze methode ondersteunt celgroei en differentiatie naar neurale cellen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Meer video's verkennen