MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

Het algemene doel van deze procedure is om de micro-RNA-expressie te vergelijken in geïnduceerde pluripotente stamcellen, retinaal pigmentepitheelcellen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen en foetaal retinaal pigmentepitheel. Dit wordt bereikt door eerst iPS-cellen en foetaal RPE te kweken en te expanderen.

De tweede stap is het differentiëren van de iPS-cellen tot RPE. Vervolgens wordt het RNA geëxtraheerd uit de iPS-cellen, de iPS-RPE-cellen en de foetale RPE-cellen. De laatste stap is het uitvoeren van een micro RNA-microarray-analyse op de RNA-monsters en het analyseren van de gegevens.

Uiteindelijk wordt pathway- en netwerkanalyse gebruikt om differentieel tot expressie gekomen microRNA's te identificeren die betrokken zijn bij meerdere cellulaire netwerken, waaronder proliferatie en progressie van de celcyclus. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het visieonderzoek, zoals de rol van microRNA bij het reguleren van de differentiatie naar mature RPE, de progressie van de celcyclus, proliferatie en senescentie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapieën waarbij gebruik wordt gemaakt van uit stamcellen afgeleid retina pigment epitheel om ziek RPE of beschadigd RPE te vervangen, omdat het optimale passagenummer van de cellen die voor therapie worden gebruikt, kan worden bepaald.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de factoren die de differentiatie van RRP uit IPS reguleren, kan zij ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals de differentiatie van andere TC-specifieke celtypen uit IPS. Om deze procedure te starten, worden de geïnduceerde pluripotente stamcellen geplaatst met ongeveer 350 celkolonies per putje op een vers gecoate plaat in M tester one-medium, waarna de IPSL-kolonies vier tot vijf dagen in culture mogen expanderen.

Vervang vervolgens om de drie dagen het M tesser one-medium door vier milliliters differentiatiemedium en vernieuw de helft van het medium met vers differentiatiemedium. Laat de gepigmenteerde foci groot genoeg groeien om ze handmatig uit de cultuur te kunnen dissecteren, wat ongeveer 40 tot 50 dagen duurt. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipetpunt om rondom de gepigmenteerde kolonies te snijden en deze op te tillen.

Verzamel de gedisseceerde kolonies en voeg deze samen in een conische buis van 15 milliliter. Voeg vijf milliliter DMMF 12-medium toe aan de samengevoegde RPE-cellen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 GS. Verwijder vervolgens het medium, resuspendeer het celpellet in vijf milliliter medium en herhaal de centrifugatie.

Verwijder het medium van het celpellet. Bereid vervolgens een suspensie van enkelvoudige cellen door de gepoolde I-P-S-R-P-E te incuberen met 0,25%TRIPSIN EDTA gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C totdat celklonters zijn gedissocieerd tot enkelvoudige cellen. Spoel de I-P-S-R-P-E-cellen met I-P-S-R-P-E-medium en zaai de verzamelde cellen vervolgens uit op een verse, met Matrigel gecoate plaat in vier milliliter I-P-S-R-P-E-cultuurmedium; cultureer de cellen drie weken vóór passage en ververs het medium elke drie dagen met vers I-P-S-R-P-E-medium voor het experiment.

Zaai de I-P-S-R-P-E-cellen uit met een dichtheid van 100, 000 cellen per vierkante centimeter en oogst de cellen 17 dagen na het uitzaaien voor het verzamelen van ongedifferentieerde IPS-cellen. Kweek de cellen totdat de ongedifferentieerde kolonies in het centrum dens worden. Wanneer dit is waargenomen, spoel de kolonies dan met D-M-E-M-F 12-medium en dissocieer de IPS-cellen vervolgens tot enkelvoudige cellen met behulp van Accutane.

Verzamel de cellen in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer deze 5 minuten lang bij 300 Gs. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in twee milliliters D-M-E-M-F 12 medium. Om foetaal RPE te verzamelen, spoel je de foetale RPE-celculturen eerst met D-M-E-M-F 12. Dissocieer vervolgens de celculturen tot enkelvoudige cellen met 0,25% TRIPSIN EDTA gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C.

Verzamel de foetale RPE-cellen in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 GS. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de celpellet in twee milliliters D-M-E-M-F 12 medium.

Oogst de I-P-S-R-P-E-cellen op dag 17. Na passage drie en passage vijf worden de I-P-S-R-P-E-cellen tweemaal gespoeld met PBS en wordt een suspensie van enkelvoudige cellen bereid door incubatie met 1 mL 0,25%trypsine gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Neutraliseer vervolgens de trypsine met 2 mL ijskoude I-P-S-R-P-E-medium en verzamel de cellen in een conische buis van 15 mL.

Centrifugeer de buis vijf minuten bij 300 Gs en aspireer vervolgens het supernatant. Resuspendeer de celpellet in drie milliliter kleuringsbuffer uit de microbead-kit; centrifugeer de I-P-S-R-P-E-celсусpensie in de kleuringsbuffer vijf minuten bij 300 GS. Aspireer daarna het supernatant en resuspendeer.

Resuspendeer het celpellet tot een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per 100 µL van de kleuringsbuffer uit de microbead-kit. Voeg 10 µL anti-TRA1-60 PE-antilichaam toe per 2 × 10⁶ cellen. Meng goed en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Was de cellen in één milliliter kleuringsbuffer per 2 × 10⁶ cellen. Centrifugeer de celsuspensie vervolgens 10 minuten bij 300 ×g. Aspireer daarna het supernatant en resuspendeer de celpellet in 80 µL kleuringsbuffer per 2 × 10⁶ cellen.

Voeg vervolgens 20 µL anti-PE-gelabelde microbeads toe per 2 × 10⁶ cellen. Meng goed en incubeer 15 minuten bij 4 °C. Voeg 1 mL kleuringsbuffer toe per 2 × 10⁶ cellen, centrifugeer 10 minuten bij 300 ×g en aspireer het supernatant.

Resuspend de celpellet vervolgens in 500 µL kleuringsbuffer en sorteer op TRA1-60-negatieve cellen in een magnetische cel sorter, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Lyseer de cellen door elk monster door een commercieel verkrijgbare microcentrifuge-homogenisator mini-spincolumn te leiden, ontworpen voor nucleïnezuur-minipreps. Extraheer vervolgens het totale RNA uit de IPS-cellen, IPS-RPE en foetaal RPE met een commercieel verkrijgbare RNA-extractiekit die is ontworpen om kleine RNA-moleculen te behouden.

Gebruik een NanoDrop-spectrofotometer om de totale RNA-concentraties te bepalen en maak een Excel-bestand met een lijst van de microRNA's waarvan is vastgesteld dat de expressieniveaus ten minste tweevoudig verschillen tussen de steekproefgroepen. Log vervolgens in op het online RNA-pathways analyseprogramma en upload het Excel-bestand. Selecteer 'flexible format' voor het bestandsformaat en selecteer 'Agilent' uit de vervolgkeuzelijst voor de identifier.

Typ onder de kop raw data. Ken ID toe aan de kolom probe ID en ken observation one en log ratio toe aan de kolom log ratio. Selecteer ignore voor alle overige kolommen.

Selecteer de parameters voor de analyse als volgt: kies bij confidence alleen voor experimentally observed, includeer direct and indirect relationships en includeer endogenous chemicals. Selecteer de ingenuity knowledge base als referentieset. Kies vervolgens de database met referentiemoleculen.

Dit omvat gegevens van alle soorten, alle cellijnen en weefsels en alle mutaties. Voer na het selecteren van alle parameters de netwerkanalyse uit door netwerken te selecteren. Selecteer vervolgens overlappende netwerken en klik daarna op een netwerk van belang om de resultaten te bekijken.

IPS-cellen die werden gedifferentieerd tot I-P-S-R-P-E-cellen vertoonden het klassieke RPE-fenotype van een hexagonale gepigmenteerde celmorfologie, wat vergelijkbaar is met foetale RPE-cellen. Een vergelijking van het microRNA-expressieprofiel van ongedifferentieerde IPS-cellen met I-P-S-R-P-E-cellen onthulde een upregulatie van 47 microRNA's en een downregulatie van 36 microRNA's, terwijl foetale RPE-cellen 61 upgereguleerde microRNA's en 49 downgereguleerde microRNA's vertoonden in vergelijking met de I-P-S-R-P-E-cellen. Pathway-analyse met Ingenuity IPA-software wees uit dat de doelgenen van de differentieel tot expressie gebrachte microRNA's betrokken waren bij cellulaire processen, waaronder cellulaire ontwikkeling, groei en de celcyclus. Deze analyse wees er ook op dat microRNA's die in vivo in oogweefsels tot expressie komen, verrijkt waren in I-P-S-R-P-E en foetaal RPE vergeleken met IPS-cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om contaminatie en degradatie van de RNA-monsters na deze procedure te voorkomen.

Andere methoden, zoals R-T-P-C-R, kunnen worden uitgevoerd om het niveau van micro-RNA-expressie in elk celtype na de implementatie te bevestigen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van visusonderzoek om de rol van micro-RNA bij differentiatie en celcyclusprogressie in RPE te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe RPE uit iPS kan worden afgeleid en hoe het micro-RNA-expressieprofiel van iPS-RPE vergeleken kan worden met iPS-cellen en foetaal RPE.