Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren
17 juni 2014
Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.
Het algemene doel van deze procedure is om morfo eno oligonucleotiden af te leveren via ventriculaire injecties in de larve, coddle-vin, en knock down-genen om hun functie tijdens regeneratie te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de larve te verdoven en ze in een groef van de aros-mal te plaatsen. Vervolgens wordt de injectienaald in het hartventrikel gestoken.
Vervolgens wordt de morpho-oplossing vier tot zes keer in het ventrikel geïnjecteerd met gewichtsintervallen tussen de pulsen om het hart te laten klaren. Ten slotte wordt de coddle-vin geamputeerd en gedurende drie dagen toegestaan te regenereren. Uiteindelijk kan het effect op de regeneratie van de vin vervolgens worden beoordeeld door het geregenereerde gebied van de vin te meten met behulp van de lijntraceringstool van Fiji Image J open source software.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transgenese of mutagenese, is dat het de knock-down van genen door minos in larvale weefsels mogelijk maakt die niet geschikt zijn voor directe injecties. Gebruik glascapillairen met een diameter van 0,75 millimeter, plaats er een in een naaldtrekker en trek de naald met de volgende parameters met horlogemakerstangen, en onder een stereoscoop met een micrometers oogstuk, breek de getrokken capillair om een naald van 20 micrometer diameter te produceren. Gebruik vervolgens een draaibank met een gebonden rubberen spinwiel om de naald te slijpen en een 20 micrometer schuine snede te produceren. Bereid de morpho-stock op door de gelyofiliseerd Morpho op te lossen in één XPBS tot een uiteindelijke concentratie van 7,5 millimolar.
Meng de Morpho-injectieoplossing door 2,5 microliter van de Morpho-stockoplossing te combineren met 2,8 microliter van één millimolar endo Porter-stockoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 millimolar morfo en 0,5 millimolar endo porter om injecties uit te voeren. Gebruik een micropipet met een 10 microliter tip om de geslepen glazen naald te laden met vijf microliter van de morpho-oplossing. Plaats vervolgens de glazen naald in de naaldaanhouder van de micromanipulator verbonden met de pneumatische pico-pomp.
Stel de hoek voor de injecties in op ongeveer 45 graden zodat de naald alleen in één planaire richting hoeft te worden bewogen. Stel vervolgens de micro-injector waarden als volgt in, een houddruk van 20 pond per vierkante inch of PSI een uitwerpdruk van 15 PSIA 100 milliseconde bereik van gating en een periodewaarde van 1,9, wat overeenkomt met 10,9 milliseconden. Bereid 20 milliliter gesmolten 1,5% aros in één XPBS en giet het in een 10 centimeter petrischaal.
Plaats vervolgens een groefvormige injectiemal in de warme aros om in de verharde gel groeven te vormen om larven te verdoven. Plaats ze in 100 milliliter aquariumwater met 20 milligram per liter trican. Nadat ze niet meer reageren op aanraking, gebruik een plastic pastorale pipet om de larve voorzichtig over te brengen naar een groef van de natte aros-mal zodat de ventrale zijde naar de verticale aros-wand van de groef wijst.
Plaats de aros-plaat onder de stereomicroscoop zodat het ventrikel weg van de injectienaald gericht is. Laat vervolgens de naald zakken en steek hem ongeveer één tot twee micrometer in het hartventrikel. Zorg ervoor dat deze niet te diep wordt ingebracht.
Injecteer vervolgens een drie nanoliter puls van Morpho-oplossing in het ventrikel en wacht om het hart te laten klaren voordat u herhaalt met nog vijf pulsen na injectie, verwijder de naald en plaats deze in een petrischaal met één XPBS om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een transferpipet gevuld met E drie-medium om de larven voorzichtig terug te brengen in een petrischaal met vers E drie-medium om opname en onderhoud van de morpho in cellen te garanderen. Herhaal de injecties elke 12 tot 24 uur gedurende de duur van het experiment om de injecties te beoordelen.
Na het verdoven van de vis, plaats ze op een platte natte aros-plaat bedekt met E drie-medium voordat je een stereomicroscoop met helder veld en fluorescentie gebruikt om ze te beeldhouwen. Analyseer afbeeldingen voor regeneratie met behulp van Fiji Image J gratis software om de lijntraceringstool te gebruiken om de hoeveelheid regeneratieve groei te bepalen die heeft plaatsgevonden. Kalibreer eerst de afbeeldingen door een bestand te slepen en neer te zetten in het hoofdvenster van Fiji in het hoofdmenu.
Stel de schaal in voor alle afbeeldingen door op analysen in het vervolgkeuzemenu te klikken. Klik op schaal instellen, schakel vervolgens de globale optie in door op het selectievakje te klikken. Sleep en zet de afbeelding nu opnieuw neer om de hoeveelheid regeneratieve groei in de werkbalk te meten.
Kies het freehand selectiegereedschap en omcirkel het te meten gebied. Druk tenslotte op Ctrl M. Dit opent een nieuw resultaatvenster dat de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels toont. Zoals hier te zien is, verspreidt de morpho endo porter-oplossing zich binnen enkele minuten na injectie door de vaten naar verschillende weefsels zoals de vinplooi en hersenen gedurende ten minste 12 of meer uren.
Om de regeneratie van distale larvale vinstructuren te beoordelen, werden de volgende dingen verwijderd, de distale punt van de vinplooi en het ruggenmerg, de distale no-snaar, distale stamspier, die hier niet zichtbaar is, en pigmentcellen, die moeilijk te targeten zijn door directe injectie, maar lijken de morpho te incorporeren na seriële ventriculaire injecties. Dus, deze methode bevordert relatief gemakkelijk de aflevering van morfo aan weefsels die moeilijk individueel te targeten zijn, en het maakt de beoordeling van genfunctie in verschillende weefsels in de regenererende vin tegelijk mogelijk. Om de belangrijkheid van specifieke genen die betrokken zijn bij regeneratie te analyseren, wordt de larvale coddle-vin gedeeltelijk geamputeerd en worden alle weefsels die de morpho hebben ingebouwd, geresecteerd.
De larvale vinplooi regenereert zijn structuur binnen een paar dagen na amputatie zoals gedemonstreerd. Hier richt morfo zich op genen die nodig zijn voor regeneratie, verstoord de regeneratierespons vergeleken met niet geïnject
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een reverse genetische methode voor zebravissen die onderzoekers in staat stelt de functie van genen te beoordelen tijdens latere ontwikkelingsstadia en fysiologische processen zoals weefselregeneratie. De methode omvat intraventriculaire injecties van genspecifieke morpholinos om doelgenen te knocken down.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Zebravissen zijn een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van genfunctie.
- Genspecifieke morpholinos kunnen effectief genexpressie knocken down.
- Weefselregeneratie is een cruciaal onderzoeksgebied in de ontwikkelingsbiologie.
- Intraventriculaire injecties maken nauwkeurige aflevering van morpholinos mogelijk.
Doel van de studie
- Om de rol van specifieke genen in weefselregeneratie te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor genknockdown in zebravissen.
- Om het begrip van genfunctie tijdens latere ontwikkelingsstadia te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Anestheseren van zebravislarven.
- Injecteren van morpholino-oplossingen in het hartventrikel.
- Uitvoeren van meerdere injecties met intervallen voor hartclearing.
- Amputeren van de coddle-vin en monitoren van regeneratie gedurende drie dagen.
Belangrijkste resultaten
- De methode leverde met succes morpholinos af aan doelgenen.
- Regeneratie van de coddle-vin werd beoordeeld met behulp van Fiji-beeldanalyse.
- Effecten van genknockdown op vinregeneratie werden gekwantificeerd.
- De aanpak biedt inzichten in genfunctie tijdens regeneratie.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genfunctie in zebravissen.
- Het kan worden toegepast op verschillende genen die betrokken zijn bij regeneratie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical gap in zebrafish research by enabling temporal control of gene knockdown in post-embryonic larvae, particularly in tissues refractory to direct injection such as the caudal fin. It supports mechanistic de-risking in regeneration studies by allowing rapid assessment of gene function in physiologically relevant, regenerating tissues. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking larval finfold regeneration pathways to those active in adult vertebrate tissue repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in regeneration pathways by knocking down genes in multiple tissues simultaneously.
- Operational Value: Provides a dispersion-based delivery system that overcomes limitations of tissue inaccessibility in larval models.
- Predictive Value: Supports target confidence assessment by correlating morpholino-induced phenotypes with regeneration defects in distal fin structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable phenotypic readouts via Fiji-based area measurement of regenerating fin tissue.
- Operational Value: Establishes a standardized, reproducible workflow for serial ventricular injections and regeneration tracking over three days.
- Assay Readiness: Produces dispersed morpholino delivery detectable in vasculature and target tissues including fin fold, brain, spinal cord, trunk muscle, and pigment cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Leverages zebrafish larval finfold as a disease-relevant system for studying genes conserved in adult vertebrate regeneration.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of gene function in tissue homeostasis and regeneration post-embryogenesis, informing preclinical target selection.
- Continuity of Evidence: Connects larval phenotypic outcomes to potential roles in human tissue repair mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by enabling functional genomics in a regenerating, physiologically complex larval system prior to mammalian preclinical work.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation in regeneration-associated genes through temporal knockdown in larvae.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized morpholino uptake across multiple tissue types.
- Analytics: Enables quantitative comparison of regenerative growth via image analysis, facilitating condition-to-condition comparisons.
- Translational Research: Links larval finfold regeneration to adult vertebrate tissue repair through conserved genetic pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for temporal gene interrogation in zebrafish larvae across multiple regeneration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene function studies by enabling knockdown in previously inaccessible larval tissues.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized injection protocols, heart-clearing intervals, and regeneration timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing early phenotypic data on regeneration-critical genes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence in a physiologically relevant regeneration model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish larval handling, microinjection, and anesthesia using tricaine.
- Dependent on specialized instrumentation including pneumatic pico pumps, micro manipulators, and stereoscopes with micrometer eyepieces.
- Necessitates standardized preparation of morpholino-endo Porter solutions and agarose molds for consistent larval positioning.
- Involves adaptation considerations for different tissue targets based on morpholino dispersion kinetics and clearance intervals.
- Limited by the need for repeated injections every 12–24 hours to maintain knockdown during regeneration experiments.
