Name: Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer een reverse-genetische morfolino-methode voor genfunctie-onderzoek tijdens weefselregeneratie bij zebravislarven via intraventriculaire injecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), willen we Ayele Tsedeke Taddese bedanken voor de technische ondersteuning.

1. Voorbereiding van de Glass Naalden (figuur 1) <ol><li> Gebruik glazen capillairen met een 0,75 mm diameter injectienaalden (Figuur 1A) te bereiden. </li><li> Plaats de glazen capillair in een naald trekker en trek de naald met de volgende parameter: verwarming cyclus waarde: 463; trekken cyclus waarde: 230; snelheid: 150 msec; tijd: 150 msec (Figuur 1B). </li><li> Breek het getrokken glas capillair met horlogemaker pincet om een ​​20 micrometer diameter naald produceren onder een stereoscoop met een micrometer oculair. </li><li> Gebruik een draaibank met een natgemaakte rubber spinnewiel om de naald te scherpen en produceren een 20 urn afschuining (figuren 1C en 1D). Opmerking: Sharp, schuine naalden verbeteren het gemak van inbrengen in de hartkamer en daarmee het minimaliseren van de schade aan het weefsel en laat de geperforeerde spier sluit na verwijdering van de naald (fig. 1E-G). </li></ol> 2. Preparatie van de morfolino oplossing <ol><li> Bereid de morfolino voorraad door oplossen van het gelyofiliseerde morfolino in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 7,5 mM. [Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie (Materialen tabel)]. </li><li> Bereid de morfolino injectieoplossing door menging 2,5 ul morfolino voorraadoplossing (7,5 mM) 2,8 pl Endo-Porter voorraadoplossing (1 mM) (zie Materialen tabel) voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 mM en 0,5 mM morfolino Endo-Porter. </li></ol> 3. Bereiding van de morfolino injectie (figuur 2) <ol><li> Laad de schuine glazen naald met 5 ul van deze oplossing met behulp van een micropipet met een 10 ul microloader pipet tip. </li><li> Plaats de glazen naald in de naald houder van de micromanipulator verbonden met de pneumatische pico pomp (Figuren 2A-C). </li><li> Plaats de naald houder naast de microscoop zodat de naald alleen behoeftenin een vlakke richting te verplaatsen om het in de ventrikel van de larve (Figuur 2A). </li><li> Pas de hoek van de injecties rond de 45 °. </li><li> Stel de microinjector waarden als volgt: hold druk: £ 20 per vierkante inch (psi); uitwerpen druk: 15 psi; 100 msec bereik van gating, periode-waarde van 1,9 (komt overeen met 10,9 msec). </li><li> Smelt agarose in 1x PBS met een standaard magnetron tot 20 ml van een 1,5% (w / v) gel produceren. Giet gesmolten gel in een 10 cm Petrischaal. Plaats een gegroefde injectie vorm in de warme agarose zodat eenmaal verhard, zal de agarose groeven waarin de gesedeerd larve 11 (figuren 2D en 2E) zal worden geplaatst hebben. </li></ol> 4. Injecties (figuur 3) <ol><li> Verdoven larve in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzoaat-methaansulfonaat) tot ze niet meer reageert op aanraking. </li><li> Gebruik een plastic Pasteur pipette om de verdoofd larve voorzichtig over in een groef van de natte agarose mal zodat de buikzijde is gericht tegen de verticale agarose wand van de groef (figuur 3A). </li><li> Plaats de agarose plaat onder de stereomicroscoop zodat het ventrikel niet gericht is op de injectienaald (figuur 3A). </li><li> Zet de naald om te plaatsen in de hartkamer. Steek de naald slechts 1-2 micrometer in het ventrikel het verzorgen van de naald te diep (Figuren 3B en 3C) niet in te voegen. </li><li> Zodra de naald wordt ingebracht, injecteer de morfolino oplossing in het ventrikel met 4-6 pulsen, leveren elk 3 nl van de oplossing, met wachten intervallen tot vereffening van het hart (figuren 3D en 3E) mogelijk te maken. </li><li> Na injectie, verwijder de naald (evenwijdig aan het vlak van insertion) en vervolgens de larve zorgvuldig over te dragen met behulp van een plastic Pasteur pipet gevuld met E3 medium back in een petrischaal met vers medium E3. </li><li> Plaats de naald in een petrischaal met 1x PBS om het drogen van de naald bij het overbrengen van de geïnjecteerde larve voorkomen. </li><li> Herhaal stap 4.1-4.6 elke 12-24 uur gedurende de duur van het experiment. Opmerking: Herhaling van de injecties zorgt de opname en het onderhoud van de morfolino in cellen. </li></ol> 5. Analyses van injecties (figuur 4) <ol><li> Verdoven van de vissen in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne totdat ze niet meer reageert op aanraking. </li><li> Plaats de larve lateraal op een vlakke natte 1,5% (w / v) agarose plaat bedekt met E3 medium. </li><li> Afbeelding larven met behulp van een stereomicroscoop met helderveld en fluorescentie beeldvorming. Opmerking: Als de larven transparant dient de fluoresceïne gelabeld morfolino zichtbaar fluorescent groen in het bloedvat door het dier direct na injectie. Deze fluorescentie zal verder verspreiden in de gevasculariseerde weefsels door15 min (Figuren 4A-4C). </li></ol> 6. Beoordeling van Regeneratieve uitgroei <ol><li> Beoordelen gemaakte opnamen met behulp van Fiji Afbeelding J vrije software (http://fiji.sc/Fiji). Voor het onderzoeken van de regeneratie, gebruik maken van de lijn tracing tool om het bedrag van regeneratieve groei die heeft plaatsgevonden op de controle en-morfolino geïnjecteerd larve bepalen. </li><li> Om afbeeldingen te kalibreren, opent een van de originele beeldbestanden in Fiji door te slepen en het bestand in de belangrijkste Fiji venster. </li><li> Om de schaal voor alle volgende beelden ingesteld, gaat u naar &quot;Analyze&quot; in het hoofdmenu. </li><li> In het drop-down menu, klik op &quot;Set schaal&quot;. </li><li> In dit venster, zet de &#39;Global&#39; optie door te klikken op het vakje. </li><li> Open nu de afbeelding om het bedrag van de regeneratieve groei weer meten met slepen en neerzetten (zie stap 6.1). </li><li> Kies de &quot;vrije hand selecties&quot; tool in de werkbalk. </li><li> Omcirkel het gebied dat moet worden gemeten (Figuren 4J-4L). </li><li> Druk op Ctrl + M. Dit zal een nieuw venster &quot;resultaten&quot; van de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels openen. </li></ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
<li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics%3A+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li>
<li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li>
<li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmour%2C+DT+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Re.+Pathol.+Mech.+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li>
<li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li>
<li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legless%2C+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li>
<li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De intraventriculaire injectie zorgt voor een snelle en betrouwbare beoordeling methode voor het testen van gen-functie in latere stadia van ontwikkeling of van het lichaam homeostase zonder dat de functie van een gen tijdens de embryogenese. Om het succes van deze techniek te waarborgen, moet men zich bewust zijn van de vier kritische punten: 1) met nld, 2) uitdrogen van de naald, 3) een minimaal volume en 4) minimale blootstelling tijd in de sedatie oplossing. Naalden die te klein zijn zal vaak verstoppen, terwijl de ...

Regeneratie van organen en appendages is van fundamenteel belang voor de overleving en fitness; hebben echter een aantal gewervelde dieren, inclusief de mens regeneratieve vermogens beperkt. Terwijl verschillende diermodellen bestaan ​​die uitgebreide regeneratieve capaciteit hebben, omgekeerde genetische technieken om gen-functie te beoordelen tijdens orgel en aanhangsel regeneratie blijven zeer beperkt of niet aanwezig. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig om de moleculaire biologie van regeneratie ontleden in deze modelorganismen. De zebravis is een goed uitgewerkt model voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie 1, niet alleen vanwege de belangrijke mogelijkheid om meerdere organen, weefsels en appendages regenereren, maar ook omdat een aantal transgene vis lijnen bestaan ​​om cellen te volgen en Gene overexpressie constructen 2, 3. Echter remming gen larvale zebravis grotendeels beperkt tot de overexpression van dominant-negatieve constructen, die niet voor alle genen van belang of waarvan transgen product gain-of-function effecten die niet weergeven endogene activiteit van het gen te verwerven. Aldus wordt een alternatieve methode om specifiek verwijderen genexpressie door knockout of knockdown nodig om deze problemen te overwinnen. Gen-specifieke sturing met TALENS bestaat als een reverse genetische middel om genfunctie knockout; Maar dit knockout strategie is zeer vaak beperkt tot functionele evaluaties tijdens vroege embryogenese omdat basisvereisten van het gen voorkomen verdere progressie van de embryonale ontwikkeling. Zo bestuderen later verschijnselen zoals regeneratie of orgaan homeostase na ontwikkeling met behulp van TALENS uitgesloten 4, 5. Daarom is een alternatieve strategie voor de verwijdering gen nodig die genfunctie richt na de vroege ontwikkeling gen eisen volledig gevormd organen en structuren beoordelen. </p&gt; Morfolino injectie is effectief gebleken in het richten genen in een aantal volwassen organen en de volwassen regenereren vin 6-8 zijn, maar deze methoden elektroporatie en vele interne organen zijn moeilijk te electroporate hetzij als gevolg van hun locatie of vanwege hun gevoeligheid voor elektrische verstoring. Bovendien zijn sommige weefsels in de larve zijn moeilijk direct te injecteren, omdat directe injectie de structurele integriteit kan verstoren of omdat hun omvang is beperkt. De staartvin van de larve is een dergelijke structuur, omdat directe injectie in de finfold niet mogelijk. Dus een alternatief voor elektroporatie en directe injectie noodzakelijk om genen te richten in weefsels die ofwel te klein om te injecteren of kan niet worden geëlektroporeerd. Om richten en remmen de functie van specifieke genen tijdens de regeneratie van de larvale staartvin, hebben wij bestaande technologieën morfolino gemodificeerd zodat het eenEOORDELING van gen-functie tijdens staartvin regeneratie in late-geënsceneerde larve. Deze methode maakt gebruik van intraventriculaire aflevering 9 van fluoresceïne-gelabeld morpholinos samen met Endo-Porter transfectiereagens 10. Eenmaal in het ventrikel, de morfolino-Endo-Porter mengsel verspreidt zich snel gedurende de larve via de vasculatuur en gaat weefsels die voorheen onmogelijk te richten zijn. Deze injectie werkwijze kan worden gemodificeerd om genen te richten op specifieke weefsels en mogelijk kan ook in diermodellen die nog onvoldoende omgekeerde genetische methoden om genfunctie te remmen worden toegepast. Zo, het biedt een snelle en eenvoudige methode met het potentieel voor brede waaier gebruik onmiddellijk te bestuderen gen-functie tijdens algemene orgel homeostase en regeneratie bij larvale stadia.

<table><tbody><tr><td>Morpholino met 3&acute;fluoresceine label</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Aangepast</td><td>Meer informatie op www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>Meer informatie op www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>Voor het gieten van platen om de vissen tijdens injecties en beeldvorming te plaatsen</td></tr><tr><td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzeëzuur-methaan sulfonaat)</td><td>Applichem</td><td></td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>E3 medium (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4)</td><td></td><td></td><td>Voor larvale veehouderij</td></tr><tr><td>Petri-schalen</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>Voor het plaatsen van de vissen tijdens injecties en beeldvorming</td></tr><tr><td>Dunwandige glazen capillaire buisjes</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>Voor het maken van injectienaalden</td></tr><tr><td>Microloader pipettentips</td><td>Eppendorf</td><td>5.242.956.003</td><td>Voor het laden van de naald</td></tr><tr><td>Pasteur Pipetten (3 ml/1 ml)</td><td>Brand</td><td>747760/ 74775</td><td>Voor het overbrengen van larven</td></tr><tr><td>Flaming/Brown naaldtrekker</td><td>Sutter</td><td></td><td>Meer informatie op www.sutter.com</td></tr><tr><td>Horlogemaker (Dumont) Pincetten (maat 5)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501985</td><td>Om de naald te breken voor het slijpen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varieert per fabrikant</td><td>Onderdeel van de volledige injectieopstelling</td></tr><tr><td>Fluorescentiecamera</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varieert per fabrikant</td><td>Om de fluorescentie na injectie te beeldvormen</td></tr><tr><td>PicoNozzle kit (microinjectorhouder)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Voor micro-injecties</td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump (micro-injector)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Voor micro-injecties</td></tr></tbody></table>

reverse genetische morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire injection naar meerdere moeilijk-to-target weefsels in de zebravis larve transfecteren

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

De zebravis is een belangrijk model voor de cel-en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie begrijpen. Echter, moleculaire strategieën reverse genetics dienst nog niet voldoende ontwikkeld om genfunctie in regeneratie of weefsel homeostase in larvale stadia na de zebravis embryogenese beoordelen en verscheidene weefsels in het zebravis larven zijn moeilijk te richten. Intraventriculaire injectie van genspecifieke morfolino een alternatieve werkwijze voor de huidige onmogelijkheid om genomisch doel zebravis genen in een tijdelijk geregelde wijze naar deze fasen. Deze methode zorgt voor volledige dispersie en daaropvolgende verwerking van de morfolino in verschillende weefsels in het lichaam, waaronder structuren die voorheen onmogelijk te bereiken als die in de larvale staartvin een structuur vaak gebruikt om niet-invasief onderzoek weefselregeneratie waren. Verschillende genen tijdens de larvale finfold regeneratie geactiveerd worden ook presentatiet in regenererende volwassen gewervelde weefsels, zodat de larve is een bruikbaar model voor regeneratie begrijpen bij volwassenen. Deze morfolino dispersie methode maakt een snelle en gemakkelijke identificatie van genen die vereist zijn voor de regeneratie van larvale weefsels en andere fysiologische verschijnselen reguleren weefsel homeostase na embryogenese. Daarom deze levering methode een nog nodig strategie voor tijdelijke controle van de evaluatie van genfunctie na embryogenese.

De scherpe, schuine injectienaald wordt gemakkelijk geplaatst in de cardiale ventrikel van de zebravis larve wanneer dorsally benaderd (figuur 3A). Het hart blijft pompen en de bloedstroom wordt gehandhaafd ondanks de aanwezigheid van de naald (Figuren 3B en 3C). Voorzichtig injecties niet de morfologie van de hartkamer of cardiale samentrekkingen (figuur 3D) ondanks de injectie van morfolino naar het hart (Figuur 3E) verstoren. <p ...

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

Het algemene doel van deze procedure is het toedienen van morpholino-oligonucleotiden via ventriculaire injecties in de larve, de vinnencoddel, en het uitschakelen van genen om hun functie tijdens regeneratie te beoordelen. Dit wordt bereikt door de larve eerst te anesthetiseren en in een groef van de aros-mal te plaatsen. Vervolgens wordt de injectienaald in de hartventrikel ingebracht.Vervolgens wordt de morpho-oplossing vier tot zes keer in het ventrikel geïnjecteerd, met wachtintervallen tussen de pulsen om het hart de tijd te geven om te klaren. Ten slotte wordt de rugvin geamputeerd en drie dagen lang regeneratie toegestaan. Uiteindelijk kan het effect op de regeneratie van de vin worden beoordeeld door het geregenereerde oppervlak van de vin te meten met de line tracing-tool van de open-source software Fiji ImageJ.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transgenese of mutagenese, is dat het de knockdown van genen door morpholino's mogelijk maakt in larvale weefsels die niet geschikt zijn voor directe injecties. Plaats een glazen capillair met een diameter van 0,75 millimeter in een needle puller en trek de naald met de volgende parameters; breek vervolgens met horlogemakerspincetten en onder een stereoscoop met een micrometer-oculair de getrokken capillair af om een naald met een diameter van 20 micrometer te verkrijgen. Gebruik daarna een draaibank met een rubberen slijfwiel om de naald aan te scherpen en een facet van 20 micrometer te creëren. Bereid de morpho-stamoplossing voor door het geliofiliseerde morpholino op te lossen in 1x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 7,5 millimolair.Meng de Morpho-injectieoplossing door 2,5 µL Morpho-stockoplossing te combineren met 2,8 µL van een 1 mM endo Porter-stockoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 mM morpho en 0,5 mM endo porter om de injecties uit te voeren. Gebruik een micropipet met een 10 µL tip om de schuine glazen naald te vullen met 5 µL Morpho-oplossing. Plaats vervolgens de glazen naald in de naaldhouder van de micromanipulator die is aangesloten op de pneumatische picopomp.Stel de hoek voor de injecties in op ongeveer 45 graden, zodat de naald slechts in één vlakke richting bewogen hoeft te worden. Stel vervolgens de waarden van de micro-injector als volgt in: een houdruk van 20 pounds per square inch of PSI, een uitstootdruk van 15 PSIA, een gating-interval van 100 milliseconde en een periode-waarde van 1,9, wat overeenkomt met 10,9 milliseconden. Bereid 20 milliliters gesmolten 1,5% agaroze in 1X PBS voor en giet dit in een petri-schaal van 10 centimeter.Plaats vervolgens een gegroefde injectievorm in de warme agar om voren in de uitgeharde gel te vormen voor het anesthetiseren van de larven. Plaats ze in 100 milliliters aquariumwater met 20 milligrams per liter trican. Nadat ze niet meer reageren op aanraking, gebruik dan een plastic pastorpipet om de larve voorzichtig over te brengen naar een groef van de natte agarmal, zodat de ventrale zijde naar de verticale agarwand van de groef is gericht.Plaats de aros-plaat onder de stereomicroscoop zodanig dat de ventrikel van de injectienaald af is gekeerd. Laat vervolgens de naald zakken en voer deze ongeveer één tot twee micrometer in de hartventrikel in. Let er hierbij op dat de naald niet te diep wordt ingebracht.Inject vervolgens een puls van 3 nL Morpho-oplossing in het ventrikel en wacht tot het hart is geleegd voordat u dit herhaalt met vijf extra pulsen na de injectie; verwijder de naald en plaats deze in een petrischaal met XPBS om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een transferpipet gevuld met E3-medium om de larven voorzichtig terug te brengen naar een petrischaal met vers E3-medium om de opname en het behoud van de morpho in de cellen te waarborgen. Herhaal de injecties elke 12 tot 24 uur gedurende de looptijd van het experiment om de injecties te evalueren.Nadat de vissen zijn geanestheseerd, plaatst u ze op een vlakke, natte agarplaat bedekt met E three-medium voordat u ze afbeeldt met een stereomicroscoop met helderveld- en fluorescentie-instellingen. Analyseer de beelden op regeneratie met de gratis software Fiji Image J en gebruik de 'line tracing'-tool om de hoeveelheid regeneratieve groei te bepalen. Kalibreer eerst de beelden door een bestand in het hoofdvenster van Fiji in het hoofdmenu te slepen en neer te zetten.Stel de schaal voor alle afbeeldingen in door in het vervolgkeuzemenu op analyze te klikken. Klik op set scale en activeer vervolgens de globale optie door het selectievakje aan te vinken. Sleep de afbeelding nu opnieuw naar de werkbalk om de hoeveelheid regeneratieve groei te meten.Kies de tool voor vrije selectie en omcirkel het gebied dat gemeten moet worden. Druk tot slot op Ctrl M. Hiermee wordt een nieuw resultatenvenster geopend waarin de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels wordt weergegeven. Zoals hier te zien is binnen enkele minuten na injectie, verspreidt de morpho endo porter-oplossing zich via de vasculatuur naar verschillende weefsels, zoals de vinvouw en de hersenen, gedurende ten minste 12 uur of langer.Om de regeneratie van distale larvale vinstructuren te beoordelen, werden de volgende onderdelen verwijderd: de distale punt van de vinfouwing en het ruggenmerg, het distale no-koord, de distale rompspier, die hier niet zichtbaar is, en pigmentcellen, die moeilijk direct via injectie te bereiken zijn, maar na seriële ventriculaire injecties de morpho lijken op te nemen. Deze methode bevordert dus relatief eenvoudig de afgifte van morpho aan weefsels die individueel moeilijk te targeten zijn, en maakt het mogelijk om de genfunctie in verschillende weefsels van de regenererende vin gelijktijdig te beoordelen. Om het belang van specifieke genen die betrokken zijn bij regeneratie te analyseren, wordt de larvale coddle-vin gedeeltelijk geamputeerd en worden alle weefsels die de morpho hebben opgenomen geresecteerd.Zoals aangetoond, regenereert de vinvouw van de larve zijn structuur binnen enkele dagen na amputatie. Hierbij was morpho gericht op genen die nodig zijn voor regeneratie, waardoor de regeneratierespons werd verstoord in vergelijking met niet-geïnjecteerde controles en mismatch morpho-controles na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van regeneratie om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regeneratie van de vin van de zebravis.

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Het protocol beschrijft gerichte knockdown van genexpressie bij zebravissen door morfolino-injectie in de staart.

Morpholino-injectie: een methode om doelgenexpressie neer te halen om functie bij zebravissen te bestuderen

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.

Zebravis hersenventrikel Injection

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Leer een reverse-genetische morfolino-methode voor genfunctie-onderzoek tijdens weefselregeneratie bij zebravislarven via intraventriculaire injecties.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren (Video) | JoVE Journal

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Meer video's verkennen