Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Het algemene doel van deze procedure is het toedienen van morpholino-oligonucleotiden via ventriculaire injecties in de larve, de vinnencoddel, en het uitschakelen van genen om hun functie tijdens regeneratie te beoordelen. Dit wordt bereikt door de larve eerst te anesthetiseren en in een groef van de aros-mal te plaatsen. Vervolgens wordt de injectienaald in de hartventrikel ingebracht.

Vervolgens wordt de morpho-oplossing vier tot zes keer in het ventrikel geïnjecteerd, met wachtintervallen tussen de pulsen om het hart de tijd te geven om te klaren. Ten slotte wordt de rugvin geamputeerd en drie dagen lang regeneratie toegestaan. Uiteindelijk kan het effect op de regeneratie van de vin worden beoordeeld door het geregenereerde oppervlak van de vin te meten met de line tracing-tool van de open-source software Fiji ImageJ.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transgenese of mutagenese, is dat het de knockdown van genen door morpholino's mogelijk maakt in larvale weefsels die niet geschikt zijn voor directe injecties. Plaats een glazen capillair met een diameter van 0,75 millimeter in een needle puller en trek de naald met de volgende parameters; breek vervolgens met horlogemakerspincetten en onder een stereoscoop met een micrometer-oculair de getrokken capillair af om een naald met een diameter van 20 micrometer te verkrijgen. Gebruik daarna een draaibank met een rubberen slijfwiel om de naald aan te scherpen en een facet van 20 micrometer te creëren. Bereid de morpho-stamoplossing voor door het geliofiliseerde morpholino op te lossen in 1x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 7,5 millimolair.

Meng de Morpho-injectieoplossing door 2,5 µL Morpho-stockoplossing te combineren met 2,8 µL van een 1 mM endo Porter-stockoplossing voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 mM morpho en 0,5 mM endo porter om de injecties uit te voeren. Gebruik een micropipet met een 10 µL tip om de schuine glazen naald te vullen met 5 µL Morpho-oplossing. Plaats vervolgens de glazen naald in de naaldhouder van de micromanipulator die is aangesloten op de pneumatische picopomp.

Stel de hoek voor de injecties in op ongeveer 45 graden, zodat de naald slechts in één vlakke richting bewogen hoeft te worden. Stel vervolgens de waarden van de micro-injector als volgt in: een houdruk van 20 pounds per square inch of PSI, een uitstootdruk van 15 PSIA, een gating-interval van 100 milliseconde en een periode-waarde van 1,9, wat overeenkomt met 10,9 milliseconden. Bereid 20 milliliters gesmolten 1,5% agaroze in 1X PBS voor en giet dit in een petri-schaal van 10 centimeter.

Plaats vervolgens een gegroefde injectievorm in de warme agar om voren in de uitgeharde gel te vormen voor het anesthetiseren van de larven. Plaats ze in 100 milliliters aquariumwater met 20 milligrams per liter trican. Nadat ze niet meer reageren op aanraking, gebruik dan een plastic pastorpipet om de larve voorzichtig over te brengen naar een groef van de natte agarmal, zodat de ventrale zijde naar de verticale agarwand van de groef is gericht.

Plaats de aros-plaat onder de stereomicroscoop zodanig dat de ventrikel van de injectienaald af is gekeerd. Laat vervolgens de naald zakken en voer deze ongeveer één tot twee micrometer in de hartventrikel in. Let er hierbij op dat de naald niet te diep wordt ingebracht.

Inject vervolgens een puls van 3 nL Morpho-oplossing in het ventrikel en wacht tot het hart is geleegd voordat u dit herhaalt met vijf extra pulsen na de injectie; verwijder de naald en plaats deze in een petrischaal met XPBS om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een transferpipet gevuld met E3-medium om de larven voorzichtig terug te brengen naar een petrischaal met vers E3-medium om de opname en het behoud van de morpho in de cellen te waarborgen. Herhaal de injecties elke 12 tot 24 uur gedurende de looptijd van het experiment om de injecties te evalueren.

Nadat de vissen zijn geanestheseerd, plaatst u ze op een vlakke, natte agarplaat bedekt met E three-medium voordat u ze afbeeldt met een stereomicroscoop met helderveld- en fluorescentie-instellingen. Analyseer de beelden op regeneratie met de gratis software Fiji Image J en gebruik de 'line tracing'-tool om de hoeveelheid regeneratieve groei te bepalen. Kalibreer eerst de beelden door een bestand in het hoofdvenster van Fiji in het hoofdmenu te slepen en neer te zetten.

Stel de schaal voor alle afbeeldingen in door in het vervolgkeuzemenu op analyze te klikken. Klik op set scale en activeer vervolgens de globale optie door het selectievakje aan te vinken. Sleep de afbeelding nu opnieuw naar de werkbalk om de hoeveelheid regeneratieve groei te meten.

Kies de tool voor vrije selectie en omcirkel het gebied dat gemeten moet worden. Druk tot slot op Ctrl M. Hiermee wordt een nieuw resultatenvenster geopend waarin de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels wordt weergegeven. Zoals hier te zien is binnen enkele minuten na injectie, verspreidt de morpho endo porter-oplossing zich via de vasculatuur naar verschillende weefsels, zoals de vinvouw en de hersenen, gedurende ten minste 12 uur of langer.

Om de regeneratie van distale larvale vinstructuren te beoordelen, werden de volgende onderdelen verwijderd: de distale punt van de vinfouwing en het ruggenmerg, het distale no-koord, de distale rompspier, die hier niet zichtbaar is, en pigmentcellen, die moeilijk direct via injectie te bereiken zijn, maar na seriële ventriculaire injecties de morpho lijken op te nemen. Deze methode bevordert dus relatief eenvoudig de afgifte van morpho aan weefsels die individueel moeilijk te targeten zijn, en maakt het mogelijk om de genfunctie in verschillende weefsels van de regenererende vin gelijktijdig te beoordelen. Om het belang van specifieke genen die betrokken zijn bij regeneratie te analyseren, wordt de larvale coddle-vin gedeeltelijk geamputeerd en worden alle weefsels die de morpho hebben opgenomen geresecteerd.

Zoals aangetoond, regenereert de vinvouw van de larve zijn structuur binnen enkele dagen na amputatie. Hierbij was morpho gericht op genen die nodig zijn voor regeneratie, waardoor de regeneratierespons werd verstoord in vergelijking met niet-geïnjecteerde controles en mismatch morpho-controles na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van regeneratie om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regeneratie van de vin van de zebravis.