Name: Dissectie en Downstream Analyse van Zebravinken embryos in een vroeg stadium van ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een dissectiemethode voor zebravinkembryo's (Taeniopygia guttata) in vroege ontwikkelingsstadia voor morfologische en moleculaire analyses. Deze techniek minimaliseert weefselschade en ondersteunt toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken hun financieringsbronnen, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education Program aan de Universiteit van William en Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant nummer: R15NS067566. Ze steun van het College of William and Mary, Departement Biologie en Hogeschool voor de Kunsten en Wetenschappen voor hulp bij de verzorging van dieren ook erkennen.

Ethiek Verklaring: De methoden werden uitgevoerd met gedomesticeerde zebravinken uit de broedkolonie in het College of William and Mary. Alle procedures gevolgd RSPCA richtlijnen 23 en werden goedgekeurd door het College of William and Mary&#39;s OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Dierenwelzijn Assurance (# A3713-01) en had Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedkeuring (# 2013-06 -02-8721-Dacris). 1. Egg Collection en incubatie <ol><li> Vestigen zebravink paren op een 14:10 licht: donker cyclus. Leveren voedsel, water, hooi, en een nestkast ad libitum. Opmerking: Algemene verzorging en fokken voor zebravinken is goed beschreven 23. </li><li> Bereid een standaard kuiken incubator met kantelen planken. Opmerking: Houd de kunstmatige incubator bij 37,5 (+ / - 1) ° C 80 - 95% vochtigheid door toevoeging van water aan de onderkant van de incubator op een dagelijkse basis. Laat de incubator equilibreren twee dagenvoor gebruik. <ol><li> Selecteer klein-feed cups (5 x 7,6 cm) van ten minste 2,5 cm diep om eieren te houden in de incubator. Bekleed de bodem en de onderkant van de beker met twee lagen keukenpapier zodat de beker is opgevuld, terwijl u toch de eieren gemakkelijk rollen. Plaats deze koppen op de kantelen planken van de incubator. Er zijn te veel padding kan rollen remmen, die zal voorkomen dat succesvolle incubatie wijten aan embryonale hechting aan de shell interieur. </li></ol></li><li> Verzamel de eieren twee uur na het begin van de lichtcyclus. Opmerking: Dit minimaliseert verschillen in fase van ontwikkeling voor een bepaalde incubatietijd wegens ouderlijke incubatie. <ol><li> Neem eieren voorzichtig met duim en wijsvinger op de top en de basis langs de lengte van het ei. Gebruik een doffe, zachte 4B grafiet potlood om de vastgestelde datum en tijd verzameld uit het nest te labelen. Opmerking: De zachtere 4B potlood vermindert het risico van het potlood breken de breekbare eierschaal. </li><li> 1.3.2) Plaats 1-5 gelabeld eieren per cin de incubator zodat eieren vrij kan rollen embryonale hechting aan het inwendige van het reservoir voorkomen. Opmerking: Als u meer dan 5 eieren in een kopje kan rollen van de individuele eieren voorkomen en te verminderen levensvatbaarheid van embryo&#39;s. </li></ol></li></ol> 2. Verwijdering van Embryo van Egg <ol><li> Ter voorbereiding van dissectie, assembleren de volgende materialen: een schone scalpel, fijne getipt tang, en twee extra fijne tip pincet. Plaats 10 x 10 cm weegt papier op basis van het ontleden scope een schone, niet-absorberend oppervlak voor dissectie. Opmerking: De wegen papier is van cruciaal belang omdat het mogelijk maakt eenvoudige manipulatie van de dooier en is de beste ondergrond voor het snijden van de delicate membranen met een scalpel. </li><li> Bereid een hoeveelheid fosfaatbuffer zoutoplossing (1X PBS) in een 50 ml polypropyleen buis, en het verwerven van ten minste drie pipetten en een kleine afval emmer. Indien herstel van embryo&#39;s, bereiden een hoeveelheid van 4% paraformaldehyde (PFA). Let op: PFA dampen zijn giftig, eend alle stappen waarbij PFA moet gebeuren in een zuurkast om blootstelling te minimaliseren. Als flits bevriezen van de embryo&#39;s, verkrijgen vloeibare stikstof en bewaar deze in de buurt van het ontleden scope. Steriliteit is geen probleem voor deze dissectie protocol, maar ervoor zorgen dat alle materialen schoon zijn. </li><li> Verwijder het ei uit de incubator op het tijdstip nodig is voor de gewenste fase zoals beschreven in de zebravink staging geleiding 22. Opmerking: Verwijder de eieren na 36 uur incubatie te ontleden etappe 6 embryo&#39;s (Figuur 4A) 22 en verwijder de eieren na 56 uur incubatie te ontleden stadium 12 embryo&#39;s (Figuur 3A) 22. </li><li> Met behulp van een glasvezel-verlichting lamp, kaars het ei door vast te houden langs de verticale as en glans licht door het ei om het interieur te verlichten. Plaats de punt van het licht achter het ei en zoek de dooier en het zich ontwikkelende embryo. <ol><li> Plaats de scalpel op de zijde tegenover de dooier en snijd langs het ei van top totbase met vage druk. </li></ol></li><li> Verwijder de inhoud van het ei door nauwkeurige toepassing door op de punt en de basis van het ei met de duim en de wijsvinger of voorzichtig wrikken elkaar de schalen langs de snijlijn met een tang. Open het ei direct boven de wegen papier, zodat de dooier voorzichtig rolt. </li><li> Onderzoek de dooier voor de witte zone van splitsing, die zichtbaar is als een vage witte ring rondom de embryonale ontwikkeling en oriënteren de dooier met behulp van extra fijne getipt tang zodat het embryo is gelegen in het centrum. Opmerking: Als een vage witte cirkel op het oppervlak van de dooier niet wordt waargenomen, neemt de fijne tang en voorzichtig rollen de dooier over totdat het embryo is op de top van de dooier. Opmerking: Voor stap 1 - 9 22, de embryonale schijf minder dan 6 mm in diameter en is zichtbaar als een zwakke licht ondoorzichtige schijf op het oppervlak van de dooier - zie Figuur 1 voor referentie. Voor podia 10 jaar en ouder 22, bloed zwembaden toestaan ​​verbeterd visibility van het embryo, maar zorg om te voorkomen dat aanprikken van de dooierzak, want dit maakt het lokaliseren van de embryo moeilijk. </li></ol> 3. Scheiding van Embryo van extra-embryonaal weefsel <ol><li> Doorprik de randen van de dooier druk (figuur 1B) te verlichten, en maak steekslagen over de lengte van de dooier diameter langs de embryonale schijf. Herhaal maken van deze diagonale lijnen tot het gedeelte van de dooier die het embryo met succes gescheiden (Figuur 1B). Opmerking: deze stap kan de dooier massa intact, maar de verlaagde druk op het oppervlak van de dooier zorgt voor meer precisie bij het snijden in het embryo, het voorkomen van schade embryonale structuren. </li><li> Verwijder de randen van de dooier met een transferpipet. Opmerking: Verwijder zoveel dooier mogelijk, maar laat een klein bedrag, zodat het embryo zich niet houdt aan de droge ondergrond van de wegen papier en scheuren. </li><li> Was de embryonale schijf door dispensing 1X PBS bij 45 ° naar de bodem van het embryo. Plaats de punt van de pipet naast-niet boven de embryonale schijf. Indien extra dooier moet worden verwijderd lijk is dooier met de scalpel op de wegen papier alvorens het embryo de petrischaal. Opmerking: Deze methode verwijdert het embryo uit het oppervlak van het papier te wegen. </li><li> Breng de embryo met een pipet met een minimaal volume 1X PBS tot een kleine plastic petrischaal. Was de embryo door het toevoegen van meer 1X PBS in de petrischaal en druipend 1X PBS in de buurt, maar niet direct op, het embryo. Swirl de petrischaal te wassen en te verwijderen resterende dooier, kantel de petrischaal en verwijder afval 1X PBS met de overdracht pipet. OPMERKING: Bij de 1X PBS wordt verwijderd, het embryo meestal niet hecht aan de bodem van de petrischaal omdat het kunststof oppervlak is glad met residuele 1X PBS. Echter, meer 1X PBS worden toegevoegd indien het embryo kleeft aan het gerecht. Als bevestiging thij embryo, volg dan de stappen 3.5 en 3.6. Als flits bevriezen van de embryo, doorgaan naar onmiddellijk stap 3.8. </li><li> Indien herstel van het embryo voor in situ hybridisatie, onmiddellijk aan toevoegen 4% PFA aan de petrischaal om het embryo dompelen. Druppel 4% PFA direct op de bovenkant van het embryo om het plat; dit voorkomt dat het embryo van curling. Bevestig de embryo in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 12 uur. <ol><li> Na fixatie dehydrateren embryo gegradeerde methanol (MeOH) oplossingen en bewaar bij -20 ° C in 100% MeOH. </li></ol></li><li> Als het embryo tussen fasen 1-8 22, verwijder de vitelline membraan gehecht aan het embryo. Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd tijdens of na fixatie. Embryo jonger dan 8 fase 22 niet gemakkelijk zichtbaar omdat zij zich aan de vitelline-membraan, verduistert sleutelstructuren zoals getoond in figuur 2A. <ol><li> Pak de rand van het membraan dat buiten de zone van de kruising met de extra fijne pincet. Carefully flip het embryo over meerdere malen weg te wassen resterende dooier korrels en de hechting van de embryonale schijf naar de vitelline membraan los. Opmerking: Raak het midden van het embryo, omdat dit embryonale structuren beschadigen. </li><li> Als een kloof lijkt er niet tussen de zone van knooppunt en de vitelline membraan, zachtjes krassen op de zone van de kruising met de extra fijne getipt tang om het los te maken van de vitelline membraan. Pak de vitelline membraan met de extra fijne tip pincet en trek het voorzichtig uit de buurt van het embryo. Indien nodig, trek het embryo uit de buurt van de vitelline membraan door het vastgrijpen van de perifere rand van de embryonale schijf op de zone van kruising. </li><li> Gooi de vitelline membraan in biohazard 1 afval (bioveiligheid niveau 1) na verwijdering. </li></ol></li><li> Bij het ​​uitvoeren van een ISH test op jonge embryonale stadia, volgt standaard hele mount ISH protocollen voor kippenembryo&#39;s 24, 25, maar rekening houden met de volgende suggesties. <ol&gt; <li> Om beschadiging van de embryo&#39;s te verminderen tijdens de ISH procedure, gebruik een enkele 5 ml glazen flacon met een schroefdop voor elk embryo. Vul alleen flacons met 2-3 ml van de oplossing, zodat de embryo&#39;s volledig worden ondergedompeld. Nutate flesjes verticaal door het plaatsen van 5 ml flacons in een piepschuim rack (of rek die de flesjes goed gesloten houden) die is bevestigd aan een nutator. Opmerking: Deze voorzorgsmaatregel voorkomt het embryo worden gesleept, die kunnen optreden wanneer het in contact komt met het deksel van de injectieflacon in horizontale nutatie. </li><li> Voor embryo stadium 0-6 22, behandelen met 5 ug / ml proteïnase K in 1X PTW gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Behandel embryo opgevoerd 7 - 12 22 met 10 ug / ml proteïnase K in 1X PTW gedurende 10 min bij 37 ° C om achtergrondkleuring te verminderen. </li><li> Om voldoende kleurreactie produceert lage niveaus van genexpressie te detecteren in stap 1 - 10 22, geïncubeerd met 10 ug / ml probe concentratie 12 uur. Voor oudere stadia, incubeer met 1 &amp; #956, g / ml concentratie probe bij 60 ° C. </li></ol></li><li> Na dissectie 3 ml 1X PBS om de petrischaal en kantel de petrischaal om het embryo te scheiden van de dooier korrels - Als-flits bevriezen van de embryo, snel toe te voegen 2. Verwijder de vloeistof en herhaal 2-3 keer om alle dooier te verwijderen. Met behulp van fijne getipt tang, overdracht embryo een pre-gelabelde microcentrifugebuis en flits bevriezen in vloeibare stikstof voor het opslaan bij -80 ° C. </li></ol> 4. Edu celproliferatietest. Oprichting en Detectie van Edu in Zebravinken Embryo&#39;s. <ol><li> Kaars het ei met behulp van een glasvezel-verlichting lamp voor het embryo of de dooier te lokaliseren. </li><li> Markeer de kant van het ei tegenover de locatie van het embryo of dooier in het ei zodat het embryo niet wordt beschadigd tijdens de micro-injectie proces. </li><li> Bekleed een 60 mm kunststof schaal met klei en schimmels in de vorm van een kom om het ei te houden in de gewenste oriëntatie. De gemarkeerde plaats moetgericht op het inbrengen van de micro-injectie naald met de micromanipulator mogelijk. Opmerking: De klei wordt het ei stabiliseren tijdens micro-injectie en gedurende de incubatie in stap 4.11. </li><li> Trek twee glazen capillaire micro-injectie naalden. Blunt een naald om een ​​gaatje te prikken in het ei op de gemarkeerde plek. Bereid de tweede micro-injectie naald voor injectie door back-loaden met minerale olie en deze in de microinjector. </li><li> Stel het volume van de oplossing vrijkomt per injectie 59,8 nl op de microinjector. </li><li> Plaats de micro-injectie naald met de 10 mM voorraad EDU oplossing. </li><li> Maak een gat in de schelp op de gemarkeerde plek met de afgestompte glazen capillair, zorg ervoor dat niet breken de shell of drop stukken van de schaal in het ei holte. Richt het ei, zodat het gat in een hoek van 45 °, waardoor de micro-injectie naald rechtstreeks door de holte worden ingebracht om de dooier of embryo. </li><li> Met behulp van de micromanipulator, plaatst u degeladen naald ongeveer 1,0 cm in de holte. </li><li> Injecteer de gewenste hoeveelheid van de EDE oplossing direct op het ontwikkelende embryo en de dooier. Opmerking: Er kunnen maximaal 478 nl van Edu kan worden geïnjecteerd zonder dat dit tot embryonale sterfte. </li><li> Onmiddellijk wikkel het ei en de houder klei met meerdere lagen plasticfolie het ei en de schotel verdroging van het embryo tijdens incubatie voorkomen dekken. Tape de randen van de plastic wikkel om de bodem van de schaal te voorkomen dat de kunststof uitpakken tijdens incubatie. Opmerking: De plastic verpakking mag alleen onmiddellijk vóór versnijding worden verwijderd. </li><li> Laat de nieuw prolifererende cellen de EDE nemen door incuberen van de eieren bij 37 ° C totdat het gewenste stadium is bereikt. Na injectie, doe ei niet terug naar kantelen planken in incubator. Plaats de plastic verpakte klei beklede schaal op stabiele ondergrond in de couveuse. </li><li> Verwijder de plasticfolie en ontleden het embryo na de eerder genoemde protocol.Bevestig het embryo in 4% PFA en incubeer 12 uur bij 4 ° C zoals hierboven beschreven. Na fixatie, wassen met 100% ethanol (EtOH) gedurende 5 min en opslag in vers 100% EtOH bij -20 ° C tot verdere analyse. </li></ol> 5. Edu &quot;Klik&quot; Reactie Protocol De volgende stappen zijn allemaal uitgevoerd in glazen flesjes. <ol><li> Rehydrateren embryo&#39;s met telkens 5 min wasbeurten van de volgende: </li><li> EtOH, 75% EtOH en 25% steriel gedeïoniseerd gedistilleerd (SDD) water, 50% EtOH en 50% sdd water, 25% EtOH en 75% 1X PTW, 100% 1X PTW </li><li> Was driemaal 100% 1X PTW gedurende 10 min. elk. </li><li> Verdun de buffer additiereactie (Kit Component F) door combinatie van 1 deel van de 10X voorraad bufferoplossing (10 pl) tot 9 delen sdd water (90 ui). </li><li> Bereid het reactiemengsel in een afzonderlijke buis door mengen van de volgende: 875 pi 1X PBS, 20 gl CuSO 4, 5 pl azide, 100 ul verdund reactiebuffer additief.Opmerking: Het volume van het reactiemengsel kan worden afgebouwd. De reactie werkt als het embryo volledig bedekt in het reactiemengsel. Voeg de verdunde reactie buffer additief (stap 5.3) direct voor gebruik. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in het donker. Bedek de embryo&#39;s met folie ter bescherming tegen het licht. </li><li> Bedek de flesjes met aluminiumfolie en incubeer ze verticaal bij kamertemperatuur gedurende twee uren door ze in een piepschuim rek bevestigd aan een nutator. </li><li> Was de embryo 3 maal in vers 1X PBS gedurende 10 min. elk. </li><li> Incubeer de embryo in vers 4% PFA gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Was 3 keer in 1X PBS gedurende 10 min. elk en bewaar in vers 1X PBS bij 4 ° C. Bedek de embryo&#39;s met folie tot verdere analyse. </li></ol>

<ol><li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+2%2C2%27%2C4%2C4%27%2C5-pentabromodiphenyl+ether+%28BDE-99%29+affects+mating+behavior+of+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li>
<li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small%2C+model+songbird%2C+the+zebra+finch+%28Taeniopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li>
<li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li>
<li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Language%22%5BJournal%5D)">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li>
<li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+Song%3A+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li>
<li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li>
<li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+birdsong%3A+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li>
<li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus%3A+Research+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li>
<li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li>
<li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick%3B+a+great+model+system+becomes+even+greater%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li>
<li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+subpallium%3A+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+staging+of+the+zebra+finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li>
<li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+birds%3A+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF%2FFRAME+%2FRSPCA%2FUFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li>
<li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li>
<li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li>
<li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+impairment+in+zebra+finches+%28Taeinopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li>
<li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li>
<li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development%3A+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li>
<li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Auk%22%5BJournal%5D)">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li>
<li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell%E2%80%93Interdependent+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon%3A+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Recente ontwikkeling van een embryologische enscenering gids 22 en genoomannotatie maken de zebravink een wenselijke modelorganisme voor ontwikkelingsstudies. Echter, de geringe omvang en de kwetsbaarheid van de zebravink embryo&#39;s, die variëren van 3 tot 7 mm in stappen 1 - kan 10 22, dissecties moeilijk 11, 14 maken. Lokaliseren en schoon verwijderen van embryo&#39;s van het oppervlak van de dooier kan een uitdaging zijn. Dit protocol biedt voldoende gedetailleerd zijn om de procedure uit te voeren met gemak. Dit protocol toont de kritische stappen die niet bekend staat, maar zijn noodzakelijk om een ​​succesvolle dissectie waarborgen. Zo is het essentieel om een ​​laagje eigeel tussen het embryo en vel papier wegen uit te sluiten plakken verlaten. Zowel de identificatie en verwijdering van het embryo kan moeilijk zijn. Om problemen met het identificeren van de embryo op het oppervlak van de dooier, schijnen licht direct boven de dooier nadat zijverwijderd uit het ei, en kijk naar de dooier op een 45 ° hoek met de embryo vinden. Zodra het embryo ligt, snijd de dooier op weeg papier en zorg ervoor dat niet scheurt het embryo. Als verdere toepassingen omvatten imaging anatomische verschillen, in situ hybridisatie of celproliferatie assays, is het belangrijk om de vitelline membraan te verwijderen in fase 1-8 22 voor een betere visualisatie van structuren. Als moeilijkheden ondervindt bij het verwijderen van de dooier of het vitelline membraan in een vroeg stadium, bevestig de embryo in 4% PFA vóór het wassen in 1X PBS om embryonale kwetsbaarheid te verminderen. Door eerst de vitelline membraan tijdens dissectie zoals beschreven, structuren zijn duidelijk zichtbaar en intact in zebravink embryo&#39;s na het uitvoeren van een in situ hybridisatie. Een beperking van Edu is dat toediening van de dosering volumes meer dan 478 nl leidt tot embryonale fataliteit. Echter, de overgrote doseringstraject laat varying niveaus van proliferatieve cel tagging. De &quot;klik&quot; reactie die in deze kit is de Koper (I)-gekatalyseerde-Alkyn-azide-Cycloadditiereacties (Cu (I) AAC). In dit specifieke reactie, is een-alkyn bevattende thymidine analoog molecuul (EDU) opgenomen door actief delende cellen. De alkyn groep in de EDU uitsteekt uit de helixstructuur van het DNA, en wordt gedetecteerd door blootstelling aan een azide molecuul geconjugeerd aan een groen, fluorescent molecuul dat bindt aan het vrije alkyn groep. De groene fluorescentie geeft de nieuw prolifererende cellen in de embryo. De bio-orthogonaliteit van het azide en alkyn groepen voorkomt niet-specifieke kleuring, omdat deze reactieve soorten niet van nature aanwezig in organismen. Ook, omdat het DNA niet te worden gedenatureerd zodat de reactie optreedt, kan verder DNA-afhankelijke analyse gemakkelijk uitgevoerd 27. Een inherente beperking van deze werkwijze is de geringe omvang en fragiliteit van zebravink embryo&#39;s. Het verwijderen van de vitelline membraan van embryo stadia 1-15 22 kan leiden tot schadelijke embryonale structuren wanneer niet met de nodige voorzichtigheid. Echter, dit protocol vereenvoudigt de uitsnijmethode, waardoor onderzoekers vroege embryonale stadia om structurele afwijkingen en genexpressie die niet eerder bestudeerd onderzoeken. Dit protocol maakt de weg vrij voor een overvloed van cellulaire-moleculaire testen waarmee de onderzoekers om de ontwikkelingsdoelen oorsprong van volwassen fenotypes te bepalen. Zo zal het mogelijk zijn onderzocht genexpressie betrokken bij oefendoeleinden onder verschillende omgevingscondities of volgende farmacologische behandelingen in de eerste ontwikkelingsfase 28, 29,30,31. Hoewel niet aangetoond in dit artikel, deze methode mogelijk maakt voor andere procedures, zoals radioactieve in situ hybridisatie op zebravink weefsel secties en elektroporatie / in ovo operatie 32, 33,34. Gezien het feit dat de zebravink is opgericht als een belangrijk modelorganisme in een enorme hoeveelheid literatuur, zoals studies onbenutte kansen om ontwikkelingsstoornissen mechanismen koppelen met volwassen fysiologie en gedrag, in het bijzonder de ontwikkeling van taal 7, 9.

Het algemene doel van deze techniek is om zebravink (Taeniopygia guttata) embryo&#39;s te verkrijgen vanaf de vroegste stadia van de embryogenese voor gebruik in een breed scala van ontwikkelingsstudies. Zebravinken zijn geworden van de overheersende zangvogel modelorganisme en zijn uitgebreid gebruikt in een verscheidenheid van terreinen, waaronder toxicologie 1,2, gedrag 3, het geheugen en het leren 4,5,6, vergelijkende neuroanatomie 7,8 en taalontwikkeling 9,10 . Als enige zangvogel met een gesequenced genoom, de zebravink maakt moleculaire en genetische studie van de Passeriformes orde, die meer dan 50% van de gekende vogelsoorten 11, 12,13 vertegenwoordigt. Ondanks het gebruik van volwassen en jonge zebravink in een uiteenlopende reeks van gebieden, hebben weinig studies zijn uitgevoerd op zebravinken embryo&#39;s, met name tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. Dit kan worden toegeschreven aan de geringe omvang van de eieren eennd embryo en de nieuwere status als modelorganisme 14,15,16 voor studies waarin de kip (Gallus gallus domesticus) eerder als overheersende modelsysteem 17,18,19,20,21. Echter, als niet-vocale leerlingen, kippen zijn niet geschikt modelsysteem voor het bestuderen van de genetische basis van vocale leren, ontwikkeling van de vocale leren, erfelijkheid, gedrag, en de corticale-basale ganglia circuits betrokken bij motorische leren 10. Het is belangrijk op te merken dat de zebravink embryo&#39;s zijn veel gevoeliger en gemakkelijker beschadigd dan kippenembryo&#39;s tijdens dissectie en moleculaire procedures. In het bijzonder wordt een grotere zorgvuldigheid vereist bij het uitvoeren van permeabilization stappen op zebravink embryo&#39;s. Sterke reinigingsmiddelen en enzymen die niet schadelijk zou een kippenembryo kan zebravinken embryo beschadigen. In termen van algemene zorg, is het noodzakelijk om zebravink eieren in kleine kopjes in een incubator gebracht vóór plaatsingom te voorkomen dat ze breken bij het rollen tijdens incubatie. Zebravink vatbaar zijn voor gedragsonderzoek, het hele jaar door in gevangenschap gemakkelijk en vruchtbaar ras, en zijn vocale leerlingen. Deze kenmerken maken het gebruik van zebravink tot de noodzaak van een modelorganisme dat ontwikkeling, genetica, en gedragsmatige aspecten van taal integreert pakken. De dissecties methoden hieronder beschreven, in combinatie met een recent ontwikkelde enscenering gids specifiek voor zebravinken 22, maken de zebravink een steeds nuttig gestandaardiseerde ontwikkelings modelorganisme. Echter, het verkrijgen van embryo&#39;s in een vroeg stadium kan ontmoedigend zijn. Dit protocol kunnen onderzoekers vroeg stadium embryo gemakkelijk te verkrijgen. Studies die de vroege ontwikkeling en de moleculaire ontwikkelingsbiologie basis van complexe gedragingen in zebravinken, of de toxicologische effecten op de ontwikkeling in andere kleine, zal zangvogels vinden dit dissectie methode bruikbaar.

<table><tbody><tr><td>Chicken egg incubator</td><td></td><td></td><td>We gebruiken een Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Detectie van celproliferatie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop&nbsp;</td><td></td><td></td><td>We gebruiken Olympus SZ61</td></tr><tr><td>7'' Drummond capillair voor Nanoject II injector</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II microinjector</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pincet #55</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon buis (polypropyleen)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Lysis Matrix H tubes</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>Gebruikt voor RNA extractie, gebruikt om embryo's te homogeniseren</td></tr><tr><td>Vezel optische verlichtingslampen (High Intensity Illuminator)</td><td>Dolan-Jenner Industries&nbsp;</td><td>Fiber-Lite MI-150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glazen buisjes met schroefdop (DEPC behandeld)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge eppe buisje (1.5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Mineraal olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>Modelleringsklei</td><td></td><td></td><td>Elk merk</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 naaldtrekker</td><td>Narshige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead Ruptor Homogenizer</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td>Gebruikt voor RNA extractie</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, pH aanpassen naar 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS</td><td>Fixatie van embryo's. Let op, is schadelijk en niet inhaleren.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1.800 ml Barnstead H2O, pH aanpassen naar 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasisch, 14.196 g Na2HPO4 dibasisch, 200 ml Barnstead H2O, pH aanpassen naar 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline met 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1.800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, pH aanpassen naar 7.4, 2 ml Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 ml Plastic Petri schaaltje&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic folie</td><td></td><td></td><td>Elk merk</td></tr><tr><td>Prepease RNA Spin Kit</td><td>PrepEase, Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>Gebruikt voor RNA extractie, gebruikt om embryo's te homogeniseren</td></tr><tr><td>Reactie Mix: 875 &mu;l 1xPBS, 100 mM 20 &mu;l CuSO4 (Kit Component E), 5 &mu;l Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 &mu;l verdunde reactie buffer additief (Kit Component F)</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Detectie van celproliferatie.&nbsp;</td></tr><tr><td>sdd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zaaibeker&nbsp;</td><td></td><td></td><td>We gebruiken het als container bij het incuberen van eieren</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen scalpel&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard nestkast</td><td></td><td></td><td>We gebruiken Abba Plastic Finch Nestboxes</td></tr><tr><td>4 ml, Teflon Gecoate Dop, Glazen Buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetten (polyethyleen)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 weegpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie en downstream analyse van zebravinken embryo&#39;s in een vroeg stadium van ontwikkeling

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

De zebravink (Taeniopygia guttata) is uitgegroeid tot een steeds belangrijker modelorganisme in vele gebieden van onderzoek, waaronder toxicologie 1, 2, 3 gedrag, en het geheugen en het leren 4,5,6. Als enige zangvogel met een gesequenced genoom, de zebravink heeft een groot potentieel voor gebruik in ontwikkelingsstudies; echter, de vroege stadia van ontwikkeling zebravink niet goed bestudeerd. Gebrek aan onderzoek in zebravink ontwikkeling kan worden toegeschreven aan de moeilijkheid van het ontleden van de kleine ei en embryo. De volgende dissectie methode kunnen embryonaal weefsel schade, die zorgt voor het onderzoek van de morfologie en genexpressie in alle stadia van embryonale ontwikkeling. Dit kan zowel helderveld en fluorescentie beeldvorming van kwaliteit embryo, gebruiken moleculaire procedures zoals in situ hybridisatie (ISH), celproliferatie assays en RNA-extractie voor kwantitatieve assays zoals kwantitatieve real-time PCR (qtRT-PCR). Deze techniek kunnen onderzoekers de vroege stadia van ontwikkeling die voorheen moeilijk toegankelijk waren studeren.

De stappen schematisch in figuur 1 geven de verschijning van het embryo, terwijl aan de vitelline-membraan (A) en is de juiste methode om het embryo te scheiden van de dooier (B). Het embryo kan worden geïdentificeerd door de zone van de splitsing, dat is veel lichter dan de vitelline membraan. De embryo zelf is vaak moeilijk te onderscheiden totdat de dooier wordt weggesneden. Wanneer het embryo wordt ontleed uit het ei, kan worden vastgesteld of flash voor toekomstig gebruik ingevroren. Indien een in situ hybridisatie is voorzien voor de ontleed embryo, moet de vitelline membraan dat is gehecht aan het embryo via de zone van overgang verwijderen. Figuur 2 illustreert de verbeterde zichtbaarheid van het embryo na de membraan is verwijderd (C), en de juiste manier om de vitelline membraan (A, B) schillen. Na dissectie en fixatie, geheel mount in situ hybridisatie werd uitgevoerd zoals in figuur 3 (A, A &#39;, B, B&quot;) En figuur 4 (A, A &#39;, B, B&#39;) en Figuur 5 (A, B, C) ​​verschillen in orthodenticle homeobox 2 (Otx2) expressie in embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan lage doses methylkwik detecteren. Figuur 5 toont sense probe resultaten, waaruit blijkt gebrek aan achtergrond. In figuur 4, ondanks wordt ontleed uit het ei op hetzelfde tijdstip, de embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik (MeHg) gevorderd stadium 5 22 (B, B &#39;), terwijl de controlegroep embryo ontwikkeld op stand 6 22 (A, A &#39;). De groep van embryo&#39;s uitgesneden en figuur 4 werden vanuit het nest en uit de incubator op dezelfde tijden. Hoewel sommige natuurlijke variatie aanwezig is in ontwikkeling is, gebaseerd op eerdere dissectie gegevens, is het onwaarschijnlijk dat temperatuurschommelingen in de incubator zou veroorzaken slechts 2,4 dpm methylkwik embryo ontwik zijnpmentally vertraagd. De verschillen in fasen geven veranderingen in celproliferatie in embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik. Vóór versnijding, werd Edu geïnjecteerd in een dag 2 ei en overnacht incuberen. Na dissectie en fixatie van het podium 16 22 embryo, werd edu gevisualiseerd met &quot;click&quot; chemie, waardoor detectie van prolifererende cellen zoals in figuur 6 (A, B, C). Het is belangrijk tijdstippen nauwlettend bij het plaatsen van eieren in de broedmachine en tijdens dissecties, blootstelling aan methylkwik of uitvoeren van de test kan EDU ontwikkeling progressie verstoren. De eerste injectie werd uitgevoerd op dag 0, die de dag van verzameling was zoals gespecificeerd in stap 1.3. Dit embryo is ongeveer 38 uur later (fase 7 22) ontleed. De overleving werd gevonden ongeveer 90% (met dezelfde snelheid als controle embryo) zijn zolang de injectie bedroeg onder 478 nl. 22 embryo, werd een RNA-extractie volgens het protocol van de fabrikant zonder optimalisatie nodig, zoals in figuur 7. Het verwijderen van de vitelline membraan nodig was voor RNA extractie en later qRT-PCR toepassingen. Opmerking: alle embryo cijfers zijn georiënteerd dat de voorste en achterste gebieden zijn bovenaan en onderaan de afbeeldingen respectievelijk. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Procedure voor het lokaliseren en het ontleden van zebravinken embryo&#39;s, podia 1-10 22. Locate embryo door zacht glooiende de dooier tot de vage witte schijf blijkt (A). Zodra deembryo is gelegen in het centrum van de dooier, wordt de dooier ontleed op een stapsgewijze manier (B) waar de eerste snede verlicht de druk van de vitelline membraan (1) en de daaropvolgende bezuinigingen (2) grenzen aan de zone van splitsing (zj) dat is gehecht aan de vitelline membraan. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Verwijdering van vitelline membraan en zichtbaarheid van embryonale structuren. Na verwijdering van het embryo uit de dooier, plaats embryo in een petrischaal met 4% PFA. Indien een in situ hybridisatie moet worden uitgevoerd, zichtbaarheid van de embryonale structuren is essentieel en kan worden bereikt door verwijdering van de vitelline-membraan (A). Pak de vitelline membraan met extra fijne tip pincet en voorzichtig afpellen het weg van het embryo door het hanteren van het embryo direct aan de buitenste rand, indien nodig(B). Vitelline membraan verwijdering verhoogt helderheid van embryonale structuren en laat embryo&#39;s worden afgebeeld of verwerkt met in situ hybridisatie (C). Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Ganse berg in situ hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik. Expressie patronen van orthodenticle homeobox 2 (Otx2) werden gekenmerkt in embryo&#39;s worden blootgesteld aan 0,0 ppm methylkwik (A, A &#39;) en 2.4 ppm methylkwik (B, B &#39;) via ouderlijke dieet. De dorsal (A) en ventrale (A) expressie van Otx2 is zichtbaar in de middenhersenen en optische blaasjes tijdens fase 12 22. de behandelingsgroep embryo&#39;s werden ontleed op hetzelfde tijdstip, maar waren ontwikkelingsgebied vertraging gezien in de dorsale (B) en ventrale (B &#39;) visie van het hoofd structuren, die kenmerkend zijn voor het podium 11 22 afkortingen zijn:. mb, middenhersenen; op, optische blaasje. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Figuur 4. Whole mount &#160; in situ &#160; hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo ontwikkelingsgebied blootgesteld aan methylkwik. Expressie patronen van orthodenticle homeobox 2 (Otx2) kenmerkten zich in fase 6 22 embry<html> os blootgesteld aan 0,0 ppm methylkwik (A, A &#39;) en fase 5 22 embryo&#39;s worden blootgesteld aan 2,4 ppm methylkwik (B, B&#39;) via ouderlijke dieet. Afkortingen: am, voorste rand van mesoderm; nee, notochorda, notochorda mesoderm; po, proamnion, anterior blastopore; ps, primitieve streep 22. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Figuur 5. Whole mount in situ &#160; hybridisatie uitgevoerd op zebravink embryo&#39;s met behulp van sense probe. (A) Etappe 5 22 embryo. (B) Vroeg stadium 6 22 embryo. (C) Etappe 11 22 embryo. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 6. Edu integratie en de bescherming in zebravinken embryo. Edu &quot;click&quot; chemie werd gebruikt om delende cellen te detecteren in een fase 16 22 embryo (A, B, C). Edu wordt opgenomen in het DNA in plaats van thymidine 26, 27 en gedetecteerd met klikchemie 27. Proliferatie is duidelijk zichtbaar in de zijranden van de somieten en de tailbud. Paneel A toont proliferatie uitsluitend voorkomen in de achterkant van het embryo en toont ook individuele proliferatieve cellen. Paneel B toont de proliferatieve locaties in het hele embryo. Paneel C toont het voorste gebied, en toont de zeer proliferatieve telencephalon (te) meer in detail. Afkortingen: af, vruchtwater voudig; FLB, voorpoot knop; HLB, achterbeen knop; le, lens blaasje; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optic cup; pa, keelboog; sm, somiet mesoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> Figuur 7. Kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit ontleed zebravinken embryo. Controle (0.0 ppm) en 1,2 ppm methylkwik embryo&#39;s werden ontleed en flash bevroren zoals beschreven in stap 3.8. Elke baan toont RNA geëxtraheerd uit twee gehomogeniseerd embryo&#39;s van elke behandelingsgroep.

De zebravink (Taeniopygiaguttata) is een waardevol modelorganisme; de vroege stadia van de ontwikkeling van de zebravink zijn echter niet uitgebreid bestudeerd. Het protocol beschrijft hoe vroege embryo's te disseceren voor ontwikkelings- en moleculaire toepassingen.

Dissectie en Downstream Analyse van Zebravinken embryo&#39;s in een vroeg stadium van ontwikkeling

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitdissecteren van intacte zebravinkembryo's in zeer vroege embryonale stadia voor verdere ontwikkelingsbiologische en moleculaire toepassingen. Dit wordt bereikt door eerst de eierschaal in de lengte door te snijden en de inhoud van het ei voorzichtig op WHE-papier te legen. Vervolgens wordt de overgangszone (zone of junction) gelokaliseerd en wordt het omringende eigeel weggesneden, waarbij het embryo intact blijft.Vervolgens wordt het embryo overgebracht naar een Petrischaal en gewassen voordat het gefixeerd of flash-frozen wordt voor latere analyse. Ten slotte wordt het vitellijnvlies van het gefixeerde embryo verwijderd voor een betere zichtbaarheid van de embryonale structuren. Uiteindelijk tonen in C twee hybridisaties en een EDU-behandeling respectievelijk de genexpressie en prolifererende cellen in vroege embryonale stadia van de zebravink als reactie op behandeling met methylkwik.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de schade aan embryonaal weefsel minimaliseert. Dit maakt het mogelijk om de morfologie en genexpressie tijdens alle stadia van de ontwikkeling te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de vergelijkende ontwikkelingsbiologie en toxicologie, zoals de effecten van diverse toxinen op de vroegste stadia van de ontwikkeling.Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, aangezien het lokaliseren van de zno-verbinding en het verwijderen van het vilin-membraan tijdens de dissectie moeilijk kan zijn, omdat vroege embryonale structuren fragiel zijn en moeilijk waarneembaar zijn. Verzamel na het innen van zebravis-eieren en het incuberen ervan volgens het tekstprotocol de volgende materialen voor de dissectie: een schoon scalpel, een fijne pincet, twee extra fijne pincetten, drie transferpipetten, één met XPBS en één met 4%paraformaldehyde.Als u de embryo's gaat fixeren, plaatst u een stuk golfpapier van 10 bij 10 centimeter op de voet van de dissectiescoop om een schoon, niet-absorberend oppervlak voor de dissectie te bieden. Verwijder het ei op het gewenste tijdstip uit de incubator, zoals bepaald door de gids voor de zebravisch. Gebruik vervolgens een glasvezelverlichting om het ei te doorschijnen door het langs de verticale as vast te houden en licht door het ei te schijnen om het interieur te verlichten.Plaats de lichtbron achter het ei en lokaliseer de dooier en het zich ontwikkelende embryo. Positioneer vervolgens het scalpel aan de zijde tegenover de dooier en snijd met lichte druk langs het ei van de punt naar de basis. Verwijder de inhoud van het ei door met de duim en wijsvinger voorzichtig druk uit te oefenen op de basis van de puntzijde van het ei, of door met een pincet de eierschaal langs de snede voorzichtig open te wrikken.Inspecteer de dooier op de witte aansluitingszone, die zichtbaar is als een vage witte ring die het ontwikkelende embryo omringt. Gebruik een pincet met fijne punten om de dooier zodanig te oriënteren dat het embryo zich in het midden bevindt, om het embryo te scheiden van het extra-embryonale weefsel. Doorboor de randen van de dooier om de druk te verlagen en maak enkele sneden over de lengte van de diameter van de dooier langs de embryonale schijf.Zet door met het trekken van diagonale lijnen totdat het deel van de dooier met het embryo succesvol is gescheiden. Verwijder met een transferpipet de randen van de dooier, waarbij een kleine hoeveelheid wordt achtergelaten om het embryo op het weefselpapier te smeren om scheuren te voorkomen. Was de embryonale schijf door de punt van een transferpipet met 1x PBS onder een hoek van 45 graden tegen de onderkant van het embryo te plaatsen en een kleine hoeveelheid 1x PBS uit te dispenseren.Verplaats het embryo naar een kleine plastic Petrischaal. Was het embryo door extra PBS aan de schaal toe te voegen en PBS vlakbij het embryo te druppelen. Draai de schaal voorzichtig rond om te wassen en resterende dooier te verwijderen.Kantel vervolgens het schaaltje om de afvalbuffer af te zuigen. Als het embryo direct gefixeerd moet worden voor in situ hybridisatie, voeg dan 4% PFA toe om het embryo onder te dompelen; druppel de PFA vervolgens direct op het embryo om het plat te maken en te voorkomen dat het opkrult. Incubeer gedurende 12 uur bij vier graden Celsius na het dehydrateren van het embryo in een methanolserie.Als het embryo zich in stadium één tot en met acht bevindt, verwijder dan het vitellijnmembraan dat aan het embryo vastzit door met extra fijne pincetten de randen van het membraan vast te pakken die buiten de junctiezone uitsteken. Keer het embryo voorzichtig meerdere malen om om resterende dooierkorrels weg te wassen en de embryonale schijf los te maken van het vitellijnmembraan. Als er geen opening ontstaat tussen de junctiezone en het vitellijnmembraan, gebruik dan pincetten met een extra fijne punt om de junctiezone voorzichtig open te krabben om deze los te maken van het membraan.Pak vervolgens het vliezmembraan en de rand van de embryonale schijf vast bij de overgangszone en trek het vliezmembraan voorzichtig van het embryo weg. Indien het embryo na dissectie direct moet worden ingevroren, voeg dan snel twee tot drie milliliter 1X PBS toe aan de Petrischaal en kantel de Petrischaal om het embryo van de OK-granula te scheiden. Nadat de vloeistof is verwijderd en de wasbehandeling twee tot drie keer is herhaald, gebruikt u een pincet met fijne punten om het embryo over te brengen naar een vooraf gelabelde microcentrifugebuis en vriest u dit direct in vloeibare stikstof in voordat het wordt bewaard bij minus 80 graden Celsius.Om de EDU-celproliferatie-assay uit te voeren met behulp van de glasvezelverlichtingslamp, kaars en ei. Om het embryo of de dooier te lokaliseren, markeert u de zijde van het ei tegenover het embryo of de dooier om ervoor te zorgen dat het embryo niet beschadigd raakt tijdens de micro-injectie. Bekleed vervolgens een plastic schaal van 60 millimeter met boetseerklei door deze in de vorm van een kom te boetseren om het ei in de gewenste oriëntatie vast te houden.Pas de richting van de gemarkeerde plek aan om de insertie van de micro-injectienaald mogelijk te maken. Nadat twee glazen capillaire naalden stomp zijn getrokken, één om een gaatje in het ei te prikken en met minerale olie zijn teruggevuld, wordt de tweede naald geladen en in de micro-injector geplaatst. Stel het volume oplossing per injectie in op 59,8 nanoliters op de micro-injector, en vul vervolgens de micro-injectienaald met een 10 millimolar stock EDU-oplossing; doorstuur met de stompe glazen capillair voorzichtig een gaatje in het schaal op de gemarkeerde plek, waarbij u er op let dat het schaal niet versplintert of dat er stukjes ervan in de eigholte vallen.Positioneer het ei zodanig dat het gat zich in een hoek van 45 graden bevindt, uitgelijnd met de micro-injectienaald die moet worden ingebracht. Gebruik vervolgens de micromanipulator om de gevulde naald ongeveer één centimeter in de holte in te brengen en injecteer de gewenste hoeveelheid EDU-oplossing in de dooier of het embryo. Gebruik onmiddellijk meerdere lagen plastic om het ei en de kleihouder in te wikkelen en plak de randen van de wikkel met tape aan de bodem van de schaal om uitdroging tijdens de incubatie te voorkomen.Incubeer het ei op een stabiel oppervlak bij 37 °C totdat het gewenste stadium is bereikt, voordat de plastic folie wordt verwijderd en het embryo wordt gedisseceerd volgens het tekstprotocol; deze figuur toont een NC 2-hybridisatie op gedisseceerde en gefixeerde embryo's die zijn blootgesteld aan lage doses methylkwik om de expressie van ortho identical homeo box te detecteren. Zoals te zien is in het dorsale en ventrale aanzicht van de hoofdstructuren, vertoonden de behandelde embryo's een mentale ontwikkelingsvertraging in stadium 11 vergeleken met de onbehandelde embryo's. In stadium 12 werden de groep van vier embryo's die links worden getoond gedurende dezelfde tijd geïncubeerd.De twee onbehandelde embryo's linksboven zijn echter doorgegroeid naar stadium zes, terwijl de twee met kwik behandelde embryo's linksonder slechts stadium vijf hebben bereikt. Deze embryo's werden behandeld met een sense-probe om het ontbreken van achtergrondkleuring aan te tonen; hier worden prolifererende cellen getoond in een embryo van dag twee dat is geïnjecteerd met EDU en vervolgens een nacht is geïncubeerd. Click-chemie toont proliferatie in de laterale randen van de somieten en de staartknop, evenals in het cephalon.Deze gel bevat RNA-monsters geëxtraheerd uit gedissecteerde zebravisvink-embryo's in stadium 16 die onbehandeld bleven of behandeld zijn met 1,2 parts per million methylkwik, wat aangeeft dat de in deze video gedemonstreerde dissectiemethode, zodra deze onder de knie is, de extractie van hoogwaardig RNA mogelijk maakt. De dissectie kan in minder dan een minuut worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om het eigeel onder een hoek te bekijken om het embryo te lokaliseren, aangezien vroege embryo's moeilijk waarneembaar kunnen zijn na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals in situ hybridisatie, assays voor celproliferatie en RNA-extractie voor kwalitatieve analyses, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen in ontwikkelingskundige en toxicologische studies te beantwoorden.

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Hier presenteren we het protocol voor 3D-weefselkweek van de achterste lichaamsas van zebravissen, waardoor live studie van gewervelde segmentatie mogelijk is. Dit explantmodel biedt controle over de verlenging van de as, wijziging van morfogene bronnen en live beeldvorming op weefselniveau op subcellulair resolutieniveau.

Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer een dissectiemethode voor zebravinkembryo's (Taeniopygia guttata) in vroege ontwikkelingsstadia voor morfologische en moleculaire analyses. Deze techniek minimaliseert weefselschade en ondersteunt toxicologisch onderzoek.

Dissectie en Downstream Analyse van Zebravinken embryo's in een vroeg stadium van ontwikkeling

Meer video's verkennen