Name: Gebruik van Shigella flexneri Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Leer autophagie-cytoskelet interacties bestuderen tijdens Shigella flexneri infectie met behulp van HeLa-cellen en zebrafish larven. Deze methode onthult hoe septine kooien bacteriële verspreiding beperken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in de SM laboratorium wordt ondersteund door een Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
<li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li>
<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Bij het ​​bewaken van autofagie en het cytoskelet in vitro met behulp van weefselkweek cellen, kunnen de in de punten 1 en 2 beschreven protocollen worden toegepast op een breed scala van weefselkweek celtypes. Bovendien zou autofagie volgen (bijvoorbeeld ATG8 / LC3 + ve autofagosomen) en cytoskelet (bv. Actine staarten, Septin kooien) dynamica in real-time tijdens Shigella infectie met levende imaging, kan weefselkweek cellen tijdelijk worden getransfecteerd met GFP, RFP- of GVB-gemerkte constructen zoals eerder beschreven 7,8. (. Dwz algemeen wenselijk voor real-time analyse aangezien Shigella kan binnendringen 5-30% van HeLa-cellen bij 100 1 MOI) Om het percentage cellen geïnfecteerd door Shigella verhogen, direct voeg 400 ul van Shigella (OD 600 = 0,3 -0.6) om cellen in 2 ml MEM (serum uitgehongerd) en wacht ten minste 1,5 uur na infectie voldoende bacteriële binnenkomst, ontsnappen aan de phagosome, replicatie, autophagy erkenning en Septin kooien. Als alternatief kan men de Shigella M90T Afai stam die drukt de adhesine AfaE en hebben veel hogere invasie vaardigheden in epitheliale cellen in vergelijking met de M90T stam 28 gebruiken. Van de nota, de M90T Afai stam is nog niet in vivo getest met behulp van de zebravis. Platen van Shigella kolonies bij 4 ° C bewaard gedurende 2-3 dagen en voor verschillende experimenten. Na verloop van tijd, kolonies van Shigella dat de virulentie plasmide kan absorberen Congo Red en lijken hebben verloren hun virulentie plasmide behouden. Om deze reden adviseren wij om verse bacteriële voorraden te gebruiken als dat mogelijk is. Bij het ​​bewaken van de celbiologie van de infectie in vivo, protocollen beschreven in de hoofdstukken 3 en 4 maken gebruik van wildtype AB lijn zebravis. Om Shigella -leukocyte interacties monitoren, kunnen transgene zebravis lijnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, MPX: GFP of Lyz: DsRed om visueleize neutrofielen 19,29,30 of mpeg1: mCherry om macrofagen 19,31 visualiseren. Om autofagie te visualiseren in vivo, kan het GFP-Lc3 zebravis transgene lijn 19,24 worden gebruikt zoals beschreven in paragraaf 3.8. Om autofagie verstoren in vivo, de effectieve morfolino oligonucleotide dosis moet proefondervindelijk worden bepaald op basis van de efficiëntie transcript splicing of eiwittranslatie remmen. Het is raadzaam om een titratie experiment uitgevoerd en de uitputting van RT-PCR (voor splice morfolino oligonucleotide) bevestigen of door SDS-PAGE (voor translationeel morfolino oligonucleotide) 32. RNA isolatie van zebravis embryo&#39;s en larven kan worden uitgevoerd met guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Om eiwitten extraheren uit zebravis larven (8 tot 15 larven / buis), mechanisch homogeniseren met stamper in 200 ul lysis buffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octylfenol ethyleenoxide condensate en protease inhibitor). Centrifugeer buizen bij 19.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis. Voeg Laemmli buffer en verwarm het monster bij 95 ° C gedurende 15 minuten. Lysaten kunnen bij -80 ° C bewaard totdat het nodig is, en kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in paragraaf 2.3. De zebravis is een uitstekend model voor in vivo drug toepassing. Analyse middels morfolino oligonucleotiden kunnen worden aangevuld met gevestigde drugs autofagie (bijvoorbeeld rapamycine en bafilomycine) manipuleren. Uninfected en / of geïnfecteerde larven worden behandeld met rapamycine (1,5 uM) of bafilomycine (80 nM) verdund in E2 en autofagocytische flux kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in 25,33. Het gevolg van autofagie manipulatie van de uitkomst van de infectie en de overleving van de larven besmet kunnen worden geëvalueerd zoals beschreven in paragraaf 3.5. Naast het bestuderen gastheerceldeterminanten, in vitro en in vivo protocollen kunnen worden toegepast om bacteriële determinanten vereist autofagie herkenning te bepalen, waarbij bacteriële mutante stammen die differentieel worden herkend door autofagie, bijvoorbeeld., Shigella ΔicsA (de Shigella eiwitten ICSA rekruteert N-WASP en vervolgens Arp2 / 3 voor actine staart en Septin kooi vorming, in de afwezigheid ervan kan er geen actine staarten, geen Septin kooien) en ShigellaΔicsB (Shigella vermijdt de autophagic reactie via de bacteriële effector eiwit ICSB, die de werving van autofagie machines ICSA voorkomt, in zijn afwezigheid er kunnen meer Septin kooien, meer autofagie) 7,8. Shigella is geen natuurlijk pathogeen van de zebravis en groeit optimaal bij 37 ° C. Echter, heeft het werk aangetoond dat virulentie factoren die nodig zijn voor Shigella invasie, ontsnappen aan de fagocytaire vacuole en replicatie in de cytosol kan worden uitgedrukt en zijn functioneel in zebravis larven bij 28 ° C 19. 28 ° C is het meest gebruikte temperatuur zebravis toegepast en standaardtemperatuur normale zebravis ontwikkeling 23 waarborgen. Opvallend zijn de belangrijkste pathogene gebeurtenissen die tot shigellosis mens (dwz macrofaag celdood, invasie en vermenigvuldiging in epitheelcellen, cel-cel verspreiding, inflammatoire destructie van de ontvangende epitheel) getrouw weergegeven in de zebravis model van Shigella infectie 19. Autofagie en cytoskelet genen zijn alomtegenwoordig uitgedrukt en hebben een breed scala van biologische functies. Mouse studies hebben aangetoond dat knockout essentiële autofagie 26 of Septin genen 5 zijn embryonaal lethaal, en het is waarschijnlijk dat sommige van deze genen essentieel voor de ontwikkeling van de zebravis (wordt hoewel dit probleem kan worden verminderd door het feit dat meerdere zebravisparaloge genen 33). Dan zijn er verschillende alternatieven voor dit probleem, bevattende (i) het gebruik van farmacologische reagentia autofagie en het cytoskelet reguleren, (ii) morfolino kan worden getitreerd beneden verholpen, (iii) knockout van genen worden ontworpen voor specifieke cel types, en / of (iv) genen betrokken bij autofagocytische inzicht dat niet essentieel voor de ontwikkeling dier (bv., P62) worden gericht. Terwijl de zebravis is een ideaal modelsysteem om autofagie en het cytoskelet tijdens Shigella infectie te onderzoeken, zijn moleculaire technieken momenteel ontbreekt. Het veld moet om nieuwe instrumenten en rijden cel specifieke expressie van de eiwitten van belang te genereren. Neerhalen uitdrukking van autofagie / cytoskelet genen, zijn nieuwe morpholino sequenties nodig, en nieuwe methoden voor het genoom techniek (bijvoorbeeld, TALEN, CRISPR / Cas9) kan ook worden gebruikt. In de tussentijd verschillende tools die eerder gegenereerd voor mens of muis studieskan eveneens werken voor de zebravis. De intracellulaire bacteriën S. flexneri heeft ontpopt als een uitzonderlijke modelorganisme om belangrijke kwesties in de biologie, waaronder het vermogen van bacteriën om erkend te worden door het immuunsysteem 1,2 pakken. De gastheercel maakt gebruik septins om de beweeglijkheid van S. beperken flexneri en richten ze naar autofagie, een essentieel onderdeel van een cel autonoom immuniteit 7,8. Deze waarnemingen suggereren een nieuwe moleculaire kader om autofagie en zijn vermogen om cytosole bacteriën afgebroken studie. Een belangrijke kwestie is nu volledig ontcijferen van de onderliggende moleculaire en cellulaire gebeurtenissen, en deze gebeurtenissen in vitro tijdens bacteriële infectie in vivo geanalyseerd met behulp van relevante diermodellen valideren. Daartoe is de zebravis vastgesteld als een waardevolle nieuwe gastheer voor de analyse van S. flexneri infectie 19. Interacties tussen bacteriën en gastheercellen kan worden afgebeeld op hoge resolutie, ende zebravismodel moet nuttig zijn voor het begrijpen van de celbiologie van Shigella infectie in vivo aantonen. Zebravis larven kan worden gebruikt om de rol van bacteriële autofagie afweer onderzoeken en werk heeft aangetoond dat de verstoring van autofagie nadelig kunnen beïnvloeden mogelijk overleving in respons op Shigella infectie 19. De opmerkingen gegenereerd uit onderzoek van Shigella, Septin kooien en autofagie in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven kunnen fundamentele vorderingen in het begrijpen afweer verschaffen. Ze konden ook voorstellen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën ter bestrijding van infectieziekten. Een kritische doel van dit rapport is het gevoel van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen in vitro geanalyseerd te maken (dat wil zeggen, autofagie, actine staarten, Septin kooien) tijdens bacteriële infectie in vivo in het kader van een entire organisme, met behulp van de zebravis larven. Als niet bekend is met de zebravis biologie en behandeling, kan men verwijzen naar in de diepte protocollen voor een goede zebravis veeteelt 23 en in vivo analyse van zebravis infectie 19,35.

Shigella flexneri, een Gram-negatieve invasieve enteropathogene bacterie, kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol, en polymeriseren de gastheer actinecytoskelet om cytosole immuunreacties te omzeilen en het bevorderen van intra-en intercellulaire beweging 1,2. Ondanks de kennis van actine gebaseerde motiliteit in vitro 3,4, de mechanismen beperken bacteriële verspreiding in vivo niet volledig gedefinieerd. Dit is van cruciaal belang voor een beter begrip van de aangeboren immuniteit en afweer. Septins, een sterk geconserveerde familie van eiwitten onder metazoa, zijn guanosine trifosfaat (GTP) -bindende eiwitten die assembleren in hetero-oligomere complexen en vormen niet-polaire filamenten die associëren met cellulaire membranen en het cytoskelet 5,6. Recent werk heeft ontdekt dat geïnfecteerde gastheercellen kunnen voorkomen Shigella actine gebaseerd beweeglijkheid door compartimentering bacteriën gericht op autophagy binnen &#39;Septin kooien&#39;, het openbaren van de eerste cellulaire mechanisme dat actine gebaseerd beweeglijkheid 7,8 tegengaat. Een groot open veld van onderzoek ligt nu in &#39;Septin biologie en infectie&#39;. Septin assemblage, veroorzaakt door een verscheidenheid aan pathogenen (bijvoorbeeld Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kan naar voren als een belangrijk punt in de afweer 5,12. Autophagy een sterk geconserveerd intracellulair afbraakproces wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit vanwege zijn vermogen om cytosolische bacteriën leveren in het lysosoom 13,14. Echter, de rol van bacteriële autofagie in vivo te beperken of te bevorderen bacteriële replicatie blijft slecht begrepen 15,16. De zebravis (Danio rerio) ontstaan ​​als een vertebraat model voor de studie van infecties omdat het optisch bereikbaarbij de larvale stadia, wanneer het aangeboren immuunsysteem is reeds functioneel 17,18. Recent werk heeft de gevoeligheid van de zebravis larven S. gekenmerkt flexneri, een paradigma voor bacteriële autofagie 15, en heeft gebruik gemaakt van de Shigella -zebrafish infectie model om de manipulatie van autofagie voor antibacteriële therapie te bestuderen in vivo 19. Dit rapport biedt nieuwe hulpmiddelen en assays om S. studeren flexneri interacties met autofagie en het cytoskelet. In een eerste stap, protocollen monitoren autofagie cytoskelet interacties worden beschreven middels Shigella infectie van de menselijke epitheliale cellijn HeLa. Om de rol van autofagie-cytoskelet interacties op het Shigella infectieproces in vitro beoordelen methoden autofagie cytoskelet componenten (met siRNA of farmacologische reagentia) te manipuleren worden voorzien. Nieuw onderzoek heeft aangetoond dat door het gebruik van Shigella infectie of zebravis larven kunnen soortgelijke assays worden toegepast op de celbiologie van infectie in vivo te bestuderen. Protocollen voor te bereiden en te infecteren zebravis larven behandeld, en de gastheer respons op Shigella infectie in vivo te evalueren, protocollen bepalen samen overleving en bacteriële last van geïnfecteerde larven worden voorzien. Methoden om de werving van Septin en autofagie markers om Shigella controleren (met behulp van een vaste of levende zebravis larven) en methoden om de rol van deze processen te testen in vivo [behulp morfolino- oligonucleotiden (geïnjecteerd in 1-4 cel stadium embryo&#39;s) of farmacologische reagentia ( direct toegevoegd aan de zebravis badwater)] worden ook besproken. Dit programma van het werk zal naar verwachting inzicht in de voor de controle van de infectie door cytosole gastheer reacties mechanismen.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas microcapillairen&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>Grote handmatige manipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfenuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-muis IgG (H+L) antilichaam</td><td>Molecular Probes</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-konijn IgG (H+L) antilichaam</td><td>Molecular Probes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI transfectie reagens</td><td>Polyplus transfectie</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar met lage smelttemperatuur</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek glasbodem schaal</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM plus L-alanyl-L-glutamine&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren oplossing</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet puller apparaat&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,</td><td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal anti-tubuline, geacetyleerd antilichaam&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylthioureum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Faloïdine&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fenolrode oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62/SQSTM1 antilichaam</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie reagens</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set montagemedium met DAPI&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van<em&gt; shigella flexneri</em&gt; naar autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is een intracellulaire pathogeen die kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol te bereiken, en polymeriseren de gastheer actine cytoskelet om haar beweeglijkheid en de verspreiding te bevorderen. New werk heeft aangetoond dat eiwitten betrokken bij actine gebaseerde motiliteit eveneens verbonden met autofagie, een intracellulaire afbraakproces cruciaal voor mobiele autonome immuniteit. Opvallend, kunnen gastheercellen actine gebaseerde beweeglijkheid van S. te voorkomen flexneri door compartimentering van bacteriën in &#39;Septin kooien&#39; en richten ze naar autofagie. Deze waarnemingen geven aan dat een meer volledig begrip van septins, een familie van draadvormige-GTP-bindende eiwitten, zal nieuwe inzichten verschaffen in het proces van autofagie. Dit rapport beschrijft de protocollen bij autofagie-cytoskelet interacties veroorzaakt door S. bewaken flexneri in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven. Deze protocollen mogelijk onderzoek intracellulaire mechanisms dat bacteriële verspreiding op moleculair, cellulair en hele organisme te regelen.

Na infectie van weefselkweekcellen in vitro, S. flexneri kan ontsnappen uit de phagosome en binnen te vallen het cytosol. In het cytosol, kunnen gastheercellen de actine gebaseerde beweeglijkheid van Shigella te voorkomen door compartimentering van bacteriën in Septin kooien (figuur 1A). Bacteriën ingesloten door Septin kooien kan ook worden gelabeld door autofagie markers p62 (Figuur 1B) en LC3 (figuur 1C). Deze waarnemingen markeert een nieuw mechanisme van afweer die verspreiding van invasieve pathogenen beperkt, en ook onthullen nieuwe verbindingen tussen autofagie en het cytoskelet. Opvallend is dat de uitputting van autofagie markers aanzienlijk vermindert Septin kooien van bacteriën (Figuur 2A), en het werk heeft ook aangetoond dat de uitputting van Septin kooien vermindert werving van autofagie 8 markers. Aldus, althans bij Shigella, Septin kooiconstructie en autophagosome vormingenn kunnen worden gezien als onderling afhankelijke processen. Andere cellulaire eisen voor compartimentering van Shigella door Septin kooien bevatten actine polymerisatie en actomyosine activiteit (figuur 2B). Er is geen natuurlijke muismodel van shigellose, en het onderzoek van Shigella pathogenese, Septin biologie en bacteriële autofagie in vivo kunnen profiteren van een nieuw diermodel van infectie, de zebravis larven 19. Het is mogelijk zebravis larven besmetten injecteren bacteriën in verschillende anatomische plaatsen zoals caudale intraveneuze injecties overlevingsexperimenten en staart spier injecties in vivo microscopie (figuur 3A). Afhankelijk van de dosis, S. flexneri geïnjecteerd in de zebravis larven kan ofwel binnen de 48 uur na de infectie worden gewist, of kan leiden tot een progressieve en uiteindelijk fatale infecties (Figuren 3B - 3D). Shigella virulentie factors expressie bij 28 ° C, de optimale groeitemperatuur van zebravis en zebravis infectie door Shigella strikt afhankelijk van het type III secretiesysteem (T3SS) 19, in menselijke ziekte een belangrijke determinant voor virulentie. Genomen samen, deze waarnemingen wijzen erop dat de zebravis larven een waardevolle nieuwe host voor in vivo analyse van Shigella infectie. De optische toegankelijkheid van de zebravis larven maakt visualisatie van Septin kooien in vivo (figuur 4A), een prestatie die nog nooit eerder is uitgevoerd met behulp van zoogdiergastheer- modellen. Om bewijs te vullen dat Septin kooien vangen bacteriën gericht op autofagie in vivo, kan men transgene zebravis larven te infecteren die GFP-Lc3 en observeren autofagie marker rekrutering van Shigella (Figuur 4B). Voor ultrastrucutral analyse van Shigella autofagosomen in vivo, elEctron microscopie kan worden gebruikt om duidelijk de cytosolische vastlegging bacteriën door dubbel membraan vacuolen 19. Autofagie wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit en een cruciale afweermechanisme tegen intracytosolic bacteriën 14-16. Om autofagie functie karakteriseren in vivo, kan p62-morpholino behandeld zebravis larven worden gebruikt. In tegenstelling tot de kern autophagy machines [bv. De 36 autophagy verwante eiwitten (ATG) 26], p62 is niet essentieel voor de ontwikkeling van vertebraten 27 en dus zebravis larven gewoonlijk vóór infectie. Opvallend-p62 uitgeput larven geënt met S. flexneri resulteren in significant verhoogde mortaliteit en een verhoogde bacteriële last 19. In overleg met de in vitro werk waaruit blijkt dat Septin kooiassemblage is onderling afhankelijk met autophagosome formatie 7,8, wordt Septin rekrutering voor Shigella duidelijk in-p62 uitgeputte larven verminderd ( <strong&gt; Figuur 4C). Deze gegevens tonen aan dat zebravis overleving afhankelijk-p62 gemedieerde autofagie intracellulaire bacteriële besmetting te bestrijden. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 De Septin kooi in vitro. (A) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT9 en falloïdine en afgebeeld door confocale microkopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (B) HeLa-cellen geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen p62 en SEPT2 en afgebeeld door fluorescerend licht microscopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (C) HeLa-cellen getransfecteerd met GFP-ATG8 / LC3, geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT2 en afgebeeld door fluorescerende microscopy. Schaal bar, 1 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 7. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Cellular eisen Shigella -septin kooi formatie. (A) HeLa-cellen werden behandeld met controle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 of ATG7 siRNA. Hele cellysaten van siRNA behandelde cellen werden immunoblotting voor GAPDH, p62, ATG5, ATG6 of ATG7 de doeltreffendheid van siRNA depletie (boven) vertonen. -siRNA behandelde cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri gedurende 4 uur 40 min, vast, en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken (onderaan) stellen het gemiddelde ± SEM% van Shigella binnen SEPT2 kooien van n ≥3 experimenten per behandeling. (B) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri, behandeld met DMSO, cytochalasine D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), of blebbistatin (Bleb) en na 4 uur 40 min werden vastgesteld en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken geven het gemiddelde% ± SEM van Shigella binnenkant SEPT2 kooien van twee onafhankelijke experimenten per behandeling. Deze cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van Mostowy et al 7. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 De zebravis model van Shigella infectie. (A) De beelden illustreren oriëntatie van de zebravis larven onder de stereomicroscoop. (Linker paneel) zebravis larven 72 uur na de bevruchting werden lateraal gepositioneerd in de injectie plaat met hun dorsale zijde naar de injectienaald. (Midden-panel) bloedbaan infectie werd uitgevoerd door injecterende de bacteriën (rode oplossing) in de staartader, posterieur van de urogenitale opening. (Rechter paneel) Infectie in de staart spier werd uitgevoerd door injectie van bacteriën (rode oplossing) over een somite. (B) overlevingscurven van 72 uur na de bevruchting larven geïnjecteerd met verscheidene doses S. flexneri en geïncubeerd bij 28 ° C gedurende 48 uur na infectie. De effectieve entstof werd geclassificeerd als laag (&lt;10 3 CFU, open cirkels), medium (~ 4 x 10 3 CFU, open driehoeken) of hoog (~ 10 4 CFU, open vierkantjes). Bedoel% ± SEM (horizontale balken) uit n ≥3 experimenten per inoculum klasse. (C) Bepaling van het aantal levende bacteriën in homogenaten van individuele larven op verschillende tijdstippen na infectie gemeten door platen op LB Let op, alleen larven na de infectie worden opgenomen in opsomming analyse overleefd. Gemiddelde ± SEM (horizontale balken) ook weergegeven. (D) Verdeling van GFP Shigella bepaald doorlive-beeldvorming met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop op verschillende tijdstippen na infectie met een lage, gemiddelde of hoge dosis entstof (caudale intraveneuze injecties). Overlay beeldoverdracht (grijs) en GFP-fluorescentie (groen) (B), van -. (D) hebben deze cijfers aangepast is Mostowy et al 19. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 De celbiologie van Shigella infectie in vivo. (A) zebravis larven werden geïnfecteerd in de staart spier GFP Shigella (lage dosis) gedurende 24 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 (rood) en GFP (green ) en afgebeeld door confocale microscopie. Schaal bar, 5 micrometer. (B) GFP-Lc3 zebravis larven besmet waren met mCherry- Shigella (medium dosis) voor4 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen mCherry (rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. . Schaal bar, 1,5 micrometer (C) zebravis larven behandeld met ofwel controle (CTRL; linker afbeelding) of P62 (rechter afbeelding) morpholinos waren geïnfecteerd met GFP Shigella gedurende 4 uur (medium dosis), vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 ( rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. Pijlen markeren enkele voorbeelden van Shigella ingesloten in Septin kooien (CTRL) of niet (p62 verarmd) een 4 uur na infectie. Schaal bar, 5 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 19.

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Het algemene doel van deze procedure is om de intracellulaire mechanismen te onderzoeken die de bacteriële verspreiding tijdens infectie in vitro en in vivo beheersen, door gebruik te maken van weefselkweekcellen en zebravislarven. De in vitro methode begint met de preparatie van Chlamydia trachomatis, een gramnegatieve en entero-invasieve bacteriële pathogeen. Vervolgens worden cellen geïnfecteerd en worden siRNA of farmacologische reagentia gebruikt om het autofagie-mechanisme en het cytoskelet van de gastheer tijdens de infectie te manipuleren. Om de interacties tussen autofagie en het cytoskelet veroorzaakt door C. trachomatis in vivo te bestuderen, worden zebravissenbryo's drie dagen na de bevruchting geïnfecteerd voor beide methoden.De laatste stap is het labelen van weefsels met autofagie- en cytoskeletmarkers. Uiteindelijk zullen de resultaten inzicht verschaffen in de mechanismen die nodig zijn voor de beheersing van de infectie door cytosolische responsen van de gastheer. Het voordeel van het gebruik van gel om bacteriële autofagie te bestuderen ten opzichte van andere bacteriën zoals listeria, is dat gel-gerichte autofagie ook gevangen kan worden in beginnende kooien.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van autofagie, zoals wat de rol van het cytoskelet is bij autofagie en wat de rol van autofagie is bij de beperking of bevordering van intracellulaire bacteriën? De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar andere autofagieprocessen, zoals de autofagie van virussen of mitochondriën, en kunnen ook therapeutische implicaties hebben voor menselijke ziekten met een septine- of autofagiecomponent. Dit zijn demonstraties met zebravisjes.Infectie is een cruciaal proces, aangezien de stappen voor het injecteren van zebravissen met bacteriën moeilijk aan te leren zijn omdat de naaldvoorbereiding en een correcte injectie tijd en een hoge nauwkeurigheid vereisen. Microscopie van de infectie bij zebravissen vereist ervaring. Gebruik voor dit protocol de wildtype-stam van Shigella flexneri 2a uit een bevroren glycerolstock; strijk de bacteriën uit op Congo Red tryptisch soja-agarplaten en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C.Zaai daarna de volgende dag HeLa-cellen uit in zes-wellplaten in MEM-medium met 10% foetaal kalfsserum. Selecteer de volgende dag een individuele kolonie en kweek deze gedurende de nacht in TCS-medium met schudden bij 37 °C. Richt subculturen op door een verdunning van 1:80 te maken in vers TCS.Wanneer de optische dichtheid van de subculturen bij 600 nanometer tussen 0,3 en 0,6 ligt, worden de bacteriën verzameld door ze vijf minuten te centrifugeren bij 1000 G. Resuspendeer vervolgens het bacteriële pellet in MEM tot dezelfde optische dichtheid.Hallo, cellen moeten direct worden geïnfecteerd met een multiplicity of infection van 100 op één. Voeg de in MEM verdunde chag toe aan de geplaatste hella-cellen en breng het totale MEM-volume naar 2 mL per putje. Centrifugeer vervolgens de platen bij 700 G gedurende 10 minuten om de bacteriële adhesie aan de gastheercellen te maximaliseren en incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, zodat de bacteriën de cellen na de infectieperiode kunnen infecteren.Was de cellen voorzichtig twee keer. Gebruik vers MEM om extracellulaire bacteriën verder te elimineren en incubeer de cellen gedurende één tot vier uur in compleet medium met gentamicine, afhankelijk van empirische waarnemingen. Fixeer vervolgens de geïnfecteerde cellen en label deze.Beeld ze af met epi-fluorescentie- of confocale microscopie met een 63 x of 100 x objectief om de DAPI-gelabelde cha-septine-kooien op te lossen; deze kunnen worden gevisualiseerd als ringachtige structuren van ongeveer 0,6 microns in diameter die cytosolische bacteriën omringen die actine polymeriseren. De bacteriën in de septine-kooien kunnen ook worden herkend aan autofagiemarkers zoals P 62 en lc drie a TG eight. Conceptueel is het moeilijkste aspect van deze procedure de identificatie van bacteriële autofagosomen en sing-kooien in vivo en in vitro, wat zorgvuldige microscopie en analyse vereist.Bovendien moet men ervoor zorgen dat het juiste aantal gebeurtenissen over meerdere biologische replica's wordt geanalyseerd en dat de statistische significantie is gewaarborgd na het infecteren van de HeLa-cellen met chila. Laat de bacteriën eerst ten minste twee en een half uur de tijd om hun weg naar het cytosol te vinden. Vervolgens kan de medicamenteuze behandeling worden uitgevoerd om het cytoskelet te behandelen.Voeg één tot vijf µL van de verdunde drugstock toe aan elke 2 mL medium met cellen als negatieve controle. Behandel één set cellen met DMSO in MEM en incubeer de cellen vervolgens 30 minuten om de autofagische flux van de cellen te manipuleren. Gebruik 20 nM rapamycine of 160 nM bafylomycine.Incubeer de cellen vervolgens gedurende vier tot 12 uur na de behandeling. Fixeer en label de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze techniek modelleert de interacties tussen gel-infectie en het autofagie-cytoskelet in vivo. Om te beginnen met de subcultuur en het verzamelen van de gel zoals eerder beschreven, was de bacteriën met één XPBS en centrifugeer ze bij 1000 G gedurende 10 minuten.Resuspendeer de bacteriën vervolgens in 80 µL 0,1% Fenolrood in PBS. Bewaar dit preparaat op ijs. Het moet ongeveer 2000 bacteriën per nanoliter bevatten. Verzamel 72 uur voor de geplande injectie embryo's van spawnende zebravis om eventuele extracellulaire contaminanten te verwijderen.Was de embryo's in E twee medium met 0,003% bleek gedurende 10 minuten. Vervang na 10 minuten het E twee medium en was de embryo's vijf keer in E twee. Vul vervolgens schaaltjes van 10 centimeter met 50 milliliters E twee en maximaal 50 embryo's.Kweek in totaal ongeveer 100 embryo's op bij 28 °C, 24 uur na bevruchting. Behandel de ontwikkelende embryo's met 0,003% fenoterEOL in E2 om melaninevorming te voorkomen, wat de microscopie belemmert. Begin met het anesthetiseren van de 72-uurs larven met behulp van een bad van 200 µg/mL tricaine in E2-medium.Breek vervolgens met een micromanipulator en een fijne pincet de punt van de micro-injectienaald af en controleer de breuk onder een microscoop. Laad nu de naald als volgt: breng eerst een druppel van de bacteriële cultuur over naar een dekglas op de microscooptafel. Zet daarna de micro-injector en de gascilinder aan.Ten derde, laat de naaldpunt in de druppel zakken. Ten vierde, vul de naald om de overleving van zebravis tijdens cha-infectie te beoordelen. Gebruik een zorgvuldige intraveneuze injectie met behulp van een fijn penseel.Plaats de geanestheseerde larven zijlings op de injectieplaat met hun dorsale zijde naar de naald toe. Positioneer de naaldpunt nu dicht bij de urogenitale opening, gericht op de coddle-ader. Doorboor vervolgens de huid en injecteer een bolus van 1 in 5 nanoliter bacteriën.Een succesvolle injectie in de staartader wordt aangegeven door de visualisatie van fenolrood dat zich langs de ader verspreidt. Technisch gezien is de injectie in de staartader het moeilijkste aspect van deze procedure, waarvoor oefening met zebravislarven vereist is. Confocale microscopie kan ook uitdagend zijn omdat de larven een juiste positionering vereisen.Breng na de injecties elke geïnfecteerde larve individueel over naar een putje van een 24-wells plaat die één milliliter E2-medium bevat. Incubeer de plaat bij 28 °C en monitor de embryo's dagelijks om de rekrutering van septine en autofagiemarkers te visualiseren.Injecteer Ella op gelokaliseerde plaatsen, zoals de staartspier. Bereid de injectie van de larven voor zoals beschreven in de vorige sectie. Positioneer de zebravis zijlings en plaats de naald boven de spier.Doorboor vervolgens de ruimte tussen twee somieten en injecteer ongeveer one nanoliter Ella. Bij een succesvolle injectie in de staartspieren zal de geïnjecteerde somiet rood kleuren. Vanwege de fenolroodbuffer is er laagsmeltende 0,1% agarose in E2-medium bereid bij 37 °C.Voeg afzonderlijk druppels agarro toe aan een schaaltje met glazen bodem. Breng de geïnjecteerde larven met een minimaal volume oplossing over naar de druppels agarro. Orienteer ze daar naar wens en laat de agarro stollen.Bedek vervolgens de hele schaal met LMA, gevolgd door E twee met trica. Neem vervolgens elke twee minuten Zacks gedurende enkele uren. In geïnfecteerde weefselkulturcellen ontsnapt shaila uit het fagosoom naar het cytosol, waar het cytoskelet van de gastheer kan reorganiseren en bacteriën kan compartimenteren in septine-kooiachtige structuren.Bacteriën die gevangen zitten in septine-kooien worden herkend door autofagie-markers zoals P 62 en lc three. De zebravis vormt een waardevolle nieuwe gastheer voor de in vivo studie van CHA-infectie. Afhankelijk van de infectiedosis kunnen zebravissen bij een lage dosis de infectie binnen 48 uur na infectie klaren, of bij een hoge dosis bezwijken aan de infectie.De optische transparantie van zebravis RV maakt in vivo visualisatie van septine-kooien mogelijk, een prestatie die nog niet is gerealiseerd met andere vertebratenmodellen, om bewijsvoering aan te vullen dat septine-kooien bacteriën vangen en richten op autofagie. GFP lc drie transgene zebravis werden geïnfecteerd om de rekrutering van lc drie positieve autofagosomen naar intracellulaire cha in vivo en in real-time te observeren om autofagie te karakteriseren. P 62 morpho behandelde larven werden geïnjecteerd met chala controle. Morpho larven vertoonden normale septine-kooistructuren.Echter was de rekrutering van septine naar chala verminderd in de larven die behandeld waren met P 62 morpho, wat aangeeft dat P 62 een essentieel onderdeel is van het autofagiemechanisme. Zodra de infectie onder controle is, kan de PHI-larve binnen één tot twee dagen worden voltooid wanneer dit correct wordt uitgevoerd volgens deze procedure. Andere methoden, zoals genoomredigering met behulp van het CRISPR/Cas-systeem, kunnen worden gebruikt om het genoom van de zebravis te manipuleren. Daarnaast kunnen nieuwe fluorescent gelabelde zebravislijnen worden ontwikkeld om de dynamiek van het autofagie-cytoskelet in real-time te volgen tijdens gel-infectie met behulp van live-imaging na de ontdekking ervan.De Chaga-septinekooi is gebruikt om interacties tussen het autofagie-cytoskelet te bestuderen en heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de infectie- en celbiologie om nieuwe rollen van het cytoskelet bij autofagie te verduidelijken. Vergeet niet dat het werken met Ella extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een laboratoriumomgeving van niveau twee, bij het uitvoeren van deze procedure.

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.<br...

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca2 +) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca2 + fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca2 + signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.

Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Het huidige protocol beschrijft infectietests om de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatie van Shigella te ondervragen met behulp van in vitro epitheelcellijnen.

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Leer autophagie-cytoskelet interacties bestuderen tijdens Shigella flexneri infectie met behulp van HeLa-cellen en zebrafish larven. Deze methode onthult hoe septine kooien bacteriële verspreiding beperken.

Gebruik van

Meer video's verkennen