Name: Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount In situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Leer flat mount-preparatie van zebraviseieren gekleurd met whole mount in situ hybridisatie. Deze methode verbetert de visualisatie van embryonale structuren door de dooier te verwijderen en ondersteunt onderzoek naar organogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door financiering te RAW uit elk van de volgende: NIH subsidies K01 DK083512, DP2 OD008470 en R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar toekenning van een subsidie ​​# 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. We zouden vooral willen Elizabeth en Michael Gallagher bedanken, samen met het hele Gallagher Familie, die een gulle gift meegedeeld aan de Universiteit van Notre Dame te bevorderen stamcelonderzoek. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor Onderzoek zebravis in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Tot slot danken wij de leden van onze research lab voor hun opmerkingen, discussies en inzichten over dit werk, zoalsevenals Goudsbloem (Maripooka) en Zinnia Wingert voor het verstrekken van nature werpen katachtige snorharen aan de meest uitstekende lash gereedschappen voor ons onderzoek te maken.

<ol><li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+use+of+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet+3%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+zebrafish%3A+swimming+in+potential+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+3rd+ed%22">The Zebrafish Book. 3rd ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+probe+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5036%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5037%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5038%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li>
<li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li>
<li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+details%3A+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li>
<li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li>
<li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc%2Ftfap2a+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zebravis hebben bewezen een zeer waardevolle modelorganisme in de hele onderzoeksgemeenschap in de afgelopen jaren. Zebravis vertonen een aanzienlijke mate van instandhouding van genetisch materiaal met dat van hogere gewervelde dieren, en de voordelen met betrekking tot hun anatomie, fokken, en de levenscyclus maakt deze soort zeer vatbaar voor experimentele analyses. Bovendien heeft de vooruitgang van moleculaire technieken voor de zebravis verder bevorderd het gebruik van dit model organisme wetenschappelijk onderzoek. Zo hebben een grote verscheidenheid van transgene zebravis lijnen gegenereerd ziekteprogressie bestuderen en vele fundamentele vragen die de mechanismen van de ontwikkeling, waaronder de organogenese grondslag liggen beantwoorden. Dientengevolge, gebaseerd op de dynamische gebruik van zebravis zowel ziekte en ontwikkelingsonderzoek cel labeling methoden en kwantificering signaal zijn een belangrijk aspect van data analyses. Terwijl de methoden die fluorescerende een diensttibodies kan worden gebruikt om eiwitexpressie te detecteren in transgene zebravis, onderzoekers normaliter afhankelijk standaardprocedures zoals WISH 12-16 de spatiotemporele localisatie van gentranscripten in een vaste, niet-transgene zebravis monster onderzocht. In feite, WISH is een van de meest gebruikte technieken in de biologie 16, en is een essentieel instrument gebruikt om het fenotype van genetische mutaties en genetische storingen chemische kenmerken. Toch wordt WISH geassocieerd met een aantal potentiële valkuilen en uitdagingen. Om de specificiteit van het antisense ribroprobe bevestiging kan sense riboprobes worden gebruikt als een controle om de specificiteit van antisense riboprobe kleurpatronen te beoordelen. Terwijl hoofdstuk 4 en 5 worden gepresenteerd in de volgorde van etikettering en detectie van een-digoxygenine gelabelde probe gevolgd door fluoresceïne-gelabelde probe, kan deze volgorde worden omgedraaid. Meestal worden zwakkere signalen (genen met een lagere expressie niveaus) best gedetecteerd met-digoxygenine gelabelde probes en deze vlekontwikkeld voor het eerst met een paarse substraat, gevolgd door opsporing en kleuring van de sterker signaal (overvloediger uitgedrukt gen) met de rode ondergrond. Indien twee kleuren reacties zullen worden uitgevoerd, wordt aanbevolen dat verschillende combinaties van labels en substraten getest volgens de procedure die het meest geschikt is voor het verzamelen en analyseren van gegevens vinden. Daarnaast is de tijd voorzien voor het blokkeren, antilichaam incubatie en wassen die in hoofdstukken 4-5 zijn toegesneden op embryo&#39;s die jonger zijn dan 24 uur na de bevruchting; lange intervallen van dezelfde stappen met oudere embryo&#39;s kunnen leiden tot zoutophoping op het monster. Uitgebreide tips voor het oplossen van standaard zebravis embryo WISH zijn al gedocumenteerd in de literatuur 12-16. Ongetwijfeld het meest voorkomende dilemma is hoog achtergrond. Wij raden het verhogen van het aantal MABT wasbeurten in stap 4.7 tot 15-20 wast als dat nodig is, maar in onze ervaring de toevoeging van de overnight MABT &#39;super-wash&#39;geeft uitstekende resultaten bij gebruik in combinatie met 10 of meer korte MABT wast pas verder met stap 4.8. Een ander voorbeeld dilemma slecht probe infiltratie, die kan optreden bij langdurige riboprobes. Scheren de riboprobe volgende stap 3.6 door alkalische hydrolyse kan dit tegengaan. In onze ervaring met jonge monsters, wordt sonde scheren meestal niet nodig. Echter, men moet in gedachten houden dat parameters als dit kan ook een rol spelen in de uitkomst van een WISH experiment te houden, en wij stellen voor onderzoek van deze handige instructies voor probleemoplossing reeds gepubliceerd in de gemeenschap als nodig is om de experimentele parameters voor WISH verfijnen in uw eigen onderzoek 12. Naast de traditionele WISH technieken 12-16, is er een voortdurende opkomst van de vooruitgang in WISH methoden en alternatieve protocollen die zijn geformuleerd geweest. Deze omvatten nieuwe manieren signaaldetectie, bijvoorbeeld door het gebruik van fluorescentie 17-19, met methoden die de lokalisatie van microRNA 20 mogelijk. Toch, ondanks de vele verbeteringen die zijn aangebracht in de huidige cel etiketteringsmodaliteiten, de doeltreffendheid van deze procedures worden genegeerd indien de vlek (s) niet gemakkelijk kan worden gevisualiseerd in het monster plaats op een gewenst tijdstip. Deze beperking is problematisch voor onderzoekers vooral als het gaat om de vroege embryonale stadia van zebravis ontogenie, die mogelijk kan leiden tot hiaten in onze kennis van de verschillende ontwikkelingsprocessen die zich voordoen in deze tijden. Tijdens de normale ontwikkeling van de zebravis, zal de dooierzak geleidelijk afnemen in grootte als het embryo leeftijden 11. Daarom bij deze latere ontwikkelingsstadia (&gt; 24 uur na de bevruchting), WISH kleuring is vrij eenvoudig te analyseren, omdat het embryo is groter in vergelijking met de aangrenzende dooierzak. Dit is echter niet het geval uit de staart knopstadium vroeg somitogenesis (wanneer de embryonalemassa rondom de dooier) wanneer de opake dooierzak soms obscure de visualisatie van de vlek. Bijgevolg is de wijze van vlakke montage werd ontwikkeld om te helpen verlichten de beeldvorming en gegevensanalyse problemen bij de karakterisering van vroege zebravis embryo monsters (schematisch in figuur 1 en figuur 2), en is algemeen gebruikt sinds de systematische fenotypering van genetische mutaties geïsoleerde van de eerste grootschalige genetische screens 21. Sinds de komst van de vlakke montage techniek, heeft de analyse van de vroege ontwikkelingsstadia aanzienlijk verbeterd. Zodra de dooier wordt verwijderd uit het embryo, kan de embryo plat op een glasplaatje in de gewenste richting voor beeldvorming. Deze tweedimensionale positie stelt het bekijken van het gehele embryo tegelijk, waarbij de noodzaak om het monster te draaien elimineert. Talrijke weefsels bevinden zich in grote gebieden van de embryo, zoalsde voorlopers dat bloed en nieren vormen. Verder moet men om verschillende ontwikkelende weefsels vergelijken tegelijk. Vlakke montage kan de onderzoeker om gelijktijdig te bekijken het hele domein van zulke celgroepen, en kan dus sterk hulp kwantificeringen zoals een gebied meting voor een weefsel of cel-tellingen. Deze techniek heeft uiteindelijk geholpen leiden tot vele ontdekkingen met betrekking tot een aantal belangrijke ontwikkelingsstoornissen mechanismen die ten grondslag liggen hematopoiesis, neurogenese en organogenese. Dus, eenmaal onder de knie, de toepassingen voor dit eenvoudige techniek voor onderzoekers zijn vrij aanzienlijk. Bijvoorbeeld, in een studie die lijn keuze tijdens hematopoiese, vlak zet bereidingen van zebravis embryo&#39;s op de 14 en 18 somiet stadium (ss) werden gebruikt om de veranderingen die het expressiepatroon van de PU.1 zinkvinger transcriptiefactor tussen illustreren wild-type en GATA1 morfolinogroep geïnjecteerde embryo&#39;s 22.Deze werkwijze staat de detectie van een uitgebreide PU.1 domein aan 18 ss geven dat GATA1 is waarschijnlijk de expressie van PU.1 in de tussenliggende celmassa (ICM) rond dit tijdstip. Aanvullend vast gemonteerde embryo&#39;s gekleurd voor verschillende erythroid genen waaronder gtpbp1 en epsin toonde een verlies in de expressie van deze genen in VLT mutanten die GATA1 waren - / -. Verdere analyses toonden geen verandering in de expressie van genen erythoid zoals biklf en testhymin waarvan bekend was dat onafhankelijk van gata activiteit. Daarom, in combinatie met hun andere experimentele resultaten werd aangetoond dat GATA1 essentieel bij het ​​reguleren van de differentiatie van cellen in de myelo-erytroïde afstammingslijn. In een studie van neurale ontwikkeling, werden plat mounts gebruikt om Crestin expressie onderzoeken in mont blanc (mob m610) mutanten in een studiehet onderzoeken van de rol van de Mont Blanc en tfap2a gen-functie 23. Op 10 en 20 ss, werd Crestin uitdrukking volledig ingetrokken in het hoofd en werd afgenomen in de kofferbak regio mob m610 mutanten in vergelijking met de normale wild-type expressie, uiteindelijk helpen deze groep aan te sluiten op het belang van de mont blanc en tfap2a regelgeving tijdens neurale vorming. Bovendien, in termen van organogenese, platte stroken hebben de ontdekking van de aanwezigheid van verschillende domeinen in de vroege renale progenitorcellen gebied tijdens de ontwikkeling van de zebravis embryonale nier, bekend als pronephros ingeschakeld. De zebravis embryo biedt een geconserveerd en toch anatomisch eenvoudig systeem om te bestuderen hoe de nier voorouders aanleiding geven tot het nefron functionele eenheden die de pronephros bestaan, een proces dat bekend staat als nefrogenese 6,7 (figuur 4). Flat mount analyse is nuttig document domeinen van re geweestNAL voorouders en om het resultaat van veranderingen in RA signalering ontleden tijdens pronephros patroonvorming van 6,7 (figuur 5), die eerder onbekend was. Tezamen bieden deze voorbeelden blijkt dat er inderdaad veel brede toepassingen voor deze flat monteren protocol in de studie van de diverse processen die optreden tijdens normale ontwikkeling en zieke staten. Conceptueel, deze flat mount proces is redelijk eenvoudig in het algemeen. Echter, de manipulaties en de mate van finesse nodig is om deze methode onder de knie heel uitdagend om meester te zijn in de afwezigheid van visuele demonstratie. Daarom werd dit protocol opgesteld om onderzoekers, met name degenen die nieuw zijn de zebravis als model, met de mogelijkheid om beter te begrijpen hoe deze techniek uit te voeren en deel ons advies op de reagentia dat weefsel behandeling kunnen optimaliseren schakelen. Wij hopen dat dit protocol uiteindelijk zal toestaan ​​dat anderen in de gemeenschap om de meest ideale monstercondities verfijnen om u besed voor premium imaging, data-analyse, en de communicatie van hun resultaten in publicaties. Uiteindelijk moet deze onderzoekers toelaten om de anatomische belemmeringen van de zebravis tijdens vroege embryogenese te overwinnen, waarbij het voorleggen van experimentele resultaten verduisteren en lossen die door het gebruik van deze eenvoudige maar belangrijke techniek.

De zebravis, Danio rerio, is uitgegroeid tot een veel gebruikt organisme in de studie van de ontwikkelingsbiologie. Zebravis is een tropische, zoetwater gewervelde soorten die behoren tot de familie Cyprinidae. Zebravis werden oorspronkelijk gebruikt voor milieu-onderzoek om de kennis over de gevaren van potentiële water verontreinigende stoffen te krijgen, als ze waren makkelijk verkrijgbaar, goedkoop en gemakkelijk te onderhouden 1. In de afgelopen dertig jaar is de zebravis wordt erkend als een genetisch handelbaar gewervelde modelsysteem voor tal van redenen. Zebravis vertonen een hoge mate van anatomische en fysiologische conservering met hogere gewervelde dieren waaronder zoogdieren 2,3. Recente genoomsequentie annotatie is gebleken dat ongeveer 70% van de menselijke genen tenminste een zebravis tegenhanger 4. Zo hebben vele orthologe genen die een belangrijke rol spelen tijdens de ontwikkeling nier geïdentificeerd tussen deze soorten 5-7. Deze dramatic niveau van instandhouding met betrekking tot de cellulaire en moleculaire biologie heeft de onderzoekers in staat om modellen te maken voor een breed scala van menselijke ziekten in de zebravis 8, en de zebravis hebben een waardevol instrument om potentiële drug therapieën te identificeren met behulp van chemische genetische screens 9 geworden. Bovendien is de zebravis model is alleen in staat om een ​​verscheidenheid van complexe ontwikkelingsprocessen en ziektetoestanden die worden gezien bij mensen herhalen, maar verscheidene andere kenmerken zijn oproep verhogen ook als modelorganisme voor embryologische studies. Zebravis zijn ovipaar en reproduceren via broadcast spawning, waarin onderzoekers biedt een eenvoudige toegang tot de embryo&#39;s uit het begin van de bevruchting 10. Andere voordelen zijn embryo grootte, transparantie, en een snelle, externe ontwikkeling 10. Daarnaast zebravis volwassenen bezitten een hoge vruchtbaarheid en produceren meestal relatief grote clutch maten die kan variëren tussen 200-500per week uiteindelijk waardoor onderzoekers high throughput experimenten, zoals fenotype gebaseerde chemische schermen met gemak 9. Toch, ondanks de overvloed aan voordelen die worden tentoongesteld door de zebravis model, zijn er uitdagingen die betrekking hebben op de analyse en de communicatie van de experimentele resultaten verkregen uit de vroege ontwikkelingsstadia. In sommige gevallen kan de inherente anatomie van de zebravis embryo de visualisatie van zijn gegevens verhullen. Na de bevruchting, de eerste cel ondergaat meerdere decollete evenementen ontwikkeling vordert 11. Na gastrulatie, de embryonale as komt in de tailbud fase (10 HPF) zodanig dat het rond de dooier 11. Als verdere ontwikkeling vordert in de segmentatie periode zal de stam groeien in massa en ook verlengen door axiale verlenging zodat een staart met een gedeelte van de dooierzak zich uitstrekken vanuit de centrale dooier massa11. Tussen de tailbud en 20 somiet stadium (19 HPF), pogingen om specifieke ontwikkelingsstoornissen functies waarnemen na het gebruik van verschillende kleuringsprotocollen, zoals WISH, kan een uitdaging, zowel om te visualiseren en te fotograferen vanwege de geometrie van het embryo en de ondoorzichtigheid van de dooierzak. Een manier om deze problemen te elimineren is de dooier verwijderen en plat het embryo in een tweedimensionale monster dat op een meer eenvoudige wijze kunnen worden geanalyseerd. Het volgende protocol-en video-middelen bieden een leidraad voor hoe je succesvol deyolk en vlakke monteer een embryo na fixatie en kleuring, met behulp van het voorbeeld van een of twee kleuren WISH kleuring. WISH is een veelgebruikte techniek die de detectie van specifieke nucleïnezuren in geconserveerde monsters mogelijk maakt en daarmee maakt de plaats (en) van genexpressie te detecteren in weefsels. WISH technieken zijn uitvoerig beschreven en kan worden uitgevoerd met verschillende kleuren substraten en grieporescent detectiesystemen 12-20. Hier bieden wij onze gewijzigde WISH protocol dat wordt gebruikt voor de zebravis embryo&#39;s tussen de tailbud en segmentatie stadia van ontwikkeling. Alternatieve WISH protocollen echter verenigbaar zijn met het platte hier beschreven mount procedure, zoals vermeld aan het begin van de onderstaande protocol. Daarnaast kunnen vlakke montage worden gebruikt in combinatie met een aantal bestaande visualisatietechnieken, zoals hele berg immunohistochemie of cellijn volgen labels, die niet in dit protocol beschreven. Al met al kan de techniek van platte montage beter in staat stellen superieure analyse en presentatie van de resultaten van proeven met de vroegste stadia van de embryonale ontwikkeling in de zebravis.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in gedistilleerd water. Supplement met methyleenblauw (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) om besmetting te remmen.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Verdun 50 X E3 in gedistilleerd water.</td></tr><tr><td>Mesh tea strainer</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Embryo incubatie schaal</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje met platte bodem</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Glazen flesje</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Tween-20 detergent in 1x PBS, gemaakt door 10x PBS te verdunnen in gedistilleerd water.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Los 4% PFA (w/v) op in 1x PBS, breng aan de kook op een hotplate in een afzuigkap. Koel en vries aliquots in voor opslag bij -20 &deg;C. Ontdooi vlak voor gebruik en bevries stocks niet opnieuw.</td></tr><tr><td>Filter sterilisatie unit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L filter systeem, 0,45 &mu;m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Los op in gedistilleerd water om een proteinase K stock (10 mg/ml) te maken en bewaar aliquots bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml gist torula RNA, 50 &mu;g/&mu;l heparine</td></tr><tr><td>DIG/FLU gelabelde riboprobe in vitro transcriptie reactie reagentia</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Raadpleeg de instructies van de fabrikant.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1 remmer</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 remmer, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Vries 50 ml aliquots van 100% EtOH en 70% EtOH (verdund met moleculair gezuiverd water) in en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Moleculair gezuiverd gedistilleerd water</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Model 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formule: Meng in 1,5 L gedistilleerd water 23,2 g maleïnezuur, 17,5 g NaCl, 55,0 g Trisma base, voeg dan 8 ml van 1M Tris-HCl pH 9,5 toe en vul vervolgens aan tot 2 L. Autoclaveer.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Blok oplossing</td><td></td><td></td><td>We maken in 50 ml verse aliquots: 10 ml BSA (uit 10% lab stock), 5 ml FCS (uit stock), en 35 ml MABT. Bewaar ongebruikt blok bij 4 &deg;C om te gebruiken voor antilichaam oplossing. Opmerking: Ontdooi de BSA en FCS stocks bij 37 &deg;C – als je ze bij een hogere temperatuur ontdooit, worden ze een dikke gel (niet gebruiken).</td></tr><tr><td>FCS (foetaal runder serum) stock</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Vries in 5 of 10 ml portieën in en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>BSA (runderserum albumine) stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Maak een 10% stock verdund in MAB door de BSA vlokken bij kamertemperatuur op te lossen met snel roeren, bewaar vervolgens 10 ml aliquots bij -20 &deg;C. Bewaar onopgeloste BSA vlokken bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenine antilichaam</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-fluoresceine antilichaam</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>12-well kleurplaat</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Pre-kleuring buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Maak altijd vers: het zal in de loop van een paar dagen gaan bezinken.</td></tr><tr><td>Kleuroplossing-paars</td><td></td><td></td><td>Voor elke 10 ml die nodig is: voeg 45 &#956;l van NBT en 35 &#956;l van BCIP toe aan verse pre-kleuring buffer (niet gebruikt op embryo monsters).</td></tr><tr><td>Kleuroplossing-rood</td><td></td><td></td><td>Voor elke 10 ml die nodig is: voeg 31,5 &#956;l van INT en 35 &#956;l van BCIP toe aan verse pre-kleuring buffer (niet gebruikt op embryo monsters).</td></tr><tr><td>NBT stock</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Opgeslagen bij -20 &deg;C; poeder verdund 50 mg/ml in 70%

flat mount voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo exemplaren gekleurd door whole mount<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

De zebravis embryo wordt nu vaak gebruikt voor basis-en biomedisch onderzoek naar de genetische controle van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken en te modelleren aangeboren afwijkingen. Tijdens de eerste dag van het leven, de zebravis embryo doorloopt vele ontwikkelingsstadia waaronder bemesting, decollete, gastrulatie, segmentatie, en de organogenese van structuren zoals de nieren, het hart en het centrale zenuwstelsel. De anatomie van een jonge zebravis embryo presenteert een aantal uitdagingen voor de visualisatie en analyse van de betrokken bij vele van deze evenementen weefsels omdat het embryo zich ontwikkelt in samenwerking met een ronde dooier massa. Zo nauwkeurige analyse en beeldvorming van experimentele fenotypes vaste embryonale specimens tussen tailbud en 20 somiet fase (10 en 19 uur na de bevruchting (HPF), respectievelijk), zoals gekleurd met hele mount in situ hybridisatie (WISH), het is vaak wenselijk om het embryo uit de dooier b VerwijderEn het plat op een glasplaatje positioneren. Echter, het uitvoeren van een platte berg procedure kan vervelend zijn. Daarom succesvol en efficiënt plat mount voorbereiding wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door de visuele demonstratie van de dissectie techniek, en ook geholpen door het gebruik van reagentia die helpen bij het optimaal weefsel handling. Hier bieden we onze wens protocol voor een of twee kleuren detectie van genexpressie in de zebravis embryo, en laten zien hoe de vlakke montage procedure kan worden uitgevoerd op dit voorbeeld van een gebrandschilderd vast exemplaar. Deze vlakke montage protocol is breed toepasbaar op de studie van vele embryonale structuren die ontstaan ​​tijdens de vroege ontwikkeling van de zebravis, en kan in combinatie met andere kleuringen uitgevoerd op vaste embryo monsters worden uitgevoerd.

De vlakke montage protocol procedure omvat transformatie van de zebravis embryo van zijn normale anatomie, waarbij het ​​lichaam as rond een centraal dooier bal, in een tweedimensionale opstelling (figuur 1A). Whole mount beeldvorming van de jonge zebravisembryo wordt beperkt door de aard van hoe de embryonale as wordt gewikkeld rond de dooier. Dientengevolge, zijdelings of dorsale uitzicht ganse berg gekleurd embryo exemplaren slechts een gedeelte van de as of obscure bepaalde weefsels (Figuur 1B) vastleggen. Ter vergelijking, deyolking en afvlakking van het embryo kan de volledige embryonale as worden gevisualiseerd in een keer (figuur 1B). Deze beperkingen worden aangetoond door behandeling van een WISH gekleurde embryo dat werd gelabeld met antisense riboprobes voor irx3b detecteren (paars), waarbij een subset van de renale voorlopers gelegen naast somieten 7 tot 13 ​​tekens en MYOD1 (rood) die de labelssomieten (Figuur 1B). Het gebied van irx3b + renale voorlopers verduisterd in het geheel mount zijaanzicht omdat irx3b transcripten overvloedig in het centrale zenuwstelsel, waardoor de renale gebied praktisch onmogelijk te visualiseren met de laterale camerahoek; voorts het gebied van irx3b + renale voorlopers slechts gedeeltelijk zichtbaar als het embryo wordt geroteerd in een dorsale camerabeeld omdat het veld rond de dooier (Figuur 1B). Echter, een dorsaal aanzicht van hetzelfde embryo volgende vlakke montage maakt het gehele gebied van irx3b + renale voorlopers op eenvoudige wijze ten opzichte van de somieten langs de stam en andere embryonale structuren (figuur 1B) te analyseren. Aldus kan uitgebreid ruimtelijke domeinen idealiter gedocumenteerd met deze methode. Een aantal belangrijke stappen zijn betrokken bij de succesvolle uitvoering van de platte berg procedure. Om dit techniqu uitvoerene, moet de dooier bal worden losgemaakt van de embryo (Figuur 2A), die kan worden gedaan met fijne instrumenten zoals een paar fijne tang terwijl het embryo wordt gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop. Na de ruwe verwijdering van de dooier bal, is een fijne zweep hulpmiddel gebruikt om weg te schrapen dooier korrels die zijn gebleven gehecht aan het embryo (Figuur 2B). De verwijdering van de resterende dooier korrels helpt om visualisatie van de embryonale weefsels te vergemakkelijken. Tenslotte wordt de deyolked embryo gemanipuleerd om het stabiel positioneren op een glasplaatje (figuur 2C), die observatie en steun documentatie van het monster met beeldbewerkingssoftware en een camera aan de microscoop mogelijk maakt. De zweep tools zijn zelfgemaakte apparaten die kunnen worden geconstrueerd door het aanbrengen van een geschikte zweep een pipet met behulp van superlijm, die op een handvat indien gewenst (Figuur 3A, Materials tabel) kan worden gemonteerd. Verschillende zweep monsters kunnen worden aangeschaft om te producerenlash gereedschappen met iets andere eigenschappen in termen van lengte en taper (Figuur 3B), die elke gebruiker andere voorkeuren voor een keer ze beginnen te experimenteren met de platte berg procedure kan hebben. Voorbeelden van lash monsters omvatten in de natuur werpen menselijke wimpers, natuurlijk schuur dier stug haar of bakkebaarden, en tenslotte synthetische variëteiten van in de handel verkrijgbare wimpers gevonden in de detailhandel cosmetische afdelingen. De lokale omgeving en met het monster (s) geplaatst op een glasplaatje (Figuur 4A) kan worden afgebeeld voor hoge-resolutie analyse. Een combinatie van probes werden gebruikt om de ontwikkeling van renale voorlopers die aanleiding geven tot de nier in het wildtype embryo in vroege ontwikkelingsstadia met tweekleurige WISH label, en vlakke montage bereidingen werden uitgevoerd op de monsters (Figuur 4B, 4C bekijken ). Tijdens de vroege stadia somite worden renale voorlopers afgebakend in een U-vormig patroon door eeir uitdrukking van pax2a transcripten (paars) rondom de paraxiale mesoderm die tegelijkertijd uitdrukt delta C (DLC) (rood) (linker kolom, figuur 4B) 6,7. In vergelijking, toen dlc transcripten werden gedetecteerd met een paarse substraat en werden gemerkt in combinatie met de achterhersenen marker krox20 (rood), een rostrale subdomein van de renale voorlopers werd gevisualiseerd dat dlc (rechterkant Figuur 4B) tot expressie, zoals eerder opgemerkt 6,7. Flat mount preparaten kunnen eveneens worden gebruikt voor latere stadia somitogenesis bestuderen. Bij de 14 somiet podium, analyseerden we de expressie van renale merkers pax2a, slc4a4 en slc12a3 (paars), samen met smyhc1 (rood), die de somieten (figuur 4C) markeert. Deze combinaties mogelijk de toewijzing van de gehele nier voorlopercellen domein pax2a, terwijl onthullen dat een subset van cellen in een rostrale subdomein exprEssed slc4a4a en werden gekenmerkt door een niet-overlappende caudale subdomein van renale voorouders die slc12a3 uitgedrukt. Twee kleuren WISH en de vlakke montage voorbereiding zijn ook waardevol voor de studie van cellulaire domeinen tijdens de organogenese in zebravis met genetische mutaties of andere verstoringen van het milieu blootstelling aan kleine moleculen 6,7 (figuur 5). De zebravis nls en lib mutanten haven mutaties in aldehyde dehydrogenase 1A2 (aldh1a2, voorheen raldh2), die een enzym vereist voor de biosynthese van retinoïnezuur (RA) codeert. RA is essentieel voor de goede ontwikkeling van vele renale celtypen waaronder de vorming van podocyte cellen die bijdragen aan het bloedfilter van de embryonale nier, bekend als de glomerulus 6,7 maken. WISH werd uitgevoerd om de podocyte voorouders met wt1a label gelijktijdig met afbakening van thij ontwikkelt somieten met smyhc1 en achterhersenen met krox20 in wildtype embryo, nls mutant embryo, lib mutant embryo&#39;s en embryo&#39;s behandeld met een enzym ALDH chemische remmer, DEAB (figuur 5). Embryo&#39;s met deficiënte expressie aldh1a2 toonde verminderde wt1a expressie vergeleken met wildtype embryo&#39;s, terwijl DEAB behandelde embryo&#39;s vertoonden een afschaffing van wt1a transcripten (figuur 5, rechter kolom). Tezamen deze representatieve resultaten tonen hoe de platte mount techniek kan worden gebruikt voor het analyseren en documenteren anatomische verschillen nauwkeurig in het vroege embryo en dus waardevolle ontwikkelingsstudies uitgevoerd. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van de flat mount voorbereidingrantsoen voor zebravis embryo&#39;s. A) De procedure van vlakke montage maakt het mogelijk gelijktijdig weergave van weefsels langs de embryonale as omdat de centrale dooier massa wordt verwijderd en het embryo stabiel geplaatst op een vlakke ondergrond. B) afbeeldingen van een hele berg WISH lood embryo in laterale en dorsale uitzicht, en dan na een vlakke mount preparaat werd uitgevoerd. Het embryo werd gekleurd met antisense probes naar gentranscripten coderen irx3b (paars) en MYOD1 (rood) op te sporen. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische voorstelling van de platte berg procedure voor zebravis embryo&#39;s. A) Het embryo wordt eerst grove deyolked om de meerderheid van de dooier massa te verwijderen, dan (B) het ventrale oppervlak is fijn deyolked om de resterende dooier korrels te verwijderen, enNa wassen van de embryo (C) gemonteerd dorsale zijde naar boven op een glasplaatje voor visuele analyse en / of fotografische beeldvorming. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figuur 3. Foto&#39;s van bijvoorbeeld lash instrumenten in vergelijking met fijne pincet. A) Homemade lash gereedschappen werden afgebeeld naast een standaard paar fijne tang, gepositioneerd naast een metrische liniaal om een referentie. B) Vergrote weergave van lash instrumenten naast de fijne tang te voorzien, met de millimeter verwijzing voorzien langs de bovenkant van het uitzicht . Twee verschillende lash tools worden getoond, met het sterretje (*) wordt gebruikt om de zweep verkregen uit markeren een natuurlijk werpen menselijke wimper en dubbele asterisk (**) gebruikt om een ​​zweep die werd verkregen uit een natuurlijk schuur katachtige snorhaar en geknipt te markeren maak een enigszins stomp uiteinde. In elk case, de zweep werd schroefdraad door de pipet tip en aangebracht met een aantal lagen van superlijm geleidelijk tot een sterke afdichting te stabiliseren / verankeren de zweep om de pipet bevestigd aan een behandeling apparaat. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figuur 4. Karakterisering van de ontwikkelingsdoelen veranderingen in de voorlopercellen veld nier in het wild type zebravis embryo. A) Schuif schematische aanduiding van de omgeving in beeld gebracht voor analyse in (B, C). B) Wild-type embryo&#39;s in de 1, 3, en 5 somiet stadium werden gekleurd door twee kleuren WISH om de samenstelling van de renale voorlopercellen veld dat geeft beoordelen aanleiding tot de embryonale nier of pronephros. (Linkerkolom) Afschriften codeert voor de transcriptiefactor pax2a (gekleurd in paars) markeren verschillende bevolkingsgroepen in het embryo, met inbegrip van de renale progenitor veld dat naar voren komt uit de intermediaire mesoderm. Transcripten die coderen voor de Notch ligand dlc markeren de somieten die vorm van de paraxiale mesoderm (gekleurd in het rood). (Rechterkolom) Wanneer de expressie van dlc transcripten (gekleurd in paars) en de achterhersenen rhombomere marker krox20 (gekleurd in het rood) in dezelfde embryo&#39;s worden onderzocht, kan dlc expressie worden waargenomen in een rostrale subdomein van de renale voorouders gelegen naast somieten 1-5, die werd verduisterd tijdens co-kleuring van dlc met pax2a. C) Wild-type embryo&#39;s in de 14 somiet podium waren twee-of driepersoons-gekleurd met een combinatie van een nier-marker (paars), de somiet marker smyhc1 (rood) , en de achterhersenen rhombomere marker krox20 (ook rood). (Bovenpaneel) In deze fase pax2a transcripten blijven de renale voorlopers bakenen. (Midden, Neder-panelen) Binnen de renale stamvader grondgebied, een rostral subdomein is gemarkeerddoor slc4a4 en transcripties die slc12a3 coderen merk een caudale subdomein. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figuur 5. Het gebruik van platte gemonteerd voorbereidingen om de fenotypes veroorzaakt door genetische mutaties of chemische genetische verstoringen die retinoinezuur biosynthese moduleren karakteriseren. De wens expressie patroon op de 15 somiet stadium van wt1a (paars) en smyhc1/krox20 (rood) vergeleken tussen wilde soorten en embryo&#39;s met tekortkomingen in retinoïnezuur (RA) productie als gevolg van defecten in aldehyde dehydrogenase 1a2 (NLS en lib mutaties) of chemische inhibitie van retinaldehyde dehydrogenase activiteit met diethylaminobenzaldehyde (DEAB). De vermindering van RA productie lib iets ernstiger dan nls, zoalsdat lib embryo uitdrukken iets verlaagd kleuring van wt1a transcripten dan vergelijkbare wijze geënsceneerd NLS mutant embryo&#39;s, terwijl DEAB behandeling van wilde soorten wordt geassocieerd met volledige intrekking van wt1a expressie.

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Het algemene doel van deze procedure is om gekleurde, gefixeerde zebravis-embryo's in vroege ontwikkelingsstadia beter te kunnen visualiseren. Dit wordt bereikt door het zebravis-embryo eerst te kleuren met behulp van home mount in C two hybridisatie. Vervolgens wordt een embryo geselecteerd voor flat mounting en wordt er met een fijne pincet een centrale incisie in de dooier gemaakt, waarna lash-tools worden gebruikt om de resterende dooierkorrels voorzichtig weg te schrapen en te verwijderen.Ten slotte wordt het embryo in glycerol op een objectglas gemonteerd om een passende beeldvorming van het specimen mogelijk te maken. Uiteindelijk maakt platmontage een betere visualisatie van gekleurde embryo's vanuit een dorsaal perspectief mogelijk door de dooier te verwijderen en het embryo in een tweedimensionale preparaatpositie te plaatsen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de beeldvorming van intacte embryo's in jongere ontwikkelingsstadia, is dat platmontage de dooierzak verwijdert waardoor het gehele embryo kan worden bekeken.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkeling, zoals het karakteriseren van het domein van het renale pre-geslachtsveld in een embryo. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn aan deze methode moeite omdat deze techniek een uiterst voorzichtige behandeling van het embryo vereist, en omdat het tijd kan kosten om te leren hoeveel druk er precies nodig is om de dooierzak te verwijderen. Deze procedure wordt gedemonstreerd door mijzelf, Zoe en Amanda, die promovendi zijn in het Winger-laboratorium.Nadat de embryo's zijn verzameld, gefixeerd en gekleurd volgens het tekstprotocol, selecteert u een embryo voor flat mounting met één X-P-B-S-T. Verplaats het embryo naar een plastic of glazen petrischaal. Rol vervolgens met de schaal onder een stereomicroscoop het embryo met een fijne pincet, zodat een zijaanzicht wordt verkregen waarbij zowel de kop- als de staartzijde zichtbaar zijn.Gebruik vervolgens een fijne pincet om het embryo stil te houden en een tweede pincet om een incisie te maken in de dooier op een centraal gelegen positie tussen de kop en de staart van het embryo. Schep daarna met een fijne pincet de dooier uit de holte van de eicel. Gebruik één X-P-B-S-T om loszittende dooier van het embryo te spoelen met één tot twee druppels XPBS.Overbreng het embryo naar een plat glazen objectglas. Sleep het embryo naar de rand van de buffer zodat het in een vlakke positie tegen het objectglas blijft liggen. Terwijl het embryo wordt gefixeerd, gebruikt u een lash-instrument om de ventrale zijde voorzichtig af te schrapen om dooierkorrels te verwijderen.Als de PBST-oplossing vervuild raakt met overtollig dooier of begint te verdampen, voeg dan één tot twee verse druppels toe en sleep het embryo naar deze verse buffer. Nadat de dooier naar tevredenheid is verwijderd, wordt het embryo voorzichtig teruggeplaatst in een Petrischaal met PBST voor een laatste spoeling. Verplaats het embryo vervolgens naar een Petrischaal met 100% glycerol en laat dit vijf minuten incuberen.Om het embryo op een glazen objectglas te monteren, brengt u het over naar een schoon objectglas. Breng één tot twee druppels 100% glycerol aan en positioneer het embryo met de ventrale zijde van de dooier naar het objectglas gericht. Sleep het embryo met een wimperharnas naar de rand van de glyceroldruppel, zodat het in een vlakke positie tegen het glas blijft liggen.Als de embryonale as gekromd is, gebruik dan de fijne pincet om voorzichtig kleine incisies in de resterende dooier te maken om de spanning te verminderen, zodat deze plat op het preparaatglas kan worden geplaatst. Plaats kleine stukjes boetseerklei op de vier hoeken van een glazen dekglas van 18 bij 18.Plaats het dekglas langzaam op het embryo, waarbij het dekglas schuin wordt gehouden om luchtbellen in de glycerol te minimaliseren. Voeg tenslotte een extra druppel 100% glycerol toe aan de zijkant van het dekglas om de ruimte tussen het glas te vullen en verschuivingen te voorkomen; gebruik een stereomicroscoop of lichtmicroscoop voor de hier getoonde afbeeldingen. Een combinatie van probes werd gebruikt samen met twee-kleuren-FISH om ontwikkelende renale progenitorcellen te labelen die de nier vormen, en de embryo's werden in een vroeg stadium plat gemonteerd.In het 14-somietenstadium worden renale progenitorcellen in een U-vormig patroon afgebakend door hun expressie van PAX2a-transcripten rondom het pariëtale mesoderm, dat gelijktijdig deltaC tot expressie brengt, weergegeven in rood. Wanneer deltaC werd co-gelabeld met Ctx20, werd een rostral subdomein van de renale progenitorcellen onthuld dat deltaC tot expressie brengt. De analyse van de expressie van PAX2a, SLC4A4, SLC12A3 en SMYHC1 in het 14-somietenstadium maakt het mogelijk om het gehele renale progenitordomein in kaart te brengen met PAX2a, en onthulde dat een subset cellen in het rostrale subdomein SLC4A4 tot expressie bracht.Dit overlapte niet met het coddle-subdomein van renale progenitoren die SLC 12 A drie tot expressie brachten. In deze figuur ontwikkelden embryo's met mutaties in het Retin Retinaldehyde dehydrogenase twee-gen, dat vereist is voor de biosynthese van retinoïnezuur, of embryo's behandeld met DEAB en een ALD H-remmer, respectievelijk een verminderde of afwezig expressie van WT one A, wat aantoont dat twee kleur wish met de flat mount-preparatie waardevol is voor de studie van cellulaire domeinen tijdens organogenese. In zebravissen met genetische mutaties of bij chemische blootstelling aan kleine moleculen. Zodra deze techniek onder de knie is, neemt het 10 tot 15 minuten in beslag indien correct uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals imaging, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de locatie van de grenzen van de niersegmenten. Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een gekleurd zebravissenembryo plat kunt prepareren om de gewenste structuren beter te kunnen visualiseren door verwijdering van de dooier.

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Dit artikel beschrijft een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming. Deze methode is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren met behulp van gewone microscopieschalen met glazen bodem voor beeldvorming op inverted microscope. De montage wordt uitgevoerd in lagen agarose in verschillende concentraties.

Gelaagde agarmontage: levende zebravisembryo's voorbereiden op langetermijnbeeldvorming met een omgekeerde microscoop

Deze video beschrijft stap voor stap instructies voor het monteren van levende zebravisembryo's op 6 putplaat met behulp van laag smeltagarose. Het biedt ook het proces om beelden van levende embryo's te verkrijgen en deze te analyseren met behulp van software.

Agar-montage: een basismethode voor het monteren van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer flat mount-preparatie van zebraviseieren gekleurd met whole mount in situ hybridisatie. Deze methode verbetert de visualisatie van embryonale structuren door de dooier te verwijderen en ondersteunt onderzoek naar organogenese.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount In situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount

Meer video's verkennen