Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount In situ Hybridisatie

Het algemene doel van deze procedure is om gekleurde, gefixeerde zebravis-embryo's beter te visualiseren in vroege ontwikkelingsfasen. Dit wordt bereikt door eerst het zebravis-embryo te kleuren met behulp van home mount in C twee hybridisatie. Vervolgens wordt een embryo geselecteerd om te vlak plaatsen en wordt er een centrale incisie gemaakt in het dooier. Met behulp van een paar fijne pincetten worden vervolgens de riemtools gebruikt om voorzichtig de resterende dooiergranen te schrapen en te verwijderen.

Ten slotte wordt het embryo in glycerol op een dia gemonteerd om de juiste beeldvorming van het specimen mogelijk te maken. Uiteindelijk zorgt vlak plaatsen voor een betere visualisatie van gekleurde embryo's vanuit een dorsale weergave door het verwijderen van het dooier en het plaatsen van het embryo in een tweedimensionale voorbereiding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het beeldvormen van intacte embryo's in jongere ontwikkelingsstadia is dat vlak plaatsen de dooierzak verwijdert, waardoor het hele embryo kan worden bekeken.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkeling, zoals het karakteriseren van het domein van het renale voorgeslachtveld in een embryo. Over het algemeen worstelen nieuwkomers in deze methode omdat deze techniek een delicate behandeling van het embryo vereist, en ook omdat het leren van de juiste hoeveelheid druk die nodig is om de dooierzak te verwijderen tijd kan kosten. Het demonstreren van deze procedure zal worden uitgevoerd door mijzelf, Zoe en Amanda, die afgestudeerde studenten zijn in het winger laboratorium.

Na het verzamelen, fixeren en kleuren van embryo's, selecteer volgens het tekstprotocol een embryo voor vlak plaatsen met één X-P-B-S-T. Breng het embryo over in een plastic of glazen petrischaal. Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop met de schaal fijne pincetten om het embryo te rollen, zodat een laterale weergave wordt verkregen met de kop en staart uiteinden zichtbaar.

Gebruik vervolgens fijne pincetten om het embryo vast te houden en een tweede set om een incisie in de dooier te maken op een plaats centraal gelegen tussen het hoofd en de staart van het embryo. Gebruik vervolgens met fijne pincetten om het dooier uit de eikencelholte te scheppen. Gebruik één X-P-B-S-T om het embryo te spoelen met één tot twee druppels van één XPBS.

Breng het embryo over in een glazen vlak. Trek het embryo naar de rand van de buffer zodat het in een platte positie tegen de glazen plaat blijft. Terwijl het embryo wordt verankerd, gebruik een riemtool om voorzichtig de ventrale oppervlakte te schrapen om dooiergranen te verwijderen.

Als de PBST-oplossing rommelig wordt door overtollig dooier of begint te verdampen, voeg dan één tot twee verse druppels toe en trek het embryo naar deze verse buffer. Nadat het dooier op bevredigende wijze is verwijderd, draagt u het embryo voorzichtig over in een petrischaal met PBST voor een laatste spoeling. Breng vervolgens het embryo over in een petrischaal met 100% glycerol en incubeer gedurende vijf minuten.

Om het embryo op een glazen plaat te plaatsen, breng het over naar een schone glazen. Plaats één tot twee druppels van 100% glycerol op de plaat en plaats het met de ventrale dooierzijde naar de glazen plaat. Gebruik een riemtool om het embryo naar de rand van de glyceroldruppel te trekken, zodat het in een platte positie tegen de plaat blijft. Hier is een combinatie van sondes gebruikt samen met twee kleurwensen om zich ontwikkelende renale progenitoren te labelen die aanleiding geven tot de nier en de embryo's werden vlak gemonteerd in vroege.

So-mite-stadia, renale progenitoren zijn afgebakend in een U-vormig patroon door hun expressie van PAX twee A transcripten die de parial mesoderm omringen die geconcomitaat delta C uitdrukt, weergegeven in rood. Toen delta C werd gecolabeld met C crox 20, werd een rostrale subdomein van de renale progenitoren onthuld dat delta C toonde. Het analyseren van de expressie van PAX twee a, SLC vier A vier, SLC 12 A drie en S-M-Y-H-C een bij de 14. So-mite-fase maakt het mogelijk om het hele renale progenitordomein met PAX twee A te mappen en onthulde dat een subset van cellen in het rostrale subdomein SLC vier A vier tot expressie brengt.

Dat overlapte niet met het coddle-subdomein van renale progenitoren dat SLC 12 A drie tot expressie brengt. In deze figuur ontwikkelden embryo's met mutaties in het Retin Retinaldehyde-dehydrogenase twee-gen, dat nodig is voor de biosynthese van retinoïnezuur, of embryo's die werden behandeld met DEAB en ALD H-remmer, met verminderde of afgebrokkelde expressie van WT een A, waardoor werd aangetoond dat twee kleurwensen met de vlakmontagevoorbereiding waardevol is voor de studie van cellulaire domeinen tijdens organogenese. In zebravissen met genetische mutaties of bij chemische blootstelling aan kleine moleculen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek 10 tot 15 minuten duren als deze correct wordt uitgevoerd.

Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals beeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals waar de grenzen van de niersegmenten zich bevinden. Na het bekijken van de video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gekleurd zebravis-embryo vlak moet plaatsen om de gewenste structuren beter te visualiseren door het verwijderen van het dooier.