Name: Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor In Vitro Emaille Hergroei met een dichte Interface (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een protocol voor oppervlakkige glazuurherstel met amelogenine-chitosan hydrogel. Deze methode bevordert in situ apatietkristalgroei voor een dichte interface en verbeterde mechanische sterkte van tandheelkundige restauraties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Prof. Steven Nutt en de heer Yuzheng Zhang bedanken voor hun assistentie met de Focus Ion Beam, en het Centrum voor Elektronenmicroscopie en Microanalyse (CEMMA) aan de USC voor elektronenmicroscopie. Het onderzoek werd ondersteund door NIH-NIDCR-subsidies; DE-13414 en DE-020099 aan J.M.O.

Het menselijk molaren werden geëxtraheerd volgens de standaardprocedures voor afzuiging aan de Ostrow School voor Tandheelkunde van de Universiteit van Zuid-Californië en behandeld met goedkeuring van de Institutional Review Board. 1. Voorbereiding van geëtst Tooth Slice <ol><li> Selecteer een mens derde kies zonder hersteld cariës. </li><li> Verwijder het basisgedeelte van de molaire en snijd de kroon van de molaire langsrichting in plakjes 2 mm dikte met een watergekoelde lage snelheid diamantzaag. Ultrasoon reinigen van deze schijfjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer. </li><li> Erosieve laesies simuleren, etsen de tand plakjes met 30% fosforzuur gedurende 30 seconden dan ze onmiddellijk spoelen met gedemineraliseerd water. </li><li> Ultrasoon reinigen van de geëtst plakjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer. </li></ol> 2. Bereiding van Amelogenine-chitosan Hydrogel <ol><li> Preparation van chitosan stockoplossing <ol><li> Los 1% (w / v) chitosan (gemiddeld molecuulgewicht, 75-85% gedeacetyleerd) in 1% (v / v) azijnzuur oplossing, gevolgd door roeren bij 80 ° CO / N. </li><li> Na afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur, filtreer de chitosanoplossing met een 0,45 pm filter. Stel de pH-waarde van 5,0 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing. </li></ol></li><li> Bereiding van calcium en fosfaat stockoplossing (0,1 M) <ol><li> Weeg calciumchloride (CaCl2) en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is. Stel de pH tot 11 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing. </li><li> Weeg dibasisch natriumfosfaat (Na 2 HPO 4) en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is. </li></ol></li><li> Expressie en zuivering van recombinant amelogenin 17-18 Het recombinante volledige lengte varkens amelogenin (rP172) hier gebruikt heeft 172 aminozuren en is een analoog van volledigeLengte natieve P173 varkens, maar niet de N-terminale methionine en een fosfaatgroep op Ser16 18. <ol><li> Voeg 20 g lysogenie bouillon (LB) agar poeder in 500 ml gedeïoniseerd water, autoclaveren de oplossing bij 121 ° C (vloeibaar instelling) gedurende 20 minuten. Laat agar afkoelen tot ~ 55 ° C, voeg ampicilline (100 ug / ml) in agaroplossing. </li><li> Breng de agar oplossing voor petrischaaltjes, laat elke plaat afkoelen tot hij is solide, dan flip om condensvorming aan de agar te voorkomen. WINKEL platen in plastic zakken bij 4 ° C. </li><li> Streak de LB-agar plaat met recombinante cellen (E.coli-BC21) uit de glycerol voorraad (-80 ° C). Incubeer de platen O / N bij 37 ° C. </li><li> Bereid 50 ml NZCYM media en media autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Laat het materiaal afkoelen, voeg 50 ul van 100 ug / ml ampicilline aan de 50 ml media. </li><li> Inoculeren een enkele kolonie van de LB-agar plaat in de 50ml NZCYM media aangevuld met ampicillIncubeer de cellen in O / N in een schudincubator bij 37 ° C. </li><li> Bereid 1 liter autoclaaf NZCYM media en media bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 1 ml van 100 mg / ml ampicilline aan 1000 ml media. Neem een ​​optische dichtheid (OD) lezen als een leeg met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. OPMERKING: Gebruik dit niet weg na de eerste lezing. </li><li> Inoculeren 10 ml van de celkweek uit stap 2.3.5 tot 1000 ml media uit stap 2.3.6. Lees de optische dichtheid bij 595 nm onmiddellijk na inoculatie. Neem de optische dichtheid lezen periodiek bij te houden van de groei te houden. OPMERKING: Lees de lege elke keer de OD wordt genomen. </li><li> Veroorzaken met 700 pl isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1M) wanneer de bacteriële groei reikt tot ongeveer 0,75 ~ 0,8 OD bij 595 nm. </li><li> Oogst de cellen wanneer de OD bereikt 1.1. Giet de inhoud van de kolf tot 6 plastic flessen. Evenwicht te brengen en wegen van de flessen voordat u de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 8554 xg bij 4 ° C.Houd de celpellet in het -20 ° CO / N. </li><li> Haal de cel pellets en combineer ze in een 50 ml buis. Voeg 3,5 ml 4M Guanidine HCl per L van de gisting. Sonicaat 2-3 keer op het ijs, 30 seconden per keer, met 1 min. intervallen. </li><li> Maak 6x verdunningen van cell volume met 0,5% mierenzuur en laat het roer in de koude kamer voor 2 uur. Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof. Voeg 20% ​​verzadigd ammoniumsulfaat behulp van de verzadigde stock-oplossing en beroering in de koude kamer, O / N. </li><li> Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C en houd de pellet. Reconstitueer de pellets in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), lading op een C4-kolom (10 x 250 mm, 5 pm) en fractioneren met een lineaire gradiënt van A = 0,1% TFA en B = 60% acetonitril in TFA bij een debiet van 1,5 ml · min -1. </li><li> Bevries de eiwit-oplossing op droog ijs en lyofiliseren het bevroren monster O / N. </li></ol></li><li> Voorbereiding van amelogenin-chitosan (CS-AMEL) HYDROGel (Figuur 1A) <ol><li> Voeg 200 ug rp172 in een buis met 960 ui 1% chitosan-oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is. </li><li> Voeg 25 ul van 0,1 M CaCl2-oplossing, gevolgd door 15 pi van 0,1 M Na 2 HPO 4 oplossing voor het amelogenin bevattende chitosan oplossing, meng met een vortex gedurende 5 minuten. </li><li> Stel de pH van de CS-AMEL oplossing 6,5 door voorzichtig toevoegen van 1 M NaOH-oplossing. CS-AMEL hydrogel zal vormen wanneer de pH-waarde bereikt 6,5. </li></ol></li></ol> 3. Emaille hergroei in Amelogenine-chitosan Hydrogel <ol><li> Voorbereiding van kunstspeeksel oplossing <ol><li> Los een bepaalde hoeveelheid magnesiumchloride (MgCl2, 0,2 mM), calciumchloride (CaCl2, 1 mM), kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2PO 4, 4 mM), kaliumchloride (KCl, 16 mM) en ammoniumchloride ( NH4Cl, 4,5 mM) in 20 mM HEPES(4 - (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur) buffer 12. </li><li> Breng de pH op 7,0 met 1 M NaOH en bewaar de kunstmatige speeksel oplossing bij 4 ° C. </li><li> Voordat u de oplossing, voeg natriumfluoride (NaF, 300 ppm). </li></ol></li><li> Toepassing van CS-AMEL hydrogel <ol><li> Solliciteer ongeveer 20 ul CS-AMEL hydrogel op de geëtste tand slice met een spuit (Figuur 1B). </li><li> Droog het hydrogel bedekte tanden schijfje in een exsiccator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Breng de tand segment een bekerglas met 30 ml kunstmatig speeksel oplossing. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie, en houd de beker in een oven bij 37 ° C gedurende 7 dagen. </li><li> Verwijder de tand plak en drogen in een exsiccator bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 4. Karakterisering van Interface tussen pas gegroeide Layer en Enamel De microstructuur van de interface tussen de pas gegroeide laag en glazuur was opmerved door scanning elektronenmicroscopie (SEM) en hoge revolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HR-TEM). De TEM monster werd bereid met behulp van een gefocusseerde ionenbundel (FIB), de stappen die zijn als volgt. <ol><li> Plaats het monster in een FIB-SEM instrument en afwerking van alle groeperingen volgens de gebruiksaanwijzing. OPMERKING: Fijn Z aanpassing moet minstens 2 keer worden uitgevoerd. </li><li> Deponeer een koolstoflaag (15 x 3 urn) op het monster om de onderliggende structuur (Figuur 2A) beschermen. </li><li> Molen het monster goed naar de boven-, onder-en rechterkant van koolstof laag op een dun stukje van het monster te bereiden, en snijd de onderkant van deze dunne stuk. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke maalstap (Figuur 2B). </li><li> Las een Pt tip over het dunne stuk en snijd de linker kant naar de proefstuk (Figuur 3C) te scheiden. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voordat het lassen stap. </li><li> Til thij Pt tip met het monster langzaam, en monteer de gelamelleerde monster op een lift-out TEM rooster. </li><li> Maak de tip van het monster, en dun het monster totdat de dikte minder dan 100 nm (Figuur 3D). Verwijder het monster van het instrument naar de TEM observatie uitvoeren. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke dunner proces. </li></ol> Beoordeling van Binding en mechanische eigenschappen van recent Grown Layer 5. <ol><li> De bindingssterkte wordt beoordeeld door ultrasone behandeling. Houd het gerepareerde tand slice in een ultrasone reiniger (42 kHz, 100 W) gedurende 10 minuten, en vervolgens observeren de interface tussen de herstelde laag en natuurlijke glazuur met een teruggekaatste elektron SEM-analyse. </li><li> Meet de hardheid en de elasticiteitsmodulus bij 20 meetpunten op elk gerepareerd glazuuroppervlak (n = 3) door een nano-indenter met een Berkovich tip. </li></ol> 6. Immunofluorescentiekleuring <ol><li> Was de tand slice met Tris buffer zoutoplossing (TBS) gedurende 15 minuten. </li><li> Blok met 1% runderserumalbumine (BSA) in TBS gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder de vloeistof en incubeer het monster O / N met 1 ° Ab (1:500 kip anti-Amelogenine) verdund in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100). </li><li> Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en incubeer O / N met 2 ° Ab (1:100 Anti-kip FITC) verdund in TBS. </li><li> Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en laat het drogen nog 30 minuten. </li><li> Observeren door fluorescentiemicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-+mediated+enamel+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Protein- mediated enamel mineralization.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).</li>
<li>Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Systems+for+Hydroxyapatite+Mineralization+Inspired+By+Bone+and+Enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel.</a> Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).</li>
<li>Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+growth+of+hydroxyapatite+nanocrystals+for+nondestructive+repair+of+early+caries+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth%22%5BJournal%5D)">Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions.</a> J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).</li>
<li>Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA-Assisted+Self-Assembly+of+Fluoride-Substituted+Hydroxyapatite+Coating+on+Enamel+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate.</a> Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Enamel+Repair+via+Glu-Directed+Assembly+of+Apatite+Nanoparticles%3A+an+Approach+to+Biomaterials+with+Optimal+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics.</a> Advanced Materials. 23, (2011).</li>
<li>Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regeneration+of+human+tooth+enamel+under+near-physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions.</a> Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+remineralization+of+enamel+in+the+presence+of+amelogenin+and+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride.</a> Biomaterials. 30, 478-483 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+enamel+by+using+hydroxyapatite+nanoparticles+as+the+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks.</a> J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+synthesis+of+a+human+enamel-like+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure.</a> Advanced Materials. 18, (2006).</li>
<li>Yamagishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+enamel+for+rapid+tooth+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic enamel for rapid tooth repair.</a> Nature. 433, 819-819 (2005).</li>
<li>Bleek, K., Taubert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+polymer-controlled%2C+bioinspired+calcium+phosphate+mineralization+from+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution.</a> Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).</li>
<li>Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+mats+of+PVP%2FACP+nanofibres+for+remineralization+of+enamel+tooth+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces.</a> Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).</li>
<li>Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+amelogenin+and+the+regulation+of+biomineralization+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Amelogenin+Orchestrates+the+Organization+of+Hierarchical+Elongated+Microstructures+of+Apatite%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).</li>
<li>Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+incorporation+inside+of+organic+single+crystals+grown+in+agarose+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels.</a> Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).</li>
<li>Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amelogenin-chitosan+matrix+promotes+assembly+of+an+enamel-like+layer+with+a+dense+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface.</a> Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).</li>
<li>Hu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+cDNA+sequence%2C+and+alternative+splicing+of+porcine+amelogenin+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs.</a> Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).</li>
<li>Bromley, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin+Processing+by+MMP-20+Prevents+Protein+Occlusion+Inside+Calcite+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals.</a> Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+enamel+inspired+nanocomposite+fabrication+through+amelogenin+supramolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly.</a> Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).</li>
<li>Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+etiologies+and+associated+phenotypes+of+amelogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gent.+A%22%5BJournal%5D)">The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta.</a> Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).</li>
<li>Eimar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+enamel+hardness+by+its+crystallographic+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions.</a> Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).</li>
<li>Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin-chitosan+matrix+for+human+enamel+regrowth%3A+effects+of+viscosity+and+supersaturation+degree%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree.</a> Connect Tissue Res. , (2014).</li>
<li>Pouget, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initial+Stages+of+Template-Controlled+CaCO3+Formation+Revealed+by+Cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM.</a> Science. 323, 1455-1458 (2009).</li>
<li>Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Prenucleation+Calcium+Carbonate+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters.</a> Science. 322, 1819-1822 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel het mineraalgehalte van glazuur hoog waardoor het de moeilijkste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam, dit biokeramische gevoelig voor demineralisatie processen die vaak als cariës en erosie. Gen mutaties kunnen ook leiden dun of zacht email leiden tot een reeks van erfelijke ziekten emaille misvorming genoemd amelogenesis imperfecta 20. Orale gezondheidszorg producten met fluoride of CPP-ACP hebben op de markt voor meerdere jaren (dat wil zeggen, vernissen, tandpasta&#39...

Tandglazuur is het harde gemineraliseerde oppervlak van menselijke tanden. Het bestaat uit talrijke naaldachtige apatietkristallen, die zijn gebundeld in georganiseerde, parallelle prisma's om de unieke mechanische sterkte en biologische bescherming die glazuur biedt te garanderen1-2. In tegenstelling tot andere gemineraliseerde weefsels, zoals bot en dentine, is volwassen glazuur acellulair en kan het zichzelf niet regenereren na aanzienlijk mineraalverlies1-2, wat vaak optreedt als cariës of erosie. Commercieel verkrijgbare producten zoals fluoridebevattende vernis, tandpasta's en mondwater zijn effectief in het remineraliseren van glazuur, maar geen van hen heeft het potentieel om de vorming van georganiseerde apatietkristallen te bevorderen. Klinisch gezien omvat de conventionele behandeling voor glazuurreparatie een vulprocedure met kunstmatige materialen zoals amalgaam, keramiek of composiethars 3. Deze materialen sluiten echter meestal niet goed aan op het natuurlijke weefsel rond de laesie, omdat hun structuren, componenten en eigenschappen verschillen van het natuurlijke glazuur. Als gevolg hiervan ontwikkelt zich vaak na verloop van tijd secundaire cariës op de grens tussen de tand en vreemde materialen. Daarom is in situ hergroei van glazuur met een dichte interface een aantrekkelijk doelwit voor de vakgebieden materiaalwetenschap en stomatologie. Een bijzonder veelbelovende manier om dit doel te bereiken is de biomimetische synthese van glazuur-achtig materiaal op het glazuuroppervlak. Onlangs zijn er talrijke in vitro pogingen gedaan om glazuurachtige materialen te bereiden met behulp van biomimetische systemen die nano-apatieten of verschillende organische additieven bevatten 4-12. Het ontwikkelen van de optimale biomimetische strategie om remineralisatiekristallen te bevorderen om een perfect dichte interface te bereiken, is echter nog steeds een uitdaging.
Tijdens de glazuurmineralisatie wordt de georiënteerde groei en verlenging van apatietkristallen gereguleerd door een amelogeninerijke matrix 1,13-14. Om de organische matrix in zich ontwikkelend glazuur na te bootsen, beschrijven we hier een gedetailleerd protocol voor het fabriceren van een amelogenine-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor in situ glazuurhergroei op een zuurgeëtst glazuuroppervlak dat als model wordt gebruikt voor erosieve laesies. Als "het meest veelzijdige groeimedium" voor kristallen 15 hebben hydrogelmatrices een voordeel boven een oplossingssysteem, aangezien ze klinisch gemakkelijker te hanteren zijn. Bovendien is CS-AMEL biocompatibel, biologisch afbreekbaar en heeft het unieke antimicrobiële en hechteigenschappen die gunstig vergelijkbaar zijn met andere biomimetische systemen voor tandheelkundige toepassingen 16. Belangrijk is dat de in situ mineralisatie van apatietkristallen op het glazuuroppervlak een dichte interface biedt tussen de gerepareerde laag en het natuurlijke glazuur, wat mogelijk de duurzaamheid van restauraties kan verbeteren en de vorming van nieuwe cariës aan de rand van de restauratie kan voorkomen.

<table><tbody><tr><td>Human third molar&nbsp;</td><td>Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California&nbsp;</td><td>N/A</td><td>De menselijke kiezen werden geëxtraheerd volgens de standaardprocedures voor extractie aan de Ostrow School of Dentistry van de University of Southern California en werden behandeld met goedkeuring van de Institutional Review Board.</td></tr><tr><td>Recombinant pocine amelogenin</td><td>Expressie en zuivering&nbsp; in lab</td><td>N/A</td><td>rP172, full-length&nbsp;</td></tr><tr><td>Chitosan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>Gemiddeld moleculair gewicht, 75-85% gedeacetyleerd</td></tr><tr><td>Fosforzuur&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA033266</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>VWR</td><td>A036289</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>VWR</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisch natriumfosfaat watervrij</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RP&nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>230255</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>VWR</td><td>BDH8001</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>VWR</td><td>AAAL06374</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>VWR</td><td>BDH1103</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0244</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9268</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAAA15000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaan-sulfonzuur)</td><td>VWR</td><td>AAA14777</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA11561</td><td></td></tr><tr><td>Tris-gebufferde zoutoplossing</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>10&times; TBS</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>12659</td><td>CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Anti-Amelogenin</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Een geschenk van Prof. Malcolm Snead, University of Southern California</td></tr><tr><td>Rund Anti-Chicken IgY-FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2700</td><td></td></tr><tr><td>Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie Systeem</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Varian Prostar 210</td><td></td></tr><tr><td>C4 kolom</td><td>Phenomenx&nbsp;</td><td>Jupiter 5&mu; 300A</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Elektronen Microscopie&nbsp;</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>JSM-7001</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM&nbsp;</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>JIB-4500</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie Elektronen Microscopie&nbsp;</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>Digitale lage snelheid diamantzaag</td><td>MTI Corporation</td><td>SYJ-150</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microscopie</td><td>Leica</td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon gereinigde&nbsp;</td><td>Branson&nbsp;</td><td>2510</td><td>42 kHz, 100 W</td></tr><tr><td>Nano-indenter&nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>MTS XP</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van amelogenine-chitosan hydrogel voor<em&gt; in vitro</em&gt; emaille hergroei met een dichte interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetische glazuurreconstructie is een belangrijk onderwerp in de materiaalkunde en tandheelkunde als een nieuwe aanpak voor de behandeling van tandbederf of erosie. Amelogenine is bewezen als een kritiek eiwit voor het controleren van de georganiseerde groei van apatietkristallen. In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor oppervlakkige glazuurreconstructie door het gebruik van een nieuwe amelogenine-chitosan hydrogel. In vergelijking met andere conventionele behandelingen, zoals topische fluoride en mondwater, heeft deze methode niet alleen het potentieel om de ontwikkeling van tandbederf te voorkomen, maar bevordert ook significante en duurzame glazuurrestauratie. De georganiseerde glazuurachtige microstructuur gereguleerd door amelogenine-assemblages kan de mechanische eigenschappen van geëtst glazuur aanzienlijk verbeteren, terwijl de dichte glazuurrestauratie-interface gevormd door een in situ hergroei van apatietkristallen de effectiviteit en duurzaamheid van restauraties kan verbeteren. Verder is chitosan-hydrogel gemakkelijk te gebruiken en kan bacteriële infectie onderdrukken, wat de belangrijkste risicofactor is voor het optreden van tandbederf. Daarom toont deze biocompatibele en biologisch afbreekbare amelogenine-chitosan hydrogel belofte als een biomateriaal voor de preventie, restauratie en behandeling van defect glazuur.

De doeltreffendheid van de hier beschreven protocol wordt aangetoond door scanning elektronenmicroscopie (SEM), opgegeven elektronendiffractie (SAED) en röntgendiffractie (XRD) analyse. Na reparatie door amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor 7 dagen, werd een emaille-achtige laag met een dikte van 15 micrometer gevormd op het geëtste glazuur oppervlak. De nieuw gekweekt laag werd gemaakt van sterk geordende arrays van kristallen met een diameter van ~ 50 nm, bij voorkeur groeien langs de c-as loodrecht op het oppe...

In dit artikel beschrijven we een protocol voor het vervaardigen van een amelogenin-chitosan hydrogel voor oppervlakkige glazuur wederopbouw. Georganiseerd in situ groei van apatiet kristallen in de hydrogel gevormd een dicht email restauratie-interface, die de doeltreffendheid en duurzaamheid van restauraties verbeteren.

Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Emaille Hergroei met een dichte Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een protocol voor het vervaardigen van een AMLO- en chitosan-hydrogel voor oppervlakkige glazuurreconstructie. Dit wordt bereikt door eerst geëtste tandsnijplaten voor te bereiden. In de tweede stap wordt verse AMLO- en kitan-hydrogel bereid.Vervolgens wordt de AMLO- en kitan-hydrogel op het oppervlak van de tanddoorsnede aangebracht. Tot slot wordt het tandglazuur opnieuw aangegroeid met de AMLO-chizen-hydrogel in kunstmatig speeksel. Ten slotte kunnen ultrasone behandeling en een nano-indentatie worden gebruikt om de mechanische sterkte van de nieuw gevormde laag en de binding ervan aan het natuurlijke glazuur te beoordelen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van een technologie die, wanneer toegepast op aangetast tandglazuur bij zowel volwassenen als kinderen, vroege cariëslaesies stopt, verloren gegane glazuur door cariës herstelt, de tandstructuur behoudt en de progressie van tandbederf voorkomt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Chittar, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het selecteren van een menselijke derde molaar zonder gerestaureerde c

development-amelogenin-chitosan-hydrogel-for-vitro-enamel-regrowth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Begrip glazuur vorming en mogelijk wijzigingen vereist de studie van ameloblast activiteit. Hier beschrijven we een betrouwbare en consistente methode voor micro-ontleden glazuur organen met secretie - en rijping-fase-ameloblasts die kunnen worden gebruikt voor verdere kwantitatieve en kwalitatieve experimentele procedures.

Micro-dissectie van glazuur orgel van snijtand van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.

Voortplanting van tandheelkundige en respiratoire cellen en organen in microzwaartekracht

We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.

Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Deze studie presenteert een benchtop-model dat is ontworpen om de compatibiliteit van wondverbandmaterialen met wondtherapiesystemen met negatieve druk te evalueren door de druk en vochtopvang gedurende 72 uur te beoordelen onder continue en intermitterende drukinstellingen.

Ontwikkeling van een benchtop-model voor het evalueren van de compatibiliteit van wondverbandmaterialen met wondtherapiesystemen met negatieve druk

Hier presenteren we een geïntegreerd protocol voor het genereren van gecontroleerde osteochondrale laesies in schapenknieën om een experimenteel model op te zetten dat geschikt is voor studies naar bot- en kraakbeenweefselregeneratie. Het protocol beschrijft een methode om een osteochondrale defect van volledige dikte in de femorale condyl te induceren, met technieken die de impact op het dierenwelzijn en variabiliteit in resultaten minimaliseren.

Opstel en evaluatie van een schapenmodel van een volledig dikte osteochondrale defect

Leer een protocol voor oppervlakkige glazuurherstel met amelogenine-chitosan hydrogel. Deze methode bevordert in situ apatietkristalgroei voor een dichte interface en verbeterde mechanische sterkte van tandheelkundige restauraties.

Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor

Meer video's verkennen