Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een protocol voor het vervaardigen van een AMLO- en chitosan-hydrogel voor oppervlakkige glazuurreconstructie. Dit wordt bereikt door eerst geëtste tandsnijplaten voor te bereiden. In de tweede stap wordt verse AMLO- en kitan-hydrogel bereid.

Vervolgens wordt de AMLO- en kitan-hydrogel op het oppervlak van de tanddoorsnede aangebracht. Tot slot wordt het tandglazuur opnieuw aangegroeid met de AMLO-chizen-hydrogel in kunstmatig speeksel. Ten slotte kunnen ultrasone behandeling en een nano-indentatie worden gebruikt om de mechanische sterkte van de nieuw gevormde laag en de binding ervan aan het natuurlijke glazuur te beoordelen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van een technologie die, wanneer toegepast op aangetast tandglazuur bij zowel volwassenen als kinderen, vroege cariëslaesies stopt, verloren gegane glazuur door cariës herstelt, de tandstructuur behoudt en de progressie van tandbederf voorkomt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Chittar, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het selecteren van een menselijke derde molaar zonder gerestaureerde cariës.

Gebruik een watergekoelde diamantzaag met lage snelheid om de kroon in de lengterichting in plakjes van twee millimeter dik te snijden, en verwijder vervolgens het wortelgedeelte van de molaar ultrasoon. Reinig de plakjes gedurende twee minuten en spoel ze daarna drie keer af met geïoniseerd water om erosieve laesies te simuleren. Ets de twee plakjes gedurende 30 seconden met 30% fosforzuur.

Spoel ze vervolgens onmiddellijk af met het geïoniseerde water. Reinig de geëtste plakjes daarna opnieuw gedurende twee minuten ultrasoon en spoel ze af met het geïoniseerde water.

Nog drie keer. Om de Kazan-stamoplossing te bereiden: los eerst 1% gewicht per volume Kazan op in een 1% volume per volume azijnzuuroplossing, gevolgd door roeren bij 80 °C gedurende de nacht.

Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt het esan gefiltreerd door een 0,45 micrometer filter, waarna één molair natriumhydroxide wordt toegevoegd om de pH op 5,0 in te stellen. Voor de bereiding van de calcium- en fosfaatstamoplossing wordt calciumchloride afgewogen en een 0,1 molaire oplossing gemengd. Vervolgens wordt de oplossing gevortexd tot deze helder is en wordt de pH-waarde met één molair natriumhydroxide bijgesteld naar 11.

Weeg vervolgens het diba natriumfosfaat af. Meng een 0,1 molaire oplossing en vortex deze totdat de oplossing helder is. Om de AMLO Genin kaizan-hydrogel te bereiden, voegt u 960 µL van de vers bereide 1%esan-oplossing toe aan een buisje met 200 µg recombinant porcijen AMLO genin.

Vortex vervolgens de oplossing tot deze helder is. Voeg nu 25 µL van een 0,1 M calciumchloride-oplossing toe aan de AMLO-oplossing met ozan, gevolgd door 15 µL van een 0,1 M natriumfosfaat-diba-oplossing. Vortex de oplossing gedurende vijf minuten.

Voeg vervolgens voorzichtig één molair natriumhydroxide toe om de pH van de AMLO- en ozan-oplossing aan te passen naar 6,5. Wanneer de pH-waarde 6,5 bereikt, vormt zich een AMLO- en ozan-hydrogel om de hergroei van het glazuur in de AMLO- en az-hydrogel te initiëren. Pas eerst de pH van de kunstspeekseloplossing aan naar 7,0 met één molair natriumhydroxide en bewaar de oplossing bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een spuit om ongeveer 20 µL AMLO- en chizen-hydrogel aan te brengen op de rand van de tandplak en plaats deze in een desiccator bij kamertemperatuur.

Voeg na twee uur 300 PPM natriumfluoride toe aan de speekseloplossing en breng de tandplak vervolgens over naar een bekerglas met 30 milliliters van de oplossing. Dek het bekerglas af met aluminiumfolie en plaats het bekerglas vervolgens in een oven bij 37 °C. Verwijder tot slot de tandplak na drie tot zeven dagen en plaats deze in een desiccator bij kamertemperatuur tot deze droog is; na herstel door AMLO en chizen hydrogel gedurende zeven dagen vormt zich een glazuurachtige laag met een dikte van 15 µm op het geëtste glazuuroppervlak.

De nieuw gegroeide laag bestaat uit zeer geordende kristalstructuren met een diameter van ongeveer 50 nanometer die bij voorkeur groeien langs de c-as loodrecht op het oppervlak. Merk op dat deze naaldvormige kristallen zijn georganiseerd in bundels die lijken op de basiseenheden van natuurlijk glazuur. De afbeelding van de geselecteerde gebiedelektronendiffractie van de gerepareerde laag vertoont een boogvormig patroon dat een hiërarchische uitlijning van de nieuw gegroeide kristallen onthult.

Langs de 0 0 2 richting bevestigt röntgendiffractieanalyse dat de nieuw gegroeide laag is samengesteld uit apatiet, die zijn uitgelijnd langs de kristallografische C-as in overeenstemming met de waarnemingen via scanning-elektronenmicroscopie en geselecteerde gebied-elektrondiffractie. In deze afbeelding wordt de microstructuur van de interface tussen de nieuw gegroeide laag en het natuurlijke glazuur getoond. Let op dat de nieuw gegroeide kristallen niet in dezelfde richting zijn gegroeid als de oorspronkelijke glazuurkristallieten, en dat de eiwit-gemedieerde apatietgroei resulteert in een loodrechte oriëntatie van de nieuw gegroeide kristallen ten opzichte van de natuurlijke glazuurkristallen. Er is geen zichtbare opening bij de interface tussen de nieuw gegroeide laag en het glazuursubstraat.

Op nanoschaal versmolten het glazuur en de hergegroeide kristallen tot een naadloze interface. Na 10 minuten ultrasone behandeling is de nieuw gegroeide laag in de AMLO Genin chito-hydrogel nog steeds stevig gebonden aan het glazuuroppervlak, en blijft de georganiseerde structuur behouden voor het monster dat behandeld is met tizen-hydrogel zonder am mologen. Er is echter een grote opening tussen het glazuur en de herstellaag waargenomen, waardoor de nieuw gegroeide laag duidelijk te onderscheiden is van het natuurlijke glazuur.

In dit experiment werd de AMLO-genine in de nieuw gegroeide laag immunofluorescent gelabeld; de aanwezigheid van AMLO-genine werd vervolgens bevestigd door de groene fluorescentie binnen de nieuw gegroeide laag. Zoals in de grafiek te zien is, nemen de hardheid en de modulus van het glazuuroppervlak na zuuretsen met respectievelijk bijna 98% en 88% af. De controlegroep, behandeld met ozan-hydrogel zonder AMLO-genine, vertoont slechts een beperkte verbetering van zowel de hardheid als de modulus.

Daarentegen wordt na mineralisatie in de AMLO- en ozan-hydrogel een toename van bijna vier keer in de modulus en negen keer in de hardheid waargenomen na de ontwikkeling ervan. In VI en verdere evaluatie in modellen kan dit protocol worden uitgebreid om een technologie te ontwerpen voor de behandeling van glazuurdefecten, zoals vroege cariës en erosie van het glazuur.